常见微生物培养检测技术课件.ppt

1、 用人工方法用人工方法,将细菌从自然界、动物体或将细菌从自然界、动物体或病料中分离出来病料中分离出来,研究细菌的形态、生理特性、研究细菌的形态、生理特性、生物学特性或制取细菌的某种代谢产物等生物学特性或制取细菌的某种代谢产物等,这这对于传染病的诊断和防治具有重要意义。对于传染病的诊断和防治具有重要意义。根据不同标本及不同培养目的根据不同标本及不同培养目的,可选用不可选用不同的接种和培养方法。常用的有分离培养和同的接种和培养方法。常用的有分离培养和纯培养两种方法。纯培养两种方法。F培养基的概念：培养基的概念：将细菌所需的各种营将细菌所需的各种营养物质按一定比例混养物质按一定比例混合在一起合在一起

2、,并调节到并调节到适宜的适宜的PH,PH,这种人工这种人工配制的适合细菌生长配制的适合细菌生长繁殖的细菌营养物繁殖的细菌营养物,称为培养基。称为培养基。F培养基配制原则：培养基配制原则：培养基组分应适合培养基组分应适合细菌的营养特点细菌的营养特点营养营养协调营养营养协调理化条件适宜理化条件适宜经济节约经济节约无菌无菌按培养基的组成成分分类按培养基的组成成分分类合成培养基、天然培养基合成培养基、天然培养基按培养基的物理状态分类按培养基的物理状态分类液体培养基、半固体培养基、固体培养基液体培养基、半固体培养基、固体培养基按培养基的功能分类按培养基的功能分类基础培养基、营养培养基、鉴别培养基、选择培

3、基础培养基、营养培养基、鉴别培养基、选择培养基、厌氧培养基。养基、厌氧培养基。含有培养一般细菌的最基本成含有培养一般细菌的最基本成分。又分为分。又分为:液体培养基、固体液体培养基、固体培养基和半固体培养基三种。在培养基和半固体培养基三种。在液体液体(肉汤肉汤)培养基中培养基中,加入加入2%-3%2%-3%琼脂即为固体培养基琼脂即为固体培养基,加入加入0.2%-0.2%-0.5%0.5%琼脂即为半固体培养基。琼脂即为半固体培养基。于基础培养基中加入高营养物质如葡萄糖、于基础培养基中加入高营养物质如葡萄糖、血液、血清、腹水、生长因子等血液、血清、腹水、生长因子等,以满足营养以满足营养要求较高的细菌

4、生长需要要求较高的细菌生长需要有的细菌还需加入特殊物质有的细菌还需加入特殊物质,如结核杆菌需如结核杆菌需加入鸡蛋清、马铃薯、甘油等才能良好生长加入鸡蛋清、马铃薯、甘油等才能良好生长利用细菌对某种物质敏感程度的不同利用细菌对某种物质敏感程度的不同,可在培可在培养基中加入抑制某些细菌生长的药物养基中加入抑制某些细菌生长的药物,而选择性而选择性地让欲分离的细菌旺盛生长的培养基地让欲分离的细菌旺盛生长的培养基,如胆盐和如胆盐和蔷薇色酸可以选择性地抑制蔷薇色酸可以选择性地抑制G G+菌的生长菌的生长,而不影而不影响响G G菌的生长。菌的生长。在培养基中加入二药后可选择性地分离出肠在培养基中加入二药后可选

5、择性地分离出肠道杆菌。道杆菌。利用细菌分解底物及其代谢产物的不同利用细菌分解底物及其代谢产物的不同,可可在培养基中加入某种物质和指示剂在培养基中加入某种物质和指示剂,即制为鉴即制为鉴别培养基别培养基,以测定不同细菌的生化反应。以测定不同细菌的生化反应。紫黑色,具有金属光泽的菌落麦康凯平板：红色菌落将培养基与空气及氧隔离将培养基与空气及氧隔离,或降低培养基中或降低培养基中的氧化还原电势的氧化还原电势,供厌氧菌生长。供厌氧菌生长。降低培养基中氧化还原电势：降低培养基中氧化还原电势：如肝汤或加如肝汤或加入谷胱甘肽、硫基醋酸盐等。入谷胱甘肽、硫基醋酸盐等。化合去氧法：如焦性没石子酸、好氧厌氧化合去氧法

