鼠疫检测技术方法课件.ppt

1、鼠疫检测新技术新方法一、核酸检测技术一、核酸检测技术定义：对动植物、微生物的基因序列进行测定。定义：对动植物、微生物的基因序列进行测定。核酸的分离与纯化核酸的分离与纯化内容：内容：聚合酶链式反应聚合酶链式反应(PCR(PCR技术技术)核酸杂交技术核酸杂交技术核酸的纯化与分离核酸的纯化与分离目的：获得完整的核酸一级结构，并提高核酸纯度。破碎细胞（细菌）技术流程 核酸提取 核酸纯化材料的前处理材料的前处理细胞破碎，核酸释放细胞破碎，核酸释放核酸分离、纯化核酸分离、纯化沉淀或吸附核酸，去除杂质沉淀或吸附核酸，去除杂质核酸溶解缓冲液核酸溶解缓冲液全自动核酸、蛋白提取仪全自动核酸、蛋白提取仪聚合酶链式反

2、应（PCR技术）简史简史：1971年，Khorana提出：DNA变性后，与合适引物进行杂交，在DNA聚合酶作用下，延伸引物，并不断重复该过程，即可克隆tRNA基因。1985年，Mullis等人 发明聚合酶链反应（PCR），随后，Mullis所属公司PE推 出第一台PCR自动化热循环仪。基本原理：基本原理：基本步骤基本步骤实时定量实时定量PCRPCR仪仪PCRPCR仪仪凝胶成像系统凝胶成像系统凝胶电泳系统凝胶电泳系统加入底物,通过颜色变化来测定.Fra-R（5-ACCTGCTGCAAGTTTACCGCC-3）反向PCR 5.在Elisa中一般有二次抗原抗体反应，此时反应的温度和时间应按规定的要求

3、，保温容器最好是水浴箱，可使温度迅速平衡。显色的最后一部是温育反应，此时酶催化无色的底物生成有色的产物，反应温度和时间仍是影响显色的因素，在定量测定中加入底物后的温度和时间应按规定力求准确，而在定性测定中，可根据显色程度适当提高温度，或者适当缩短或延长反应时间。在膜上杂交时，探针通过氢键与其互补的靶序列结合，洗去未结合的游离探针后，经放射自显影或显色反应检测特异结合的探针。M 1 2 3 4 5 6在测定时,把受检标本和酶标抗原或抗体按不同的步骤与固相载体表面抗原抗体反应.核酸纯化自毙或捕获动物血液或组织脏器（肝脏、脾脏等）多重PCR 2.洗涤的目的是吸取反应液中没有与固相抗原或抗体结合的物质

4、以及在反应过程中非特异性吸附于固相载体的干扰物质。M 1 2 3 4 5 6从疑似鼠疫的标本（全血、组织）中检测鼠疫菌，以鼠疫菌fra和pla基因片段作为PCR扩增目的片段。用洗涤的方法使固相载体上形成的抗原抗体复合物与其它物质分开,最后结合在固相载体上的酶量与标本中受检物质量成一定比例.预变性95 5min 1个循环发明聚合酶链反应（PCR），洗涤的目的是吸取反应液中没有与固相抗原或抗体结合的物质以及在反应过程中非特异性吸附于固相载体的干扰物质。在膜上杂交时，探针通过氢键与其互补的靶序列结合，洗去未结合的游离探针后，经放射自显影或显色反应检测特异结合的探针。自毙或捕获动物血液或组织脏器（肝脏

5、、脾脏等）PCRPCR结果判定（凝胶电泳）结果判定（凝胶电泳）PCRPCR类型：类型：1.1.多重多重PCRPCR 2.2.巢式巢式PCRPCR 3.3.定量定量PCRPCR 4.4.反向反向PCRPCR 5.5.逆转录逆转录PCRPCRPCRPCR技术在鼠疫检测中的应用技术在鼠疫检测中的应用鼠疫菌鼠疫菌PCRPCR检测法：检测法：从疑似鼠疫的标本（全血、组织）中检测鼠疫菌，以鼠疫菌fra和pla基因片段作为PCR扩增目的片段。鼠疫判定标准：鼠疫判定标准：PCR PCR扩增（扩增（fra fra+plapla）+胶体金抗原检测胶体金抗原检测 or or 酶联免疫吸附试验酶联免疫吸附试验 oro

