生化实验技术综合设计性大实验精选课件.pptx

1、l实验实施要求实验实施要求：平时按各组计划时间分：平时按各组计划时间分别进行实验，组长有义务指导下组相关别进行实验，组长有义务指导下组相关实验内容，每次实验必须登记。实验内容，每次实验必须登记。l全班交流全班交流：实验结束安排课堂讨论交流，：实验结束安排课堂讨论交流，每组准备一人汇报，一人记录；要求用每组准备一人汇报，一人记录；要求用PPTPPT总结汇报项目实施、实验创新、疑难总结汇报项目实施、实验创新、疑难点，其他组学生质疑，教师点评。点，其他组学生质疑，教师点评。l指导教师指导教师：汪财生、斯越秀：汪财生、斯越秀l通过综合训练，能够系统掌握蛋白质、通过综合训练，能够系统掌握蛋白质、DNA制

2、备的基本原理和操作，学习如何制备的基本原理和操作，学习如何进行实验设计，掌握实验过程中的关键进行实验设计，掌握实验过程中的关键环节，对实验中出现的问题进行科学的环节，对实验中出现的问题进行科学的分析；在学习实验技术的同时，自觉培分析；在学习实验技术的同时，自觉培养分析问题和解决问题能力。养分析问题和解决问题能力。实验项目训练目标实验项目训练目标思考题（课前设疑）思考题（课前设疑）1.1.如何保持生化物质的生物活性？一般生化物如何保持生化物质的生物活性？一般生化物质在碱性条件下容易变性，还是在酸性条件质在碱性条件下容易变性，还是在酸性条件下容易变性？下容易变性？2.2.一般从天然生物材料制作生化

3、物质的过程大一般从天然生物材料制作生化物质的过程大体可分为几个阶段？体可分为几个阶段？3.3.在制备生化物质前应如何选择原料？在制备生化物质前应如何选择原料？4.4.什么叫动态吸附和静态吸附？它们在应用什么叫动态吸附和静态吸附？它们在应用上有何区别？上有何区别？5.5.对酸性物质的提取，常在什么条件下进行？对酸性物质的提取，常在什么条件下进行？对碱性物质的提取，常在什么条件下进行？对碱性物质的提取，常在什么条件下进行？对两性物质的提取，常在什么条件下进行？对两性物质的提取，常在什么条件下进行？6.6.以血清球蛋白为例解释提取制备每步骤的以血清球蛋白为例解释提取制备每步骤的基本原理？基本原理？7

4、.7.干燥离子交换剂应如何进行处理？何谓干燥离子交换剂应如何进行处理？何谓离子交换剂转型？离子交换剂转型？8.8.动植物总动植物总DNADNA或或RNARNA提取的方法主要有哪提取的方法主要有哪些？以猪脾脏些？以猪脾脏DNADNA提取为例试述每步骤主提取为例试述每步骤主要原理是什么？如何判断所提取要原理是什么？如何判断所提取DNADNA的纯的纯度？度？9.9.蛋白质浓度测定方法有哪些？如何鉴定蛋白质浓度测定方法有哪些？如何鉴定所提取蛋白的纯度？未知蛋白质分子量所提取蛋白的纯度？未知蛋白质分子量测定方法有哪些？测定方法有哪些？l11-1411-14周周 生物技术生物技术072-073072-07

5、3班实验班实验l14-1614-16周周 生物技术生物技术071071班实验班实验l1515周周 生物技术生物技术072-073072-073班上交班上交 论文及讨论材料等论文及讨论材料等l1717周周 生物技术生物技术071071班上交论文班上交论文 及讨论材料等及讨论材料等 生化物质的制备分析生化物质的制备分析利用生化制备技术从生物材料中获得特殊的生物活性物质，如蛋白质、酶、激素、核酸等生化产品时，通常要注意以下几个问题：亲和层析法具有从复杂生物组成中专一的“钓出”特异生化成分的特点，目前已在生物大分子，如酶、蛋白、抗体和核酸等的纯化中得到广泛应用。细菌DNA，除核DNA 外，还有质粒DN

6、A 等。（2）制备物的理化性质稳定性的预备试验；微生物中，谷氨酸菌体含7%10%，面包酵母含4%，啤酒酵母含6%，大肠肝菌含9%10%。溶剂用量（L）为生物材料的25倍，少数情况也有用1020倍量溶剂作一次性提取。气体萃取剂必须具有临界压力低，临界温度接近于室温，化学稳定性好，价廉易得等特点。（三）分离纯化方法的评估分别加柠檬酸钠和EDTA的作用是什么?细菌有坚硬的细胞壁，首先要破碎细胞。-球蛋白也称为丙种球蛋白，相对分子量为15-16万，沉降系数为7S；（3）材料处理及抽提方法的选择；如从病毒中提取DNA 比较容易，多数病毒DNA 分子量较小，提取时易保持其结构完整性。结合本人实验操作的体会