6、：如焦性没石子酸、好氧厌氧菌混合、种子发芽等。菌混合、种子发芽等。隔绝阻氧法：如液体石腊等。隔绝阻氧法：如液体石腊等。有关概念有关概念菌落菌落:在固体培养基上在固体培养基上,由单个细胞繁殖形成由单个细胞繁殖形成的肉眼可见的细菌集落的肉眼可见的细菌集落,称为菌落。称为菌落。菌苔菌苔:在固体培养基上在固体培养基上,大量菌落密集生长大量菌落密集生长,融融合成一片合成一片,称为菌苔。称为菌苔。纯培养纯培养:挑取一个菌落到另一培养基桑培养挑取一个菌落到另一培养基桑培养,称为纯培养。称为纯培养。不同的微生物种类不同的微生物种类,其菌落特征不同。同一种其菌落特征不同。同一种菌在不同培养条件下菌落特征也不尽相

7、同菌在不同培养条件下菌落特征也不尽相同,细细菌的生长特征有助于细菌的鉴定。菌的生长特征有助于细菌的鉴定。革兰阳性菌G(Gram positive bacteria)革兰阴性菌G(Gram negative bacteria)涂片结晶紫 染色碘液媒染酒精脱色复红复染标本标本直接涂直接涂片检查片检查分离分离培养培养分子生物学分子生物学技术技术(核酸核酸杂交、杂交、PCRPCR)生化生化试验试验血清学血清学试验试验动物动物试验试验药敏药敏试验试验其它其它(HPLC)(HPLC)同一细菌对不同同一细菌对不同抗生素的敏感性抗生素的敏感性不同细菌对相同不同细菌对相同抗生素的敏感性抗生素的敏感性 病毒(Vi

8、rus)：是形体微小、结构简单、仅含有一种核酸（DNA或RNA），能够通过细菌滤器,具有超级寄生性（严格的细胞内寄生），且必须在电子显微镜下才能观察到的一类非细胞形微生物。1892年，伊万诺夫斯基和贝杰林克，烟草花叶病毒，开创了病毒学独立发展的历程。没有细胞结构没有细胞结构 可以透过细菌滤器可以透过细菌滤器 只含一种核酸（只含一种核酸（DNADNA或或RNARNA）严格细胞内寄生严格细胞内寄生 增殖方式为核酸复制增殖方式为核酸复制 对干扰素敏感，对抗生素不敏感对干扰素敏感，对抗生素不敏感（一）病毒的感染（一）病毒的感染病毒与细胞相互作用称为病毒的感染。病毒与细胞相互作用称为病毒的感染。1.1.

9、溶解性相互作用：病毒增殖溶解性相互作用：病毒增殖,宿主细胞被破坏宿主细胞被破坏或溶解或溶解,也可不破坏细胞也可不破坏细胞,形成稳定状态感染。形成稳定状态感染。2.2.转化性相互作用：病毒基因组与宿主细胞基转化性相互作用：病毒基因组与宿主细胞基因组整合因组整合,引起宿主细胞发生转化。有些非但抑引起宿主细胞发生转化。有些非但抑制宿主细胞的生物合成制宿主细胞的生物合成,反而促进细胞分裂增生反而促进细胞分裂增生,导致肿瘤或细胞癌变。导致肿瘤或细胞癌变。（二）病毒的增殖二）病毒的增殖 病毒自身无完整的酶系统病毒自身无完整的酶系统,不能进行独立的不能进行独立的物质代谢物质代谢,必须在活的宿主细胞内才能进行

10、生活、必须在活的宿主细胞内才能进行生活、复制和增殖复制和增殖由宿主细胞供应原料、能量和生物合成场所由宿主细胞供应原料、能量和生物合成场所,在病毒核酸遗传密码的控制下在病毒核酸遗传密码的控制下,于宿主细胞内复于宿主细胞内复制出病毒的核酸和合成病毒的蛋白质制出病毒的核酸和合成病毒的蛋白质,进一步装进一步装配成大量的子代病毒配成大量的子代病毒,并将他们释放到细胞外并将他们释放到细胞外,这种增殖方式称为复制这种增殖方式称为复制 病毒的复制周期病毒的复制周期 （ReplicativeReplicative Circle Circle）定义：自病毒吸附于细胞开始，到子代病毒定义：自病毒吸附于细胞开始，到子

