菌落总数与大肠菌群数测定培训课件.ppt

1、菌落总数与大肠菌群数测定菌落总数与大肠菌群数测定主要内容菌落总数测定大肠菌群测定MPN法原理（拓展内容）菌落总数测定掌握菌落总数测定方法实验原理 不同稀释度的样品，营养琼脂培养基，36，48h（水产品30，72h），菌落数菌落总数测定器材与试剂 样品，无菌生理盐水，平板计数琼脂培养基，1ml吸管，培养皿菌落总数测定倾注培养培养结果菌落总数测定实验步骤 5.菌落计数 肉眼观察，可用放大镜，可标记 必要时分区计数，菌落成片者作废计算方法 某稀释度的菌落数两平板菌落数取平均值 选择菌落数在30300之间的稀释度 （1）仅有一个稀释度在此范围 菌落数稀释倍数菌落总数测定计算方法 （2）有两个稀释度在3

2、0300之间 菌落数之比2，选较小值 菌落数之比300 取稀释倍数最大者 （4）所有稀释度均30 取稀释倍数最小者 （5）没有任何稀释度在30300之间 选最接近该范围者结果单位CFU/ml（g）菌落总数测定注意事项 1.无菌操作 2.标记 3.何时更换吸管 4.吸吹混匀 5.琼脂培养基保温 6.安全常识大肠菌群数测定实验目的实验原理 36，48h，产气（小倒管）三步法初发酵、复发酵器材与试剂 样品、无菌生理盐水、LST肉汤，BGLB肉汤 1ml吸管、10ml吸管、试管、小倒管初发酵器材与试剂样品、225ml无菌生理盐水、9ml无菌生理盐水、双料LST肉汤，单料LST肉汤，10ml吸管、1ml

3、吸管、吸球大肠菌群数测定实验步骤 1.初发酵 菌落总数与大肠菌群数测定5.菌落数稀释倍数（2）接种至10mlBGLB肉汤中4.（4）所有稀释度均300取稀释倍数最小者每次划线应该压到上一个区域的23条线（1）仅有一个稀释度在此范围x:细菌浓度，k:进入发酵管的细菌数初发酵结果（4只发酵管）、酒精灯、接种环、伊红美兰平板培养基三步法初发酵、复发酵结晶紫、卢戈碘液、95%乙醇、酸性复红、生理盐水、酒精灯、载玻片、滤纸涂片接种环，挑取菌落，2.脱色95%乙醇，30s或至无色为止吸取样品方法加注样品初发酵结果右边为阳性结果，小倒管内有气体产生。实验步骤 3.复发酵 （1）选取产气试管 （2）接种至10

4、mlBGLB肉汤中 （3）培养36，48h （4）观察指标若产气则报告大肠菌群阳性。大肠菌群数测定实验步骤 2.分离培养 （1）制备伊红美蓝平板 45，无菌，倾注，15ml （2）选产酸产气的发酵管 （3）接种至伊红美蓝平板 分区划线法 （4）培养 36，48h分离培养器材与试剂 初发酵结果（4只发酵管）、酒精灯、接种环、伊红美兰平板培养基分区划线法第一区划线第一区划线灭菌接种环灭菌接种环第二区划线第二区划线灭菌接种环灭菌接种环第三区划线第三区划线灭菌接种环灭菌接种环分区划线法操作要点 1.划下一个区前必须灭菌接种环 2.划线时接种环同平板呈3040角 3.每次划线应该压到上一个区域的23条线

5、 4.用接种环的“面”而不是“弧”在平板上滑动大肠菌群数测定实验步骤 2.分离培养 （5）菌落特征 深紫黑色、有金属光泽 紫黑色、无或略有金属光泽 淡紫红色、中心颜色深 （6）革兰染色、镜检选特征菌落革兰染色法器材与试剂 结晶紫、卢戈碘液、95%乙醇、酸性复红、生理盐水、酒精灯、载玻片、滤纸革兰染色法涂片接种环，挑取菌落，生理盐水一滴，涂匀热固定通过火焰若干次初染结晶紫一滴，1min，水洗媒染卢戈碘液一滴，1min，水洗脱色95%乙醇，30s或至无色为止复染复红一滴，30s涂片脱色95%乙醇，30s或至无色为止（3）培养37，24h目的对某种细菌进行选择性计数细菌进入发酵管的概率近似服从泊松分

6、布:P(x=k)=ex xk/k!目的对某种细菌进行选择性计数（3）培养37，24h划下一个区前必须灭菌接种环MPN法（Most Probable Number Method）划下一个区前必须灭菌接种环淡紫红色、中心颜色深（1）选取鉴定为无芽孢G杆菌的菌落13个初发酵结果（4只发酵管）、酒精灯、接种环、伊红美兰平板培养基取稀释倍数最小者涂片接种环，挑取菌落，菌落总数与大肠菌群数测定（1）选取产气试管培养24小时后的伊红美兰平板、酒精灯、接种环、复发酵管x:细菌浓度，k:进入发酵管的细菌数x:细菌浓度，k:进入发酵管的细菌数4.分区划线法热固定初染媒染脱色复染革兰氏染色阴性革兰氏染色阳性革兰染色

7、法复发酵器材与试剂 培养24小时后的伊红美兰平板、酒精灯、接种环、复发酵管大肠菌群数测定实验步骤 3.复发酵 （1）选取鉴定为无芽孢G杆菌的菌落13个 （2）接种至10ml乳糖蛋白胨培养液 （3）培养37，24h （4）观察指标产酸，产气液体接种复发酵复发酵阳性结果，培养基变成黄色，小倒管内有气体产生大肠菌群数测定注意事项 1.无菌操作 2.吸管使用 3.洗去染液的方法 4.显微镜保养 5.液体接种x:细菌浓度，k:进入发酵管的细菌数（3）所有稀释度均300（5）菌落特征（1）选取鉴定为无芽孢G杆菌的菌落13个划下一个区前必须灭菌接种环（1）选取鉴定为无芽孢G杆菌的菌落13个肉眼观察，可用放大

8、镜，可标记取稀释倍数最小者（5）菌落特征分区划线法细菌进入发酵管的概率近似服从泊松分布:P(x=k)=ex xk/k!（2）接种至10ml乳糖蛋白胨培养液菌落总数与大肠菌群数测定（2）接种至10mlBGLB肉汤中（3）培养36，48h右边为阳性结果，小倒管内有气体产生。（2）接种至10ml乳糖蛋白胨培养液涂片接种环，挑取菌落，MPN法原理MPN法（Most Probable Number Method）目的对某种细菌进行选择性计数核心思想泊松分布实施方法多次稀释直至无菌，每个稀释度分别接种若干培养管，根据阳性管数估算MPN值MPN法原理MPN法（Most Probable Number Method）1.细菌进入发酵管的概率近似服从泊松分布:P(x=k)=ex xk/k!x:细菌浓度，k:进入发酵管的细菌数2.若在n管发酵中，令接种水样量为Vi，阳性管数为Pi，阴性管数为Qi，则该检验结果发生的概率为 其中C为常系数 V为总水样量，x为细菌个数/1()(1)()iinV x VV x VPiQiiy xCee1()!/(!)niCPiQiPi Qi