7、,试述在提取过程中应如何避免大分子DNA的降解和断裂?分级盐析法分离纤维蛋白、球蛋白和清蛋白的依据是什么？除肌苷酸、鸟苷酸具有鲜味外，核酸和核苷酸大都呈酸味。指导教师：汪财生、斯越秀较常用的有十二烷基硫酸钠(SDS)、氯化十二烷基吡啶、去氧胆酸钠等。利用一种溶剂对不同物质溶解度的差异，从混合物中分离出一种或几种组分的过程称为提取（extraction），提取又称萃取或抽提，其含义基本相同。一般从天然生物材料制作生化物质一般从天然生物材料制作生化物质的过程大体可分为六个阶段：的过程大体可分为六个阶段：1.1.原料的选择和预处理原料的选择和预处理 2.2.原料的粉碎；原料的粉碎；3.3.提取，即从

8、原料中经溶剂分离有效成分，制成粗提取，即从原料中经溶剂分离有效成分，制成粗 品的工艺过程；品的工艺过程；4.4.纯化，即粗制品经盐析、有机溶剂沉淀、吸附、纯化，即粗制品经盐析、有机溶剂沉淀、吸附、层析、透析、超离心、膜分离、结晶等步骤进行层析、透析、超离心、膜分离、结晶等步骤进行 精制的工艺过程；精制的工艺过程；利用生化制备技术从生物材料中获得利用生化制备技术从生物材料中获得特殊的生物活性物质，如蛋白质、酶、特殊的生物活性物质，如蛋白质、酶、激素、核酸等生化产品时，通常要注意激素、核酸等生化产品时，通常要注意以下几个问题：以下几个问题：6.6.成品及制剂成品及制剂，即半成品或原料药经精细加工制

9、成片剂、口服液、针剂、冻干剂等供饮用或临床应用的各种剂型。5.5.干燥及保存干燥及保存；1 1生物材料的组成成分非常复杂，生物材料的组成成分非常复杂，有数百种甚至更多，各种化合物的形有数百种甚至更多，各种化合物的形状、大小、相对分子质量和理化性质状、大小、相对分子质量和理化性质都各不相同，有的迄今还是未知物，都各不相同，有的迄今还是未知物，而且这些化合物在分离时仍在不断的而且这些化合物在分离时仍在不断的代谢变化中。代谢变化中。1生物材料的组成成分非常复杂，有数百种甚至更多，各种化合物的形状、大小、相对分子质量和理化性质都各不相同，有的迄今还是未知物，而且这些化合物在分离时仍在不断的代谢变化中。

10、在学习实验技术的同时，自觉培养分析问题和解决问题能力。机械方法：超声波处理法、研磨法、一般要注意以下几个方面:利用液体比重的大小分离出不同比重的液体者为离心分离；以血清球蛋白为例解释提取制备每步骤的基本原理？免疫球蛋白(immunoglobulin,Ig）是人体接受抗原刺激后，由浆细胞所产生的一类具有免疫功能的球状蛋白质，是直接参与免疫反应的抗体蛋白的总称。选择生物技术产品的宿主受体菌或细胞也应考虑到后处理的问题。干燥离子交换剂应如何进行处理？何谓离子交换剂转型？5原料解剖学部位分别加柠檬酸钠和EDTA的作用是什么?分别加柠檬酸钠和EDTA的作用是什么?该技术应用于酶、不饱和脂肪酸的提取（如鱼

11、油和卵磷脂的提取）、精制和回收，也可用于生化产品的溶剂脱除。动物的脏器组织，常用绞肉机机械法粉碎；11-14周 生物技术072-073班实验通过综合训练，能够系统掌握蛋白质、DNA制备的基本原理和操作，学习如何进行实验设计，掌握实验过程中的关键环节，对实验中出现的问题进行科学的分析；利用液固两相比重的差异进行沉降分离者为离心沉降。实验实施要求：平时按各组计划时间分别进行实验，组长有义务指导下组相关实验内容，每次实验必须登记。溶剂用量（L）为生物材料的25倍，少数情况也有用1020倍量溶剂作一次性提取。（三）生化物质的提取掌握层析、透析、膜分离、电泳等生化分离鉴定技术的应用及操作对酸性物质的提取

12、，常在什么条件下进行？对碱性物质的提取，常在什么条件下进行？对两性物质的提取，常在什么条件下进行？2 2在生物材料中，有些化合物含量很低在生物材料中，有些化合物含量很低或极微，有的只有或极微，有的只有1 1l0 000l0 000，甚至更少。制，甚至更少。制备时，原材料用量很大，得到产品很少，与备时，原材料用量很大，得到产品很少，与投料量相比投料量相比“虎头蛇尾虎头蛇尾”。近年来，用所谓。近年来，用所谓“钓鱼法钓鱼法”，利用某些分子特有的专一亲和，利用某些分子特有的专一亲和力，将某一化合物从极复杂的体系中力，将某一化合物从极复杂的体系中“钓钓”出来，与其他化学分离技术相比具有很大的出来，与其他

13、化学分离技术相比具有很大的优越性。优越性。3 3许多生物活性物质，一旦离开了生物许多生物活性物质，一旦离开了生物体内环境，很易变性及被破坏，应十分注意保体内环境，很易变性及被破坏，应十分注意保护这些化合物生物的活性，常选择十分温和的护这些化合物生物的活性，常选择十分温和的条件，尽可能在较低温度和洁净环境中进行。条件，尽可能在较低温度和洁净环境中进行。一般来说制备的操作时间长、手续较繁琐。因一般来说制备的操作时间长、手续较繁琐。因为许多大分子在分离过程中，为许多大分子在分离过程中，过酸、过碱、重过酸、过碱、重金属离子、高温、剧烈的机械作用、强烈的辐金属离子、高温、剧烈的机械作用、强烈的辐射和机体

