蛋白质免疫印迹技术参考课件.ppt

1、蛋白质免疫印迹技术一、免疫学一、免疫学n研究抗原物质的结构和功能；研究抗原物质的结构和功能；n免疫应答产物的结构和功能；免疫应答产物的结构和功能；n抗原刺激机体产生免疫应答的规律。抗原刺激机体产生免疫应答的规律。n免疫学的研究范围很广，与很多相关学科交织在免疫学的研究范围很广，与很多相关学科交织在一起，并且发展成了很多学科，如免疫生物学、一起，并且发展成了很多学科，如免疫生物学、免疫遗传学、血液免疫学、肿瘤免疫学等。免疫遗传学、血液免疫学、肿瘤免疫学等。n随着免疫生物学的发展，人们发现在高等动物体随着免疫生物学的发展，人们发现在高等动物体内存在着具有免疫功能的组织结构（即免疫系内存在着具有免疫

2、功能的组织结构（即免疫系统）。统）。淋巴组织淋巴组织免疫活性细胞免疫活性细胞免疫活性介质免疫活性介质免疫系统功能的生理和病理表现免疫系统功能的生理和病理表现功能名称功能名称 生理功能生理功能 病理表现病理表现免疫防御免疫防御 清除病原微生物及其它抗原性异物清除病原微生物及其它抗原性异物 超敏反应（强）超敏反应（强）免疫缺陷病（弱）免疫缺陷病（弱）免疫自稳免疫自稳 清除损伤或衰老细胞清除损伤或衰老细胞 自身免疫性疾病自身免疫性疾病免疫监视免疫监视 清除突变或畸变细胞清除突变或畸变细胞 防止肿瘤发生防止肿瘤发生 肿瘤或病毒持续性肿瘤或病毒持续性 杀伤病毒感染细胞杀伤病毒感染细胞 感染感染n当外源异

3、体物质，如细菌、病毒、蛋白质、多当外源异体物质，如细菌、病毒、蛋白质、多糖等进入动物机体后，可以激活机体免疫系统，糖等进入动物机体后，可以激活机体免疫系统，产生对外源物质的排除作用，从而保护机体免产生对外源物质的排除作用，从而保护机体免受外源物质的侵害。受外源物质的侵害。n机体的这一特异免疫应答功能的细胞基础是淋机体的这一特异免疫应答功能的细胞基础是淋巴细胞。巴细胞。n免疫应答的类型免疫应答的类型n（一）固有性免疫应答（一）固有性免疫应答（innate immune response)n 又称先天性免疫应答，非特异性免又称先天性免疫应答，非特异性免疫应答是机体在种系发育和进化过程中疫应答是机体

4、在种系发育和进化过程中形成的免疫防御功能。形成的免疫防御功能。n（二）适应性免疫应答（二）适应性免疫应答（adaptive immune response）n 又称获得性免疫应答，特异性免疫又称获得性免疫应答，特异性免疫应答，是机体出生后通过与抗原物质接应答，是机体出生后通过与抗原物质接触后所产生的一系列防御功能。（具有触后所产生的一系列防御功能。（具有特异性、多样性、记忆性、耐受性、自特异性、多样性、记忆性、耐受性、自限性）限性）9%生理盐水溶解配置（加少量NaOH促溶）（周二上、周五上）。二、印迹法（blotting）为了获得较好的抗血清，最好是选用蛋白质抗原。目前实践中常应用的佐剂福氏佐

5、剂。由于动物的遗传性不同，同一抗原对不同动物或同种不同品系动物、或不同个体，产生特异免疫应答的强弱是不同的。熟悉Westernblotting的实验操作免疫自稳 清除损伤或衰老细胞 自身免疫性疾病通过实际操作学会动物抗血清的制备2mL），贮于20以下冰箱保存。将凝胶和固相基质夹在滤纸中间，浸泡在转移装在每毫升不完全佐剂加入120mg卡介苗就成为完全佐剂。（二）适应性免疫应答（adaptive immune response）如要是获得直接标记诊断的抗体，则直接采用本动物；在第2次加强免疫后2周，从耳缘静脉取23mL血，制备血清，检测抗体效价。1975年，Southern建立了将DNA转移到硝酸