11、代病毒从感染细胞释放到细胞外的病毒复制过程称从感染细胞释放到细胞外的病毒复制过程称为病毒的复制周期。为病毒的复制周期。病毒的复制增殖过程病毒的复制增殖过程,大致包括吸附、穿入、大致包括吸附、穿入、脱壳、生物合成、装配和释放六个步骤。脱壳、生物合成、装配和释放六个步骤。Replication of virulent phageLysogenicLysogenic infection infectionl需要病毒表面特异性的吸附蛋白(VAP)与细胞表面受体(也称为病毒受体)相互作用,是决定感染成功与否的关键环节。l细胞膜受体有脂蛋白受体和粘蛋白受体两种,除具有病毒吸附部位外,尚有促进病毒感染的作用

12、。l病毒的细胞受体具有种系和组织特异性病毒的细胞受体具有种系和组织特异性,决定决定了病毒的宿主谱。了病毒的宿主谱。l病毒吸附于细胞膜后,细胞膜受体和邻近部位的膜发生折叠,将病毒吞陷,吞饮于泡内(牛痘病毒);或通过病毒与宿主细胞膜的融合进入细胞浆中(疱疹病毒);无包膜病毒则直接穿过细胞膜而入细胞(呼肠孤病毒);直接进入(裸露病毒)膜融合(包膜病毒)胞饮(包膜病毒)病毒衣壳的脱病毒衣壳的脱落和核酸的逸落和核酸的逸出出,主要在细胞主要在细胞浆浆(RNA(RNA病毒病毒)或或细胞核细胞核(DNA(DNA病病毒毒)内完成。内完成。病毒进入宿主细胞后生物合成阶段病毒进入宿主细胞后生物合成阶段,胞浆中无病胞

13、浆中无病毒颗粒毒颗粒,称为隐蔽期称为隐蔽期(eclipse)(eclipse)。病毒的生物合成过程分早期和晚期两个阶段：病毒的生物合成过程分早期和晚期两个阶段：1.1.早期早期:主要是由核酸主要是由核酸(DNA(DNA或或RNA)RNA)通过通过mRNAmRNA制造酶类蛋制造酶类蛋白质代谢工具和核酸基因组需要的核苷酸原料；白质代谢工具和核酸基因组需要的核苷酸原料；2.2.晚期晚期:主要是通过晚期主要是通过晚期mRNAmRNA合成病毒结构蛋白质。合成病毒结构蛋白质。有的病毒聚积在细胞空有的病毒聚积在细胞空泡内后通过细胞通道向泡内后通过细胞通道向外溢出外溢出;有的依靠细胞膨有的依靠细胞膨胀破裂放出

14、胀破裂放出;有的则因细有的则因细胞感染病毒后死亡裂解胞感染病毒后死亡裂解或自溶而释出。有囊膜或自溶而释出。有囊膜的病毒多数借出芽而穿的病毒多数借出芽而穿出细胞游离。出细胞游离。动物选择标准动物选择标准:对病毒的易感性高对病毒的易感性高;动物健康动物健康,体重、年龄尽可能一致体重、年龄尽可能一致,最好使用相应的等级最好使用相应的等级实验动物实验动物,并符合所要培养病毒的要求并符合所要培养病毒的要求;尽量使尽量使用遗传特性相似用遗传特性相似,个体差异较小个体差异较小,生物学反应比生物学反应比较一致的动物较一致的动物;外购动物外购动物,接种前要经过健康观接种前要经过健康观察察,以免误用带有病原体动物

15、。以免误用带有病原体动物。可根据病毒性质、材料性质和目的不同可根据病毒性质、材料性质和目的不同,采取采取皮下接种法、皮内接种、肌肉接种、静脉接种、皮下接种法、皮内接种、肌肉接种、静脉接种、腹腔接种法、脑内接种法。腹腔接种法、脑内接种法。理想的禽胚为理想的禽胚为SPFSPF鸡胚。常用非免疫鸡胚加以鸡胚。常用非免疫鸡胚加以补充补充,这种蛋应无特定病原的母源抗体这种蛋应无特定病原的母源抗体,否则会否则会影响病毒在胚内增殖。此外影响病毒在胚内增殖。此外,不同病原对禽胚的不同病原对禽胚的适应性也不同适应性也不同,如狂犬病和减蛋综合征病毒在鸭如狂犬病和减蛋综合征病毒在鸭胚中比鸡胚中更易增殖胚中比鸡胚中更易