14、内自身酶的作用，均可破坏这些分子射和机体内自身酶的作用，均可破坏这些分子的结构或生理活性。的结构或生理活性。4 4生化分离制备过程几乎都在溶液中进生化分离制备过程几乎都在溶液中进行，各种温度、行，各种温度、pHpH、离子强度等参数，对溶、离子强度等参数，对溶液中各种组成的综合影响，常常无法固定，液中各种组成的综合影响，常常无法固定，有些实验或工艺的设计理论性不强，常带有有些实验或工艺的设计理论性不强，常带有很大的经验成分。因此，要建立重复性好的很大的经验成分。因此，要建立重复性好的成熟工艺，对生物材料、各种试剂及其辅助成熟工艺，对生物材料、各种试剂及其辅助材料等都要严格地加以规定。材料等都要严

15、格地加以规定。5 5生化制备方法最后生化制备方法最后均一性均一性的证明的证明与化学上与化学上纯度纯度的概念并不完全相同，这的概念并不完全相同，这是由于生物分子对环境反应十分敏感，是由于生物分子对环境反应十分敏感，结构与功能的关系比较复杂，评定其均结构与功能的关系比较复杂，评定其均一性时，要通过不同角度测定，才能得一性时，要通过不同角度测定，才能得出相对出相对“均一性均一性”结论，只凭一种方法结论，只凭一种方法所得纯度的结论，往往是片面的，甚至所得纯度的结论，往往是片面的，甚至是错误的。是错误的。原料选择和预处理原料选择和预处理 选什么样的原材料应视生产目的而定。选什么样的原材料应视生产目的而定

16、。一般要注意以下几个方面一般要注意以下几个方面:1 1要选择有效成分含量高的新鲜材料；要选择有效成分含量高的新鲜材料；2 2来源丰富易得；来源丰富易得；3 3制造工艺简单易行；制造工艺简单易行；4 4成本比较低；成本比较低；5 5经济效果要好。经济效果要好。如蛋白质原料的选择如蛋白质原料的选择 蛋白质类生化产品的原料来源有动植蛋白质类生化产品的原料来源有动植物组织和微生物等，原则是要选择富含所物组织和微生物等，原则是要选择富含所需蛋白质多肽成分的、易于获得和易于提需蛋白质多肽成分的、易于获得和易于提取的无害生物材料。取的无害生物材料。对天然蛋白质生化产品，为提高其质对天然蛋白质生化产品，为提高

17、其质量、产量和降低生产成本，对原料的量、产量和降低生产成本，对原料的种属、种属、发育发育阶段、生物状态、来源、解剖部位、阶段、生物状态、来源、解剖部位、生物技术产品的宿主菌或细胞生物技术产品的宿主菌或细胞都有一定的都有一定的要求，了解这些，可使分离纯化工作事半要求，了解这些，可使分离纯化工作事半功倍，反之则收效甚微。功倍，反之则收效甚微。1 1种属种属 牛胰含胰岛素（牛胰含胰岛素（insulin)insulin)单位比猪单位比猪胰高，牛为胰高，牛为4000 IU4000 IUkgkg胰脏，猪为胰脏，猪为3000 IU3000 IUkgkg胰脏。抗原性则猪胰岛素胰脏。抗原性则猪胰岛素比牛胰岛素低

18、，前者与人胰岛素相比，比牛胰岛素低，前者与人胰岛素相比，只有只有1 1个氨基酸的差异，而牛有个氨基酸的差异，而牛有3 3个氨基个氨基酸的差异。酸的差异。2 2发育生长阶段发育生长阶段 幼年动物的胸腺比较发达，老龄幼年动物的胸腺比较发达，老龄后逐渐萎缩，因此胸腺原料必须采自后逐渐萎缩，因此胸腺原料必须采自幼龄动物。幼龄动物。3 3生物状态生物状态 动物饱食后宰杀，胰脏中的胰岛动物饱食后宰杀，胰脏中的胰岛素含量增加，对提取胰岛素有利，但素含量增加，对提取胰岛素有利，但胆囊收缩素的分泌使胆汁排空，对胆胆囊收缩素的分泌使胆汁排空，对胆汁的收集不利。严重再生障碍性贫血汁的收集不利。严重再生障碍性贫血症患

19、者尿中的症患者尿中的EPOEPO（erythropoietin,erythropoietin,红细胞生成素）含量增加。红细胞生成素）含量增加。4 4原料来源原料来源 血管舒缓素可分别从血管舒缓素可分别从猪胰脏和猪猪胰脏和猪颚下腺颚下腺中提取，两者生物学功能并无中提取，两者生物学功能并无二致，而稳定性以颚下腺来源为好，二致，而稳定性以颚下腺来源为好，因其不含蛋白水解酶。因其不含蛋白水解酶。一般从天然生物材料制作生化物质的过程大体可分为六个阶段：对不同生物材料，要根据具体情况选择适当的分离提取方法。这一关系，可通过每一步骤的分析鉴定求出。3抑制水解酶的作用(SDS,EDTA)（50）层析曲线细菌有