6、纤维素膜（NC膜）上，并利用DNARNA杂交检测特定的DNA片段的方法，称为Southern 印迹法。免疫监视 清除突变或畸变细胞将凝胶和固相基质夹在滤纸中间，浸泡在转移装常见的抗原有蛋白质、多糖、磷脂、脂多糖、结合蛋白质、核酸、激素等有机物。与蛋白质结合后成为完全抗原。抗原和免疫原性抗原和免疫原性n抗原（抗原（antigensantigens，AgAg）是指能够刺激机体免疫活性细）是指能够刺激机体免疫活性细胞产生抗体或致敏淋巴细胞，并在体内或体外发生特胞产生抗体或致敏淋巴细胞，并在体内或体外发生特异性反应的物质。异性反应的物质。n常见的抗原有蛋白质、多糖、磷脂、脂多糖、结合蛋常见的抗原有蛋白

7、质、多糖、磷脂、脂多糖、结合蛋白质、核酸、激素等有机物。白质、核酸、激素等有机物。n抗原具有两方面的特性免疫原性（抗原具有两方面的特性免疫原性（immunogenicityimmunogenicity）和免疫反应性（和免疫反应性（immunoreactivityimmunoreactivity）。）。n免疫原性（免疫原性（immunogenicityimmunogenicity）是指抗原刺激机体引起）是指抗原刺激机体引起免疫应答的能力。免疫应答的能力。n免疫反应性（免疫反应性（immunoreactivityimmunoreactivity）是指抗原与相应免）是指抗原与相应免疫应答产物疫应答产

8、物(即抗体即抗体)在体内或体外发生特异性结合反在体内或体外发生特异性结合反应的能力。应的能力。抗原的分类抗原的分类n抗原可以分为完全抗原和半抗原。抗原可以分为完全抗原和半抗原。n完全抗原具有免疫原性和免疫反应性的抗原称为完全抗原具有免疫原性和免疫反应性的抗原称为完全抗原（完全抗原（complete antigencomplete antigen）n半抗原只具有免疫反应性而无免疫原性的抗原称半抗原只具有免疫反应性而无免疫原性的抗原称为半抗原（为半抗原（haptenhapten），也称为不完全抗原），也称为不完全抗原(incomplete antigen)(incomplete antigen)。

9、与蛋白质结合后成为完。与蛋白质结合后成为完全抗原。半抗原能与相应的抗体或致敏淋巴细胞全抗原。半抗原能与相应的抗体或致敏淋巴细胞发生特异性结合反应。绝大多数多糖和所有类脂发生特异性结合反应。绝大多数多糖和所有类脂都属于半抗原。都属于半抗原。27为不同稀释倍数的抗体收集的血液置于室温下1h左右，凝固后，置4下，过夜（切勿冰冻）析出血清，离心，4000rpm,10min。效价 抗血清的效价，就是指血清中所含抗体的浓度或含量。完全抗原具有免疫原性和免疫反应性的抗原称为完全抗原（complete antigen）洗涤去除没有结合的特异性抗体后；硝酸纤维素膜：80g/cm2）具有分析容量大、敏感度高、特异

10、性强等优点。掌握Westernblotting的基本原理福氏佐剂（Freund adjuvant）,通常是由羊毛脂1份、石腊油5份。倒掉一抗溶液，用PBS漂洗液滤膜3次，每次10min。免疫缺陷病（弱）（具有特异性、多样性、记忆性、耐受性、自限性）第二次加强免疫后一周，即可采血，收集抗血清。机体内所产生的抗体就是多克隆抗体。人体血清中IgG含量最多，IgA次之，IgM较少，IgD和IgE微量。加强免疫小鼠背部多点皮下注射，0.免疫原性（immunogenicity）是指抗原刺激机体引起免疫应答的能力。首次免疫时抗原与完全佐剂等体积混合。第二次加强免疫加强免疫一周后进行。置的缓冲液中，电转45m