6、r反相血凝试验反相血凝试验=确诊鼠疫确诊鼠疫鼠疫菌核酸检测样本处理鼠疫菌核酸检测样本处理样本类别样本类别1.1.鼠疫菌培养物鼠疫菌培养物2.2.鼠疫病人血液、痰液或尸检鼠疫病人血液、痰液或尸检标本标本3.3.自毙或捕获动物血液或组织自毙或捕获动物血液或组织脏器（肝脏、脾脏等）脏器（肝脏、脾脏等）4.4.媒介昆虫媒介昆虫样品处理方法样品处理方法1.1.煮沸法煮沸法2.DNA2.DNA提取试剂盒提取试剂盒3.CTAB3.CTAB法法4.4.氯仿抽提法氯仿抽提法鼠疫菌鼠疫菌PCRPCR检测检测反应体系反应体系10 x bufferdNTPsFra-F（5-GGAACCACTAGCACATCTGTT-

7、3）Fra-R（5-ACCTGCTGCAAGTTTACCGCC-3）Pla-F（5-ACTACGACTGGATGAATGAAAATC-3）Pla-R（5-GTGACATAATATCCAGCGTTAATT-3）Taq聚合酶待检测模板（基因组DNA）去离子水鼠疫菌鼠疫菌PCRPCR检测检测反应程序反应程序预变性95 5min 1个循环变性95 1min退火72 1min延伸72 1min变性72 5min30个循环 M 1 2 3 4 5 6内参基因内参基因 Pla Fra鼠疫鼠疫PCRPCR检测电泳结果判定检测电泳结果判定阳性结果：内参基因阳性结果：内参基因+Pla+Fra+Pla+Fra阴性结

8、果：内参基因阴性结果：内参基因核酸杂交技术核酸杂交技术 待检测DNA或RNA先转移并固定到硝酸纤维素或尼龙膜上，与其互补的单链DNA或RNA探针用放射性或非放射性标记。在膜上杂交时，探针通过氢键与其互补的靶序列结合，洗去未结合的游离探针后，经放射自显影或显色反应检测特异结合的探针。二、标记检测技术二、标记检测技术标记技术：标记技术：用标记物质荧光素、同位素或酶等示踪物质标记抗体（或抗原）进行抗原-抗体反应。通过测定标记物-抗原-抗体复合物来定性或定量的检测标本中的抗体或抗原。Fra-R（5-ACCTGCTGCAAGTTTACCGCC-3）为避免蒸发，板上应加盖，或将平板置于湿盒中。预变性95

9、5min 1个循环标本OD/阴性OD2.在Elisa中一般有二次抗原抗体反应，此时反应的温度和时间应按规定的要求，保温容器最好是水浴箱，可使温度迅速平衡。（+）颜色明显可见；全自动核酸、蛋白提取仪Fra-R（5-ACCTGCTGCAAGTTTACCGCC-3）显色的最后一部是温育反应，此时酶催化无色的底物生成有色的产物，反应温度和时间仍是影响显色的因素，在定量测定中加入底物后的温度和时间应按规定力求准确，而在定性测定中，可根据显色程度适当提高温度，或者适当缩短或延长反应时间。M 1 2 3 4 5 6在膜上杂交时，探针通过氢键与其互补的靶序列结合，洗去未结合的游离探针后，经放射自显影或显色反应

10、检测特异结合的探针。标记技术：用标记物质荧光素、同位素或酶等示踪物质标记抗体（或抗原）进行抗原-抗体反应。PCR类型：1.出第一台PCR自动化热循环仪。自毙或捕获动物血液或组织脏器（肝脏、脾脏等）加入底物,通过颜色变化来测定.标本OD/阴性OD2.PCR类型：1.10 x buffer目测：平持反应版，距白色背景5-10cm，从板的正上方观察。标记检测特点标记检测特点：标记免疫技术=免疫技术 +标记技术抗原抗体反应 示踪物标记灵敏性特异性标记免疫技术的主要特点：高特异性、高灵敏性鼠疫标记检测技术鼠疫标记检测技术ELISAELISA胶体金胶体金ELISAELISA技术技术原理：原理：1.1.使抗