20、坚硬的细胞壁，首先要破碎细胞。纯化，即粗制品经盐析、有机溶剂沉淀、吸附、提取，即从原料中经溶剂分离有效成分，制成粗为了研究DNA分子在生命代谢中的作用，常常需要从不同的生物材料中提取DNA.DNA制品都可以用哪几种方法测定其含量?试从它们原理、准确性等方面加以比较。3分离后期的保护性措施细菌有坚硬的细胞壁，首先要破碎细胞。1molL三羟甲基氨基甲烷（Tris）0.DNP在低浓度盐溶液中，几乎不溶解，如在0.一般从天然生物材料制作生化物质的过程大体可分为几个阶段？因此，在提取时，常用此法分离这两种核蛋白。每一个分离纯化步骤的好坏，除了从分辨能力和重现性两方面考虑外，还要注意方法本身的回收率，特别

21、是制备某些含量很少的物质时，回收率的高低十分重要。4其他保护措施(避免过酸过碱和剧烈搅拌）对每一步骤方法的优劣的记录，体现在所得产品重量及活性平衡关系上。动物的脏器组织，常用绞肉机机械法粉碎；如果某物质所具有的物理、化学等方面性质经过几种高灵敏度方法的鉴定都是均一的，那么大致可以认为它是均一的。除肌苷酸、鸟苷酸具有鲜味外，核酸和核苷酸大都呈酸味。5 5原料解剖学部位原料解剖学部位 猪胰脏中，胰尾部分含激素较多，而胰猪胰脏中，胰尾部分含激素较多，而胰头部分含消化酶较多。如分别摘取则可提高头部分含消化酶较多。如分别摘取则可提高各产品的收率。各产品的收率。胃膜素以采取全胃粘膜为好，胃蛋白酶胃膜素以采

22、取全胃粘膜为好，胃蛋白酶则以采取胃底部粘膜为好，因胃底部粘膜富则以采取胃底部粘膜为好，因胃底部粘膜富含消化酶。含消化酶。6.6.从简化提纯步骤着手从简化提纯步骤着手 如从鸽肝中提取乙酰化酶，需将如从鸽肝中提取乙酰化酶，需将动物饥饿后取材，可减少肝糖原，以动物饥饿后取材，可减少肝糖原，以简化纯化步骤。简化纯化步骤。7 7对生物技术产品宿主菌或细胞的要求对生物技术产品宿主菌或细胞的要求 选择生物技术产品的宿主受体菌或细选择生物技术产品的宿主受体菌或细胞也应考虑到后处理的问题。如用胞也应考虑到后处理的问题。如用大肠杆大肠杆菌菌表达，由于其不能将所表达的蛋白质分表达，由于其不能将所表达的蛋白质分泌到体

23、外，故提取时必须破壁，增加了提泌到体外，故提取时必须破壁，增加了提取的困难，而且还可能含有毒素类有害因取的困难，而且还可能含有毒素类有害因子；子；用用肿瘤细胞肿瘤细胞作宿主细胞制成的生化产作宿主细胞制成的生化产品还应考虑到其安全性，制造体外诊断用品还应考虑到其安全性，制造体外诊断用试剂则是很好的高产方法。试剂则是很好的高产方法。用枯草杆菌或酵母菌作宿主菌，虽可解决这用枯草杆菌或酵母菌作宿主菌，虽可解决这一矛盾，但表达的蛋白质成分仍有缺乏糖基一矛盾，但表达的蛋白质成分仍有缺乏糖基化等翻译及修饰的缺陷；用化等翻译及修饰的缺陷；用动物细胞和昆虫动物细胞和昆虫细胞细胞表达则能比较好地解决后处理及完整表

24、表达则能比较好地解决后处理及完整表达的问题。达的问题。原料的粉碎原料的粉碎 在提取前先将大块的原料粉碎或绞碎在提取前先将大块的原料粉碎或绞碎成适用的粒度，或将细胞破碎，使胞内生成适用的粒度，或将细胞破碎，使胞内生物活性物质充分释放到溶液中，有利于提物活性物质充分释放到溶液中，有利于提取或吸附。取或吸附。不同的生物体或同一生物体不同的组不同的生物体或同一生物体不同的组织，其破碎的难易不一样，使用的方法织，其破碎的难易不一样，使用的方法也不完全相同。动物的脏器组织，常用也不完全相同。动物的脏器组织，常用绞肉机机械法粉碎；植物肉质组织可以绞肉机机械法粉碎；植物肉质组织可以磨碎；许多微生物均具有坚韧的

25、细胞壁，磨碎；许多微生物均具有坚韧的细胞壁，常用自溶、冷热交替、加砂研磨、超声常用自溶、冷热交替、加砂研磨、超声波、加压处理等破碎方法。波、加压处理等破碎方法。如果提取的有效成分是体液或细菌胞如果提取的有效成分是体液或细菌胞外某些多肽激素、酶等，则不需要破碎外某些多肽激素、酶等，则不需要破碎细胞。细胞。主要通过机械力的作用，使组织粉主要通过机械力的作用，使组织粉碎。粉碎少量原料时，可使用高速组织碎。粉碎少量原料时，可使用高速组织捣碎机（捣碎机（10 000r10 000rminmin）、匀浆器、研）、匀浆器、研钵、研船等。工业生产上一般常用的粉钵、研船等。工业生产上一般常用的粉碎设备有电磨机、