11、in或过夜。抗原通常是由多个抗原决定簇组成的。抗原（antigens，Ag）是指能够刺激机体免疫活性细胞产生抗体或致敏淋巴细胞，并在体内或体外发生特异性反应的物质。2mL），贮于80以下冰箱，或冻干后贮存于4冰箱保存。收集的血液置于室温下1h左右，凝固后，置4下，过夜（切勿冰冻）析出血清，离心，4000rpm,10min。另一种本身无免疫原性，如氢氧化铝、磷酸钙、矿物油乳剂、表面活性剂等。由于动物的遗传性不同，同一抗原对不同动物或同种不同品系动物、或不同个体，产生特异免疫应答的强弱是不同的。应用佐剂的目的是为了提高抗原对机体的免疫原性，从而提高抗体的效价。硝酸纤维素膜：80g/cm2）把硝酸纤

12、维素滤膜放在密闭塑料袋或者培养皿中，根据滤膜面积以0.由一种抗原决定簇刺激机体，由一个B淋巴细胞接受该抗原所产生的抗体称之为单克隆抗体（Monoclone antibody）。一抗杂交初级抗体（第一抗体）是特异性的。（一）固有性免疫应答（innate immune response)体外反应可出现凝集反应、沉淀反应、补体参与的反应及中和反应等各种不同的反应类型。分 子 杂 交 原 理 及 流 程 图2）纯化的鸡卵类粘蛋白（周四上午）。常用的实验动物为羊、家兔、豚鼠和鼠等。随着免疫生物学的发展，人们发现在高等动物体内存在着具有免疫功能的组织结构（即免疫系统）。免疫印迹法(immunoblotti

13、ng test,IBT)，亦称酶联免疫电转移印斑法(enzyme linked immunoelectrotransfer blot,EITB抗体的种类抗体的种类n抗体（抗体（antibodiesantibodies，Ab)Ab)是专门对抗抗原特异是专门对抗抗原特异结构的球蛋白，故也称为免疫球蛋白结构的球蛋白，故也称为免疫球蛋白（immunoglobulins,Ig)immunoglobulins,Ig)。存在于血清、体液。存在于血清、体液中，是构成机体免疫作用的主要物质。中，是构成机体免疫作用的主要物质。n免疫球蛋白依据其理化性质及生化性质的不同，免疫球蛋白依据其理化性质及生化性质的不同，分

14、为五种类型分为五种类型 IgG IgG、IgA IgA、IgM IgM、IgD IgD和和IgEIgE。n人体血清中人体血清中IgGIgG含量最多，含量最多，IgA IgA次之，次之，IgM IgM较较少，少，IgD IgD和和IgEIgE微量。微量。n抗原抗体反应（抗原抗体反应（antigenantibody reactionantigenantibody reaction）n是指抗原与相应抗体之间所发生的特异性结合反是指抗原与相应抗体之间所发生的特异性结合反应。可发生于体内（应。可发生于体内（in vivoin vivo），也可发生于体外），也可发生于体外（in vitroin vitro

15、）。）。n体内反应可介导吞噬、溶菌、杀菌、中和毒素等体内反应可介导吞噬、溶菌、杀菌、中和毒素等作用；作用；n体外反应可出现凝集反应、沉淀反应、补体参与体外反应可出现凝集反应、沉淀反应、补体参与的反应及中和反应等各种不同的反应类型。的反应及中和反应等各种不同的反应类型。n因抗体主要存在于血清中，在抗原或抗体的检测因抗体主要存在于血清中，在抗原或抗体的检测中多采用血清作试验，所以体外抗原抗体反应亦中多采用血清作试验，所以体外抗原抗体反应亦称为血清学反应（称为血清学反应（serologic reactionserologic reaction）。）。由于动物的遗传性不同，同一抗原对不同动物或同种不同

16、品系动物、或不同个体，产生特异免疫应答的强弱是不同的。（七）抗血清的采集与保存（尼龙膜：480g/cm2；单向扩射免疫法 以不同稀释度的抗血清与优质标记抗原混合，孵育24h后，测定其结合率。由多个抗原决定簇刺激机体，相应地就产生各种各样的单克隆抗体，这些单克隆抗体混杂在一起就是多克隆抗体。免疫印迹法(immunoblotting test,IBT)，亦称酶联免疫电转移印斑法(enzyme linked immunoelectrotransfer blot,EITB目的蛋白与硝酸纤维膜的结合能力弱加强免疫初级免疫后两周进行。与蛋白质结合后成为完全抗原。1975年，Southern建立了将DNA转