11、原或抗体结合到到某种固相载体表面使抗原或抗体结合到到某种固相载体表面,并保持其免并保持其免疫活性疫活性.2.2.在测定时在测定时,把受检标本和酶标抗原或抗体按不同的步骤把受检标本和酶标抗原或抗体按不同的步骤与固相载体表面抗原抗体反应与固相载体表面抗原抗体反应.3.3.用洗涤的方法使固相载体上形成的抗原抗体复合物与其用洗涤的方法使固相载体上形成的抗原抗体复合物与其它物质分开它物质分开,最后结合在固相载体上的酶量与标本中受检最后结合在固相载体上的酶量与标本中受检物质量成一定比例物质量成一定比例.4.4.加入底物加入底物,通过颜色变化来测定通过颜色变化来测定.ELISAELISA的类型：的类型：间接

12、法间接法双抗夹心法双抗夹心法ELISAELISA技术在鼠疫检测中的应用技术在鼠疫检测中的应用1.1.检测鼠疫检测鼠疫F1F1抗原（抗原（oror抗体）抗体）原理原理：以双抗体夹心法测定F1抗原为例。采用F1抗体包被反应板，加入待测标本，反应除去未结合物质，加入HRP-F1MCAb，如待测标本中含有F1抗原时就与包被F1抗体、HRP-F1抗体结合形成复合物，加入OPD底物产生显色反应，反之就无显色反应。所需试剂及器材：所需试剂及器材：HRP-F1McAb冻干剂，F1McAb包被板，鼠疫F1阳性对照、阴性对照，PBS（稀释液）,显色液（邻苯二胺），终止液（2M硫酸）。ELISA检测工作站，ELIS

13、A洗板机、振荡器等ELISAELISA结果判读结果判读：1.1.目测：目测：平持反应版，距白色背景5-10cm，从板的正上方观察。（+）深黄棕色；（+）浅黄棕色；（+）颜色明显可见；（-）无色或颜色很浅2.ELISA2.ELISA检测工作站检测工作站 标本OD/阴性OD2.1位阳性。ELISAELISA操作注意事项操作注意事项：（一）加样加样 加样时应将所加物加在Elisa板孔的底部，避免加在孔壁的上部，并注意不可溅出，不可产生气泡。加标本一般用微量加样器，每次加标本应更换吸头，以免交叉污染。（二）保温保温 在Elisa中一般有二次抗原抗体反应，此时反应的温度和时间应按规定的要求，保温容器最好

14、是水浴箱，可使温度迅速平衡。为避免蒸发，板上应加盖，或将平板置于湿盒中。（三）洗涤洗涤 洗涤的目的是吸取反应液中没有与固相抗原或抗体结合的物质以及在反应过程中非特异性吸附于固相载体的干扰物质。洗涤一般采用以下方法：1、吸干孔内反应液。2、将洗涤液注满孔板。3、放置3分钟，略作摇动。4、吸干孔内液，也可倾去液体后在吸水纸上拍干，洗涤次数3-4次，又是需洗5-6次。（四）显色和比色显色和比色 显色的最后一部是温育反应，此时酶催化无色的底物生成有色的产物，反应温度和时间仍是影响显色的因素，在定量测定中加入底物后的温度和时间应按规定力求准确，而在定性测定中，可根据显色程度适当提高温度，或者适当缩短或延

15、长反应时间。胶体金检测技术：胶体金检测技术：原理原理：将F1-McAb抗体以条带状固定在NC 膜上，胶体金标记F1-McAb吸附在结合垫上，与待测样品反应，通过目测的胶体金标记复合物得到直观的显色结果。检测类别检测类别：延伸72 1min定义：对动植物、微生物的基因序列进行测定。变性72 5min标记技术：用标记物质荧光素、同位素或酶等示踪物质标记抗体（或抗原）进行抗原-抗体反应。标本OD/阴性OD2.PCR扩增（fra+pla）+胶体金抗原检测 or 酶联免疫吸附试验 or反相血凝试验=确诊鼠疫自毙或捕获动物血液或组织脏器（肝脏、脾脏等）阳性结果：内参基因+Pla+Fra原理：以双抗体夹心法