26、球磨机、万能粉碎机、碎设备有电磨机、球磨机、万能粉碎机、绞肉机、击碎机等。绞肉机、击碎机等。(一一)机械法机械法 (二二)物理法物理法1.1.反复冻融法反复冻融法 把待破碎的样品冷至把待破碎的样品冷至15152020，使之凝固，然后缓慢地溶解，如此反复操使之凝固，然后缓慢地溶解，如此反复操作，大部分动物性的细胞及细胞内的颗粒作，大部分动物性的细胞及细胞内的颗粒可以破碎。可以破碎。在细菌或病毒中提取蛋白质和核酸在细菌或病毒中提取蛋白质和核酸时可用此法。操作时，将材料投入沸时可用此法。操作时，将材料投入沸水中，在水中，在9090左右维持数分钟，立即左右维持数分钟，立即置于冰浴中，使之迅速冷却，绝大

27、部置于冰浴中，使之迅速冷却，绝大部分细胞被破坏。分细胞被破坏。2.2.冷热交替法冷热交替法 3 3超声波处理法超声波处理法 多用于微生物材料，处理的效果与样品多用于微生物材料，处理的效果与样品浓度、使用频率有关。用大肠杆菌制备各种浓度、使用频率有关。用大肠杆菌制备各种酶时，常用酶时，常用5050100mg100mgL L菌体的浓度，在菌体的浓度，在1KHz1KHz10KHz10KHz（千赫兹）频率下处理（千赫兹）频率下处理101015min15min。对于其他细菌，则视具体情况而定。对于其他细菌，则视具体情况而定。操作中注意避免溶液中气泡的存在，制备对操作中注意避免溶液中气泡的存在，制备对超声

28、波敏感的一些核酸、酶，要慎重使用。超声波敏感的一些核酸、酶，要慎重使用。4.4.压破碎法压破碎法 加气压或水压（如上海高压匀浆泵厂加气压或水压（如上海高压匀浆泵厂生产的高压匀质机），达生产的高压匀质机），达20.5920.593434.32MPa.32MPa（210210350kgf350kgfcmcm2 2）的压力时，可使）的压力时，可使90%90%以上细胞被压碎。多用于微生物酶制剂的以上细胞被压碎。多用于微生物酶制剂的工业制备。工业制备。(三三)生化及化学法生化及化学法 1 1自溶法自溶法 即新鲜的生物材料存放在一定的即新鲜的生物材料存放在一定的pHpH和适当温度下，利用组织细胞中自身的和

29、适当温度下，利用组织细胞中自身的酶系将细胞破坏，使细胞内含物释放出酶系将细胞破坏，使细胞内含物释放出来的方法。来的方法。自溶的温度，动物材料选在自溶的温度，动物材料选在0 044，微生物材料则多在室温下进行，微生物材料则多在室温下进行。化学试剂法：用SDS处理细胞；11-14周 生物技术072-073班实验如溶剂提取法，逆流分配法，分配层析法，盐析法，等电点沉淀法及有机溶剂分级沉淀法。化学试剂法：用SDS处理细胞；分级盐析法分离纤维蛋白、球蛋白和清蛋白的依据是什么？掌握SDS-PAGE电泳法鉴定蛋白质纯度及测定分子量方法气体萃取剂必须具有临界压力低，临界温度接近于室温，化学稳定性好，价廉易得等

30、特点。1生物材料的组成成分非常复杂，有数百种甚至更多，各种化合物的形状、大小、相对分子质量和理化性质都各不相同，有的迄今还是未知物，而且这些化合物在分离时仍在不断的代谢变化中。1生物材料的组成成分非常复杂，有数百种甚至更多，各种化合物的形状、大小、相对分子质量和理化性质都各不相同，有的迄今还是未知物，而且这些化合物在分离时仍在不断的代谢变化中。除肌苷酸、鸟苷酸具有鲜味外，核酸和核苷酸大都呈酸味。为了纯化一种生化物质常常要联合几个，甚至十几个步骤，并不断变换各种不同类型的分离方法，才能达到目的。加入异戊醇有什么作用？离心是利用旋转运动的离心力进行分离物料的一种操作，其中通过过滤介质分离液体和固体

31、者为离心过滤；成品及制剂，即半成品或原料药经精细加工制成片剂、口服液、针剂、冻干剂等供饮用或临床应用的各种剂型。各标准曲线一般经过56步提纯后，活力回收在25以上。猪胰脏中，胰尾部分含激素较多，而胰头部分含消化酶较多。DNA纯度检测及分子量测定:平板凝胶电泳法过滤系利用多孔材料阻留固体，而使液体通过，达到固体与液体分离的过程。07级生物技术实验安排自溶时，需加少量的防腐剂，如甲苯、氯仿等，以防止外界细菌的污染。免疫球蛋白(immunoglobulin,Ig）是人体接受抗原刺激后，由浆细胞所产生的一类具有免疫功能的球状蛋白质，是直接参与免疫反应的抗体蛋白的总称。自溶时，需加少量的防腐剂，如自溶时

