蛋白质样品制备技术课件.ppt

1、蛋白质样品制备技术求为止。另外，组织样品可以直接用10Coomassie Dye-Based 蛋白质定量等密度沉降平衡 适用于分离密度不等的颗粒。测定完后可用乙醇将蓝色的比色杯洗干净。带正电的蛋白形成复合物。经常使用的有阴离子去污剂SDS，非离子去污剂NP-40和TritonX-100，两性离子去污剂CHAPS。等密度沉降平衡 适用于分离密度不等的颗粒。一、裂解液 在蛋白质组学研究中，蛋白质裂解是一个重要的环节。核酸可能通过电稳态相互作用与蛋白结合，从而阻碍聚焦；是一种不可逆抑制剂，通常浓度为1mmol/L,灭活丝氨酸蛋白酶和一些半胱氨酸蛋白酶，但是其局限在于在水溶液中迅速失活，因此，现用现加

2、效果较好；一、裂解液 在蛋白质组学研究中，蛋白质裂解是一个重要的环节。残留的TCA必须通过乙醇或丙酮彻底清除，若过多暴露与低PH溶液中可能导致某些蛋白降解或修饰。近来硫脲的加入可以进一步提高溶解度，特别是膜蛋白。第一步裂解液只含有40mmol/L Tris，其余为去离子水，只溶解偏亲水性的蛋白。另外，组织样品可以直接用10这是一种有效的蛋白沉淀方法，将TCA加到提取液中，终浓度将高达10-20。考马斯亮蓝在一定蛋白质浓度范围内，蛋白质和染料结合符合比尔定律，因此可以通过测定染料在595nm处光吸收的增加量得到与其结合的蛋白质量。及二维电泳图谱的质量，因此，在样品制备中需准确灵敏：BCA试剂的蛋

3、白质测定范围是202000g/ml；速度沉降 分离密度相近而大小不等的细胞或细胞器，其原理是生物颗粒在密度梯度介质中按各自的沉降系数以不同的速度沉降。其不足之处是此反应受多种因素干扰。用研钵或研杵研磨细胞等密度沉降平衡 适用于分离密度不等的颗粒。通过空气干燥或冻干去除残留的丙酮。PMSF(苯甲基磺酰氟）两者联合应用更加有效，通常用10TCA在丙酮中重悬裂解的样品溶液（含有0.Micro BCA试剂测定范围是0.第一节 样品破碎与分离蛋白质通常可用DNase/RNaseA混合物处理样品中的核酸，将其变为单或寡核苷酸。核酸可能通过电稳态相互作用与蛋白结合，从而阻碍聚焦；该法简单、迅速、干扰物质少、

4、灵敏度高（比Lowry法灵敏4倍）。悬浮处理。但是，这些蛋白酶抑制剂价格昂贵，而且它们是小肽片段，可能会出现在二维电泳图谱中，其中胃蛋白酶抑制剂A在PH=9的时候不能抑制蛋白酶。在实际应用中，需要高溶解强度时，一般用2mol/L硫脲和5-8mol/L的尿素联合使用。另外，组织样品可以直接用10在实际应用中，需要高溶解强度时，一般用2mol/L硫脲和5-8mol/L的尿素联合使用。然而许多蛋白在高盐溶液中是可溶的，因此，这种方法只能被用来预分离或富集蛋白。法可以使细胞完全破碎裂解。行有效的破碎。一、裂解液 在蛋白质组学研究中，蛋白质裂解是一个重要的环节。（1）如果测定要求很严格，可以在试剂加入后

5、的5-20 min内测定光吸收，因为再这段时间内颜色最稳定。三、用蛋白酶抑制剂防止蛋白裂解盐离子会干扰电泳过程，应尽可能保持低浓度或通常用的还原剂有-巯基乙醇、二硫苏糖醇（DTT）或二硫赤藓糖醇（DTE)和三丁基膦（TBP）,目前常用的是DTT。1.学习和掌握蛋白质含量测定的原理2.掌握考马斯亮蓝染色法测定蛋白质浓度的操作技术 胞）和从组织中分离同类的细胞样品。因为蛋白质含氮量通常在16%左右，所以将凯氏定氮法测得的含氮量乘上系数6.通常应用1mmol/L的工作浓度，通过螯合自由的金属离子来抑制金属蛋白酶活性。应用对象：血细胞、组织培养细胞。使用匀浆器破碎细胞或组织第一步裂解液只含有40mmo

6、l/L Tris，其余为去离子水，只溶解偏亲水性的蛋白。虽然这些方法可防止蛋白降解，但是有些蛋白酶在上述条件下仍然保持降解蛋白的活性。强碱下抑制酶活，许多组织蛋白酶在pH超过9.原则上去污剂应该是非离子型或者是兼性离子型，这样才不会影响蛋白质的迁移位置。核酸可能通过电稳态相互作用与蛋白结合，从而阻碍聚焦；取14支试管，分两组按下表平行操作。通常浓度为1-2mmol/L，抑制丝氨酸蛋白酶。测定完后可用乙醇将蓝色的比色杯洗干净。这是一种可选择的方法。残留的TCA必须通过乙醇或丙酮彻底清除，若过多暴露与低PH溶液中可能导致某些蛋白降解或修饰。准确灵敏：BCA试剂的蛋白质测定范围是202000g/ml

7、；Micro BCA试剂测定范围是0.5-20g/ml快速：45分钟内完成测定，比经典的Lowry法快4倍而且更加方便经济实用：除试管外，测定可在微孔板中进行，大大节约样品和试剂用量不受样品中离子型和非离子型去污剂影响检测不同蛋白质分子的变异系数小于考马斯亮蓝总蛋白定量分析总蛋白定量分析BCA（Bicinchoninic acid，二辛可宁酸、二羧基二喹啉），二辛可宁酸、二羧基二喹啉）基本原理：基本原理：碱性条件下，蛋白将Cu2+还原为Cu+，Cu+与BCA试剂形成紫颜色的络合物，测定其在562nm处的吸收值，并与标准曲线对比，即可计算待测蛋白的浓度。BCA蛋白质检测流程：蛋白质检测流程：Co

8、omassie Dye-Based 蛋白质定量蛋白质定量PROTEIN+Amax=595nmBLUEAcidCoomassie G-250Protein-DyeComplexO CH2CH3NHCCH3CH3NCH2SO3-CH3CH2NCH2CH2CH3SO3Na+蛋白质降解而使双向电泳图谱的分析复杂化，因此蛋白质尿素是常用的离液剂，它的主要作用是改变或破坏氢键等次级键的结构，使得蛋白变性并使蛋白酶失活。三、用蛋白酶抑制剂防止蛋白裂解直接加入强变性剂8mol/L脲、10TCA或2SDS。的压力杯中，施加压重悬之后的沉淀蛋白也可用来制备浓度稀释的 盐离子、痕量缓冲液和其它带电荷的小分子另外，组织样品可以直接用10一、裂解液 在蛋白质组学研究中，蛋白质裂解是一个重要的环节。第一步裂解液只含有40mmol/L Tris，其余为去离子水，只溶解偏亲水性的蛋白。高分子质量的核酸能够阻滞凝胶孔径；是一种不可逆抑制剂，通常浓度为1mmol/L,灭活丝氨酸蛋白酶和一些半胱氨酸蛋白酶，但是其局限在于在水溶液中迅速失活，因此，现用现加效果较好；其不足之处是此反应受多种因素干扰。另外，组织样品可以直接用10取14支试管，分两组按下表平行操作。Bioinformatics,2010-2011,Shanxi Agricultural University