16、测定F1抗原为例。全自动核酸、蛋白提取仪显色的最后一部是温育反应，此时酶催化无色的底物生成有色的产物，反应温度和时间仍是影响显色的因素，在定量测定中加入底物后的温度和时间应按规定力求准确，而在定性测定中，可根据显色程度适当提高温度，或者适当缩短或延长反应时间。M 1 2 3 4 5 6目测：平持反应版，距白色背景5-10cm，从板的正上方观察。PCR结果判定（凝胶电泳）1971年，Khorana提出：DNA变性后，与合适引物进行杂交，在DNA聚合酶作用下，延伸引物，并不断重复该过程，即可克隆tRNA基因。Fra-R（5-ACCTGCTGCAAGTTTACCGCC-3）通过测定标记物-抗原-抗体

17、复合物来定性或定量的检测标本中的抗体或抗原。用洗涤的方法使固相载体上形成的抗原抗体复合物与其它物质分开,最后结合在固相载体上的酶量与标本中受检物质量成一定比例.洗涤的目的是吸取反应液中没有与固相抗原或抗体结合的物质以及在反应过程中非特异性吸附于固相载体的干扰物质。通过测定标记物-抗原-抗体复合物来定性或定量的检测标本中的抗体或抗原。ELISA检测工作站，ELISA洗板机、振荡器等1985年，Mullis等人在Elisa中一般有二次抗原抗体反应，此时反应的温度和时间应按规定的要求，保温容器最好是水浴箱，可使温度迅速平衡。M 1 2 3 4 5 6预变性95 5min 1个循环PCR类型：1.加入

18、底物,通过颜色变化来测定.使抗原或抗体结合到到某种固相载体表面,并保持其免疫活性.全自动核酸、蛋白提取仪显色的最后一部是温育反应，此时酶催化无色的底物生成有色的产物，反应温度和时间仍是影响显色的因素，在定量测定中加入底物后的温度和时间应按规定力求准确，而在定性测定中，可根据显色程度适当提高温度，或者适当缩短或延长反应时间。用洗涤的方法使固相载体上形成的抗原抗体复合物与其它物质分开,最后结合在固相载体上的酶量与标本中受检物质量成一定比例.PCR扩增（fra+pla）+胶体金抗原检测 or 酶联免疫吸附试验 or反相血凝试验=确诊鼠疫ELISA技术在鼠疫检测中的应用洗涤的目的是吸取反应液中没有与固

19、相抗原或抗体结合的物质以及在反应过程中非特异性吸附于固相载体的干扰物质。标本OD/阴性OD2.原理：以双抗体夹心法测定F1抗原为例。延伸72 1min显色的最后一部是温育反应，此时酶催化无色的底物生成有色的产物，反应温度和时间仍是影响显色的因素，在定量测定中加入底物后的温度和时间应按规定力求准确，而在定性测定中，可根据显色程度适当提高温度，或者适当缩短或延长反应时间。延伸72 1minELISA操作注意事项：PCR类型：1.PCR技术在鼠疫检测中的应用出第一台PCR自动化热循环仪。目的：获得完整的核酸一级结构，并提高核酸纯度。核酸纯化用洗涤的方法使固相载体上形成的抗原抗体复合物与其它物质分开,

20、最后结合在固相载体上的酶量与标本中受检物质量成一定比例.反向PCR 5.在测定时,把受检标本和酶标抗原或抗体按不同的步骤与固相载体表面抗原抗体反应.反向PCR 5.出第一台PCR自动化热循环仪。出第一台PCR自动化热循环仪。目测：平持反应版，距白色背景5-10cm，从板的正上方观察。在膜上杂交时，探针通过氢键与其互补的靶序列结合，洗去未结合的游离探针后，经放射自显影或显色反应检测特异结合的探针。1985年，Mullis等人洗涤的目的是吸取反应液中没有与固相抗原或抗体结合的物质以及在反应过程中非特异性吸附于固相载体的干扰物质。为避免蒸发，板上应加盖，或将平板置于湿盒中。显色的最后一部是温育反应，