32、，需加少量的防腐剂，如甲苯、氯仿等，以防止外界细菌的污甲苯、氯仿等，以防止外界细菌的污染。因自溶的时间较长，不易控制，染。因自溶的时间较长，不易控制，故制造具有活性的核酸、蛋白质时比故制造具有活性的核酸、蛋白质时比较少用。较少用。2 2酶处理法酶处理法 用外来酶处理生物材料，如用外来酶处理生物材料，如溶菌酶溶菌酶（LysozymeLysozyme）是专一地破坏细菌细胞壁的酶。如用噬菌体感染大是专一地破坏细菌细胞壁的酶。如用噬菌体感染大肠杆菌细胞制造肠杆菌细胞制造DNADNA时，采用时，采用pH8pH8的的0.1mol0.1molL L三羟甲三羟甲基氨基甲烷（基氨基甲烷（TrisTris）0.0

33、1mol0.01molL L乙二胺四乙酸乙二胺四乙酸（EDTAEDTA）制成每毫升含）制成每毫升含2 2亿个细胞的细胞悬液，然后亿个细胞的细胞悬液，然后加入加入100g100g 1mg 1mg的溶菌酶，在的溶菌酶，在3737保温保温10min10min，细，细菌胞壁即被破坏；还有把菌胞壁即被破坏；还有把蜗牛酶蜗牛酶用于酵母细胞的破用于酵母细胞的破碎；用碎；用胰酶胰酶处理猪脑制备脑安素。用于专一性分解处理猪脑制备脑安素。用于专一性分解细胞壁的酶还有细胞壁的酶还有纤维素酶纤维素酶（破坏植物细胞）、（破坏植物细胞）、细菌细菌蛋白酶、酯酶、壳糖酶等。蛋白酶、酯酶、壳糖酶等。3.3.表面活性剂处理法表面

34、活性剂处理法 表面活性剂的分子中，兼有亲脂表面活性剂的分子中，兼有亲脂性和亲水性基团，能降低水的界面张性和亲水性基团，能降低水的界面张力，具有乳化、分散、增溶作用。较力，具有乳化、分散、增溶作用。较常用的有常用的有十二烷基硫酸钠十二烷基硫酸钠(SDS)(SDS)、氯、氯化十二烷基吡啶、去氧胆酸钠等。化十二烷基吡啶、去氧胆酸钠等。生化物质的提取生化物质的提取 利用一种溶剂对不同物质溶解度的差异，利用一种溶剂对不同物质溶解度的差异，从混合物中分离出一种或几种组分的过程从混合物中分离出一种或几种组分的过程称为提取（称为提取（extractionextraction），提取又称萃取），提取又称萃取或抽

35、提，其含义基本相同。或抽提，其含义基本相同。用冷溶剂从固用冷溶剂从固体 态 物 质 提 取 的 过 程 可 称 为 浸 渍体 态 物 质 提 取 的 过 程 可 称 为 浸 渍（macerationmaceration）；用热溶剂者可称为浸提）；用热溶剂者可称为浸提（digestiondigestion），也称浸煮），也称浸煮 一、物质的性质与提取一、物质的性质与提取（一）物质的性质与提取方法的选择（一）物质的性质与提取方法的选择 选择合适的溶剂系统与提取条件。选择合适的溶剂系统与提取条件。（二）活性物质的保护措施二）活性物质的保护措施1 1采用缓冲系统采用缓冲系统2 2添加保护剂（半胱氨酸，

36、还原性谷胱甘肽等）添加保护剂（半胱氨酸，还原性谷胱甘肽等）3 3抑制水解酶的作用抑制水解酶的作用(SDS,EDTA)(SDS,EDTA)4 4其他保护措施其他保护措施(避免过酸过碱和剧烈搅拌避免过酸过碱和剧烈搅拌 ）（三）生化物质的提取（三）生化物质的提取 一般生产上多用一般生产上多用2 23 3次次提取。溶剂用提取。溶剂用量（量（L L）为生物材料的）为生物材料的2 25 5倍，少数情况也倍，少数情况也有用有用10102020倍量溶剂作一次性提取。目的是倍量溶剂作一次性提取。目的是节省提取时间，降低有害酶的作用。节省提取时间，降低有害酶的作用。二、影响提取的因素二、影响提取的因素 （）温度（

37、）温度（二）酸碱度（二）酸碱度（三）盐浓度（三）盐浓度 成品及制剂，即半成品或原料药经精细加工制成片剂、口服液、针剂、冻干剂等供饮用或临床应用的各种剂型。气体萃取剂必须具有临界压力低，临界温度接近于室温，化学稳定性好，价廉易得等特点。免疫球蛋白(immunoglobulin,Ig）是人体接受抗原刺激后，由浆细胞所产生的一类具有免疫功能的球状蛋白质，是直接参与免疫反应的抗体蛋白的总称。选择生物技术产品的宿主受体菌或细胞也应考虑到后处理的问题。1生物材料的组成成分非常复杂，有数百种甚至更多，各种化合物的形状、大小、相对分子质量和理化性质都各不相同，有的迄今还是未知物，而且这些化合物在分离时仍在不断