16、增殖,鸡传染性喉气管炎病毒鸡传染性喉气管炎病毒只能在鸡和火鸡胚内增殖只能在鸡和火鸡胚内增殖,实际应用时而加以严实际应用时而加以严格选择。格选择。常用的接种途径有绒毛尿囊膜法、尿囊腔法、常用的接种途径有绒毛尿囊膜法、尿囊腔法、羊膜腔法和卵黄囊法四种羊膜腔法和卵黄囊法四种,根据不同的病毒和不根据不同的病毒和不同的目的采用适宜的接种途径。同的目的采用适宜的接种途径。绒毛尿囊膜接种绒毛尿囊膜接种(10-13(10-13日龄胚日龄胚)尿囊腔接种尿囊腔接种(9-11(9-11日龄胚日龄胚)羊膜腔接种羊膜腔接种(10-12(10-12日龄胚日龄胚)卵黄囊接种卵黄囊接种(5-8(5-8日龄胚日龄胚)禽胚接种术

17、式禽胚接种术式接种途径接种途径日龄日龄方法方法破壳部位破壳部位接种量接种量(ml)(ml)收获收获 尿囊膜尿囊膜10-1310-13开蛋窗及人工开蛋窗及人工气室或钻孔气室或钻孔绒毛尿囊膜发绒毛尿囊膜发育中心及气室育中心及气室0.05-0.10.05-0.1扩大蛋窗、收扩大蛋窗、收集接种部绒毛集接种部绒毛尿囊膜尿囊膜尿囊腔尿囊腔9-119-11钻孔钻孔胚胎面与气室胚胎面与气室交界边缘上、交界边缘上、下约下约1mm1mm处处 0.1-0.20.1-0.2破气室破气室,收集收集尿囊液尿囊液(5-8ml)(5-8ml)羊膜腔羊膜腔10-1210-12开蛋窗开蛋窗气室端靠近胚气室端靠近胚胎侧胎侧0.1-

18、0.20.1-0.2扩大蛋窗扩大蛋窗,收收集尿囊液及羊集尿囊液及羊水水卵黄囊卵黄囊5-85-8钻孔钻孔气室中心气室中心0.2-0.50.2-0.5破气室破气室,收集收集去卵黄的卵黄去卵黄的卵黄囊或鸡胚体囊或鸡胚体 1.1.种蛋质量种蛋质量:SPF:SPF种蛋最理想种蛋最理想,其次是非免蛋其次是非免蛋,普通种蛋不能用。普通种蛋不能用。病原微生物病原微生物:家禽有很多疫病可经垂直传递于鸡家禽有很多疫病可经垂直传递于鸡胚胚,这些病原体既可污染制品本身这些病原体既可污染制品本身,又可影响接种又可影响接种病毒在鸡胚内增殖病毒在鸡胚内增殖 母源抗体母源抗体:种蛋带有母源抗体种蛋带有母源抗体,影响病毒在鸡胚

19、内影响病毒在鸡胚内增殖增殖 抗生素抗生素:家禽混合饲料中常含有一定的抗生素家禽混合饲料中常含有一定的抗生素,这这种微量的抗生素可以传递给蛋胚残留种微量的抗生素可以传递给蛋胚残留2.2.孵化技术孵化技术:适宜的孵化条件有利于病毒增殖适宜的孵化条件有利于病毒增殖 温度温度:通常适宜温度为通常适宜温度为37-39.537-39.5。宁低勿高。宁低勿高。湿度湿度:鸡胚孵化标准为鸡胚孵化标准为53%-57%,53%-57%,水禽胚孵化比鸡水禽胚孵化比鸡胚高胚高5%-10%5%-10%。通风通风:发育过程中吸入氧气排出二氧化碳发育过程中吸入氧气排出二氧化碳,随胚龄随胚龄增长需更换孵化机内空气。增长需更换孵化机内空气。转蛋转蛋:大头向上垂直放置入孵大头向上垂直放置入孵,在孵化过程中定期在孵化过程中定期转蛋转蛋,使胚胎受热均匀使胚胎受热均匀,防止胚胎与蛋壳粘连防止胚胎与蛋壳粘连3.3.接种技术接种技术:不同病毒的增殖有不同的接种途不同病毒的增殖有不同的接种途径径,同一种病毒接种不同日龄禽胚获得的病毒同一种病毒接种不同日龄禽胚获得的病毒量也不同。同时量也不同。同时,接种操作应严格按照规定接种操作应严格按照规定,不不应伤及胚体和血管应伤及胚体和血管,以免影响其发育以免影响其发育,使病毒增使病毒增殖速度降低或停止。殖速度降低或停止。