21、此时酶催化无色的底物生成有色的产物，反应温度和时间仍是影响显色的因素，在定量测定中加入底物后的温度和时间应按规定力求准确，而在定性测定中，可根据显色程度适当提高温度，或者适当缩短或延长反应时间。定量PCR 4.（+）颜色明显可见；Fra-R（5-ACCTGCTGCAAGTTTACCGCC-3）洗涤的目的是吸取反应液中没有与固相抗原或抗体结合的物质以及在反应过程中非特异性吸附于固相载体的干扰物质。Pla-R（5-GTGACATAATATCCAGCGTTAATT-3）定量PCR 4.多重PCR 2.标记技术：用标记物质荧光素、同位素或酶等示踪物质标记抗体（或抗原）进行抗原-抗体反应。洗涤一般采用以

22、下方法：1、吸干孔内反应液。延伸72 1minFra-R（5-ACCTGCTGCAAGTTTACCGCC-3）Pla-R（5-GTGACATAATATCCAGCGTTAATT-3）定义：对动植物、微生物的基因序列进行测定。1971年，Khorana提出：DNA变性后，与合适引物进行杂交，在DNA聚合酶作用下，延伸引物，并不断重复该过程，即可克隆tRNA基因。巢式PCR 3.洗涤的目的是吸取反应液中没有与固相抗原或抗体结合的物质以及在反应过程中非特异性吸附于固相载体的干扰物质。预变性95 5min 1个循环（+）颜色明显可见；Pla-R（5-GTGACATAATATCCAGCGTTAATT-3）

23、自毙或捕获动物血液或组织脏器（肝脏、脾脏等）10 x buffer在测定时,把受检标本和酶标抗原或抗体按不同的步骤与固相载体表面抗原抗体反应.ELISA技术在鼠疫检测中的应用自毙或捕获动物血液或组织脏器（肝脏、脾脏等）标记技术：用标记物质荧光素、同位素或酶等示踪物质标记抗体（或抗原）进行抗原-抗体反应。Fra-R（5-ACCTGCTGCAAGTTTACCGCC-3）Fra-R（5-ACCTGCTGCAAGTTTACCGCC-3）目测：平持反应版，距白色背景5-10cm，从板的正上方观察。通过测定标记物-抗原-抗体复合物来定性或定量的检测标本中的抗体或抗原。退火72 1min标记技术：用标记物质

24、荧光素、同位素或酶等示踪物质标记抗体（或抗原）进行抗原-抗体反应。（+）颜色明显可见；破碎细胞（细菌）10 x buffer在测定时,把受检标本和酶标抗原或抗体按不同的步骤与固相载体表面抗原抗体反应.待检测模板（基因组DNA）1971年，Khorana提出：DNA变性后，与合适引物进行杂交，在DNA聚合酶作用下，延伸引物，并不断重复该过程，即可克隆tRNA基因。显色的最后一部是温育反应，此时酶催化无色的底物生成有色的产物，反应温度和时间仍是影响显色的因素，在定量测定中加入底物后的温度和时间应按规定力求准确，而在定性测定中，可根据显色程度适当提高温度，或者适当缩短或延长反应时间。技术流程 核酸提取定量PCR 4.PCR扩增（fra+pla）+胶体金抗原检测 or 酶联免疫吸附试验 or反相血凝试验=确诊鼠疫Fra-R（5-ACCTGCTGCAAGTTTACCGCC-3）延伸72 1min多重PCR 2.待检测DNA或RNA先转移并固定到硝酸纤维素或尼龙膜上，与其互补的单链DNA或RNA探针用放射性或非放射性标记。Pla-R（5-GTGACATAATATCCAGCGTTAATT-3）谢谢观看！