38、的代谢变化中。对碱性物质的提取，常在酸性条件下进行；对不同生物材料，要根据具体情况选择适当的分离提取方法。蛋白质类生化产品的原料来源有动植物组织和微生物等，原则是要选择富含所需蛋白质多肽成分的、易于获得和易于提取的无害生物材料。（2）制备物的理化性质稳定性的预备试验；分别加柠檬酸钠和EDTA的作用是什么?细菌有坚硬的细胞壁，首先要破碎细胞。对不同生物材料，要根据具体情况选择适当的分离提取方法。细菌DNA 分子量较大，一般达210 道尔顿。简述SDS-PAGE测定蛋白质相对分子质量的原理。蛋白质分子量、纯度、活性测定 SDS-PAGE在此时期间DNA可能会被DNase降解，而动物组织：特别是肌肉

39、组织很难破碎,即使是较易破碎的肝?肾等组织也往往使用组织匀浆器，易造成DNA断裂。（三）分离纯化方法的评估作为DNA分子中的某一区段，有复制、转录和翻译等主要功能称为基因。（二）分离纯化的程序和生产设计掌握层析、透析、膜分离、电泳等生化分离鉴定技术的应用及操作过滤系利用多孔材料阻留固体，而使液体通过，达到固体与液体分离的过程。自溶的温度，动物材料选在04，微生物材料则多在室温下进行。三、提取方法三、提取方法 （一）用酸、碱、盐水溶液提取（一）用酸、碱、盐水溶液提取（二）用表面活性剂提取（二）用表面活性剂提取（三）有机溶剂提取（三）有机溶剂提取 对对酸性酸性物质的提取，常在物质的提取，常在碱性碱

40、性条条件下进行；对件下进行；对碱性碱性物质的提取，常在物质的提取，常在酸性酸性条件下进行；对条件下进行；对两性两性物质的提取，物质的提取，则使水溶液的则使水溶液的pHpH值在远离该两性物质值在远离该两性物质的的等电点等电点为佳。为佳。（三）超临界气体的萃取技术（三）超临界气体的萃取技术 以气体为萃取剂，当气体处于超过临以气体为萃取剂，当气体处于超过临界温度和临界压力时，呈现一种既非液相界温度和临界压力时，呈现一种既非液相又非气相的流体，兼有液体和气体的特性。又非气相的流体，兼有液体和气体的特性。如密度接近于液体，粘度却接近于气体，如密度接近于液体，粘度却接近于气体，具有良好的溶剂性质。具有良好

41、的溶剂性质。气体萃取剂必须具有临界压力低，临气体萃取剂必须具有临界压力低，临界温度接近于室温，化学稳定性好，价廉界温度接近于室温，化学稳定性好，价廉易得等特点。主要有易得等特点。主要有二氧化碳、氮气、乙二氧化碳、氮气、乙烯、乙烷、丙烯、丙烷烯、乙烷、丙烯、丙烷等，最常用的是二等，最常用的是二氧化碳。其方法主要有等温法和等压法两氧化碳。其方法主要有等温法和等压法两种，借助于压力或温度的调节分离萃取剂种，借助于压力或温度的调节分离萃取剂与被萃取物。与被萃取物。该技术应用于酶、不饱和脂肪酸的该技术应用于酶、不饱和脂肪酸的提取（如提取（如鱼油和卵磷脂鱼油和卵磷脂的提取）、精制的提取）、精制和回收，也可

42、用于生化产品的溶剂脱除。和回收，也可用于生化产品的溶剂脱除。某些生化产品在生产过程中，采用了丙某些生化产品在生产过程中，采用了丙酮和甲醇溶剂，欲脱去溶剂又要避免产酮和甲醇溶剂，欲脱去溶剂又要避免产品的分解，需选择超临界气体提取。与品的分解，需选择超临界气体提取。与减压干燥法相比较，前者不多消耗能源，减压干燥法相比较，前者不多消耗能源，且缩短脱溶时间。且缩短脱溶时间。四、提取液的分离四、提取液的分离 提取所得到的溶液，需与固体或另一液体分提取所得到的溶液，需与固体或另一液体分离。溶液与固体的分离，一般处理方法有三种：离。溶液与固体的分离，一般处理方法有三种：自自然沉降、过滤、离心然沉降、过滤、离

43、心。自然沉降是在液体介质中，固体自然下沉而分自然沉降是在液体介质中，固体自然下沉而分离的过程离的过程。当混悬液处理量较大，且固体和液体的。当混悬液处理量较大，且固体和液体的比重悬殊时，可用此法。沉降分层后，可用虹吸等比重悬殊时，可用此法。沉降分层后，可用虹吸等方法将液体部分移去。方法将液体部分移去。过滤系利用多孔材料阻留固体，而使液体通过滤系利用多孔材料阻留固体，而使液体通过，达到固体与液体分离的过程过，达到固体与液体分离的过程。离心是利用旋转运动的离心力进行分离物料离心是利用旋转运动的离心力进行分离物料的一种操作的一种操作，其中通过过滤介质分离液体和固体，其中通过过滤介质分离液体和固体者为离

44、心过滤；利用液体比重的大小分离出不同者为离心过滤；利用液体比重的大小分离出不同比重的液体者为离心分离；比重的液体者为离心分离；利用液固两相比重的利用液固两相比重的差异进行沉降分离者为离心沉降。差异进行沉降分离者为离心沉降。生化物质的分离纯化技术生化物质的分离纯化技术 生化物质分离纯化技术包括：生化物质分离纯化技术包括：生化产品的分离分析和生化产品的制备生化产品的分离分析和生化产品的制备。前者主要对生物体内各组份加以分离前者主要对生物体内各组份加以分离后进行定性、定量鉴定，它不一后进行定性、定量鉴定，它不一定要把某定要把某组分从混合物中分离提取出来；而后者则组分从混合物中分离提取出来；而后者则主