17、移到硝酸纤维素膜（NC膜）上，并利用DNARNA杂交检测特定的DNA片段的方法，称为Southern 印迹法。2）纯化的鸡卵类粘蛋白（周四上午）。Westernblotting 检测抗血清目的蛋白与硝酸纤维膜的结合能力弱三、蛋白免疫印迹的应用一般为6个月大小的动物。杀伤病毒感染细胞 感染置的缓冲液中，电转45min或过夜。熟悉Westernblotting的实验操作2）纯化的鸡卵类粘蛋白（周四上午）。二抗杂交第二抗体或配体试剂对于初级抗体是特异性结合并作为指示物。与蛋白质结合后成为完全抗原。学习掌握动物抗血清的制备原理及技术二、印迹法（blotting）二、印迹法（二、印迹法（blotting

18、）n印迹法是指将样品转移到固相载体上，而后利用相应印迹法是指将样品转移到固相载体上，而后利用相应的探测反应来检测样品的一种方法。的探测反应来检测样品的一种方法。n19751975年，年，SouthernSouthern建立了将建立了将DNADNA转移到硝酸纤维素膜转移到硝酸纤维素膜（NCNC膜）上，并利用膜）上，并利用DNADNARNARNA杂交检测特定的杂交检测特定的DNADNA片段片段的方法，称为的方法，称为Southern Southern 印迹法。印迹法。n人们用类似的方法，对人们用类似的方法，对RNARNA和蛋白质进行印迹分析，对和蛋白质进行印迹分析，对RNARNA的印迹分析称为的印

19、迹分析称为NorthernNorthern印迹法，对单向电泳后的印迹法，对单向电泳后的蛋白质分子的印迹分析称为蛋白质分子的印迹分析称为WesternWestern印迹法，对双向电印迹法，对双向电泳后蛋白质分子的印迹分析称为泳后蛋白质分子的印迹分析称为EasternEastern印迹法印迹法三、蛋白免疫印三、蛋白免疫印迹迹的应用的应用n免疫印迹法免疫印迹法 (immunoblotting test,IBT)，亦称酶联，亦称酶联免疫电转移印斑法免疫电转移印斑法(enzyme linked immunoelectrotransfer blot,EITBn是一种将高分辨率凝胶电泳和免疫化学分析技术是一

20、种将高分辨率凝胶电泳和免疫化学分析技术相结合的杂交技术。相结合的杂交技术。n具有分析容量大、敏感度高、特异性强等优点。具有分析容量大、敏感度高、特异性强等优点。n是检测蛋白质特性、表达与分布的一种最常用的是检测蛋白质特性、表达与分布的一种最常用的方法。方法。蛋白质免疫印迹检测技术蛋白质免疫印迹检测技术一、实验目的一、实验目的二、实验原理二、实验原理三、实验仪器三、实验仪器四、操作步骤四、操作步骤五、实验结果与分析五、实验结果与分析六、思考题六、思考题一、实验目的一、实验目的n学习掌握动物抗血清的制备原理及技术学习掌握动物抗血清的制备原理及技术n通过实际操作学会动物抗血清的制备通过实际操作学会动

21、物抗血清的制备n掌握掌握WesternWesternblottingblotting的基本原理的基本原理 n熟悉熟悉WesternWesternblottingblotting的实验操作的实验操作 二、实验原理二、实验原理n第一部分第一部分 动物的常规免疫及抗血清的制备动物的常规免疫及抗血清的制备n第二部分第二部分 WesternWesternblotting blotting 检测抗血清检测抗血清 n将适当的抗原物质注入动物体内，经过一定时间，动将适当的抗原物质注入动物体内，经过一定时间，动物血清中可出现大量特异性抗体，这种含抗体的血清物血清中可出现大量特异性抗体，这种含抗体的血清称为免疫血

22、清。称为免疫血清。n优质免疫血清的产生，主要取决于抗原的纯度和免疫优质免疫血清的产生，主要取决于抗原的纯度和免疫原性，以及动物应答的能力。此外，尚需考虑免疫途原性，以及动物应答的能力。此外，尚需考虑免疫途径、抗原剂量、注射次数、时间间隔、有无佐剂等因径、抗原剂量、注射次数、时间间隔、有无佐剂等因素。素。第一部分第一部分 动物的常规免疫及抗血清的制备动物的常规免疫及抗血清的制备（一）多克隆抗体的概念（一）多克隆抗体的概念n抗原通常是由多个抗原决定簇组成的。抗原通常是由多个抗原决定簇组成的。n由一种抗原决定簇刺激机体，由一个由一种抗原决定簇刺激机体，由一个B B淋巴细胞接淋巴细胞接受该抗原所产生的