45、要是为了获得生物体内某一单纯组分。主要是为了获得生物体内某一单纯组分。为了保护目的物的生理活性及结构上的完整为了保护目的物的生理活性及结构上的完整性，生物产品的制备中的分离方法多采用温和的性，生物产品的制备中的分离方法多采用温和的“多阶式多阶式”方法进行，即常说的方法进行，即常说的“逐级分离逐级分离”方法。方法。为了纯化一种生化物质常常要联合几个，甚至为了纯化一种生化物质常常要联合几个，甚至十几个步骤，并不断变换各种不同类型的分离方法，十几个步骤，并不断变换各种不同类型的分离方法，才能达到目的。因此操作的时间长，手续繁琐，给才能达到目的。因此操作的时间长，手续繁琐，给制备工作带来众多影响。制备

46、工作带来众多影响。亲和层析法亲和层析法具有从复杂生物组具有从复杂生物组成中专一的成中专一的“钓出钓出”特异生化成分特异生化成分的特点，目前已在生物大分子，如的特点，目前已在生物大分子，如酶、蛋白、抗体和核酸等的纯化中酶、蛋白、抗体和核酸等的纯化中得到广泛应用。得到广泛应用。（一）分离纯化原理（一）分离纯化原理 （1 1）根据分子形状和大小不同进行分离。如）根据分子形状和大小不同进行分离。如差速离心与超离心，膜分离（透析、差速离心与超离心，膜分离（透析、电渗析）与电渗析）与超滤法，凝胶过滤法。超滤法，凝胶过滤法。（2 2）根据分子电离性质（带电性）的差异进行）根据分子电离性质（带电性）的差异进行

47、分离。如离子交换法，电泳法，等电聚焦法。分离。如离子交换法，电泳法，等电聚焦法。（3 3）根据分子极性大小及溶解度不同进行分离。）根据分子极性大小及溶解度不同进行分离。如溶剂提取法，逆流分配法，分配层析法，盐析如溶剂提取法，逆流分配法，分配层析法，盐析法，等电点沉淀法及有机溶剂分级沉淀法。法，等电点沉淀法及有机溶剂分级沉淀法。（4 4）根据物质吸附性质的不同进行分离。如选）根据物质吸附性质的不同进行分离。如选择性吸附与吸附层析法。择性吸附与吸附层析法。（5 5）根据配体特异性进行分离）根据配体特异性进行分离亲和层析法。亲和层析法。细菌DNA 分子量较大，一般达210 道尔顿。气体萃取剂必须具有

48、临界压力低，临界温度接近于室温，化学稳定性好，价廉易得等特点。在安排纯化方法顺序时，还要考虑到有利于减少工序，提高效率，如在盐析后采取吸附法，必然会因离子过多而影响吸附效果，如增加透析除盐，则使操作大大复杂化。（4）分离纯化方法的摸索；（三）生化物质的提取2添加保护剂（半胱氨酸，还原性谷胱甘肽等）指导教师：汪财生、斯越秀11-14周 生物技术072-073班实验分别加柠檬酸钠和EDTA的作用是什么?IgG是人和动物血浆蛋白的重要组分之一，制备-球蛋白的原料通常用动物血液，其次还有动物胎盘和初乳乳清。猪脾DNA产品得率（mg/100g)天然存在的核酸有两类，一类为脱氧核糖核酸Deoxyribon

49、ucleic acid，DNA)，另一类为核糖核酸(Ribonucleic acid，RNA)。杨据Ig的免疫化学特性，可分为五大类：IgG、IgA、IgM、IgD、IgE，其分子不论哪一类，都由四链组成，即由两条相同的长多肽链称H链（又称重链）及两条相同的短肽链称L链（又称轻链）组成。加气压或水压（如上海高压匀浆泵厂生产的高压匀质机），达20.动物的脏器组织，常用绞肉机机械法粉碎；简述SDS-PAGE测定蛋白质相对分子质量的原理。指导教师：汪财生、斯越秀DNA纯度检测及分子量测定:平板凝胶电泳法4其他保护措施(避免过酸过碱和剧烈搅拌）11-14周 生物技术072-073班实验抗原性则猪胰岛素

50、比牛胰岛素低，前者与人胰岛素相比，只有1个氨基酸的差异，而牛有3个氨基酸的差异。如密度接近于液体，粘度却接近于气体，具有良好的溶剂性质。（二）分离纯化的程序和生产设计（二）分离纯化的程序和生产设计（1 1）确定制备物的研究目的及建立相应的分析）确定制备物的研究目的及建立相应的分析鉴定方法；鉴定方法；（2 2）制备物的理化性质稳定性的预备试验；）制备物的理化性质稳定性的预备试验；（3 3）材料处理及抽提方法的选择；）材料处理及抽提方法的选择；（4 4）分离纯化方法的摸索；）分离纯化方法的摸索；（5 5）产物的均一性测定。）产物的均一性测定。1 1分离纯化初期使用方法的选择分离纯化初期使用方法的选