23、抗体称之为单克隆抗体受该抗原所产生的抗体称之为单克隆抗体（Monoclone antibodyMonoclone antibody）。）。n由多个抗原决定簇刺激机体，相应地就产生各种由多个抗原决定簇刺激机体，相应地就产生各种各样的单克隆抗体，这些单克隆抗体混杂在一起各样的单克隆抗体，这些单克隆抗体混杂在一起就是多克隆抗体。就是多克隆抗体。n机体内所产生的抗体就是多克隆抗体。机体内所产生的抗体就是多克隆抗体。抗体的结构抗体的结构（二）用于免疫的动物（二）用于免疫的动物n由于动物的遗传性不同，同一抗原对不同动物由于动物的遗传性不同，同一抗原对不同动物或同种不同品系动物、或不同个体，产生特异或同种不

24、同品系动物、或不同个体，产生特异免疫应答的强弱是不同的。因此，进行动物免免疫应答的强弱是不同的。因此，进行动物免疫时，必须选择对该抗原敏感的、年轻的健康疫时，必须选择对该抗原敏感的、年轻的健康动物。动物。n常用的实验动物为羊、家兔、豚鼠和鼠等。一常用的实验动物为羊、家兔、豚鼠和鼠等。一般为般为6 6个月大小的动物。个月大小的动物。n动物种类的选择主要根据抗原的生物学特性和所要获得动物种类的选择主要根据抗原的生物学特性和所要获得抗血清数量。抗血清数量。q如要获得大量的抗体，多采用大动物；如要获得大量的抗体，多采用大动物；q如要是获得直接标记诊断的抗体，则直接采用本动物；如要是获得直接标记诊断的抗

25、体，则直接采用本动物；q如要获得间接的标记诊断用抗体，则必须用异源动物制备如要获得间接的标记诊断用抗体，则必须用异源动物制备抗体；抗体；q如果难以获得的抗原，且抗体的需要量少，则可以采用纯如果难以获得的抗原，且抗体的需要量少，则可以采用纯系小鼠制备。系小鼠制备。n一般实验室采用的抗体，多用兔和羊制备，因动物反应一般实验室采用的抗体，多用兔和羊制备，因动物反应良好，而且能够提供足够数量的血清。良好，而且能够提供足够数量的血清。（三）抗原（三）抗原n抗原是多种多样的，就其化学成分而言，有蛋白抗原是多种多样的，就其化学成分而言，有蛋白质抗原、类脂抗原、多糖类抗原和核酸抗原等。质抗原、类脂抗原、多糖类

26、抗原和核酸抗原等。n为了获得较好的抗血清，最好是选用蛋白质抗原。为了获得较好的抗血清，最好是选用蛋白质抗原。n不同的抗原，其免疫原性的强弱均不相同，这种不同的抗原，其免疫原性的强弱均不相同，这种免疫原性的强弱取决于抗原的分子量、化学活性免疫原性的强弱取决于抗原的分子量、化学活性基团、立体结构等。基团、立体结构等。（四）免疫途径（四）免疫途径n免疫途径有多种多样，如静脉内、腹腔内、肌肉免疫途径有多种多样，如静脉内、腹腔内、肌肉内、皮内、皮下、淋巴结内注射等。内、皮内、皮下、淋巴结内注射等。n一般常用皮下或背部多点皮内注射，每点注射一般常用皮下或背部多点皮内注射，每点注射0.1mL0.1mL左右。

27、左右。n实验中实验中0.2mL0.2mL，3 34 4点注射。点注射。n皮下注射皮下注射（五）佐剂（五）佐剂n应用佐剂的目的是为了提高抗原对机体的应用佐剂的目的是为了提高抗原对机体的免疫原性，从而提高抗体的效价。免疫原性，从而提高抗体的效价。n佐剂主要可分为两种一种本身具有免疫原佐剂主要可分为两种一种本身具有免疫原性，如百日咳杆菌、抗酸杆菌（结核分枝性，如百日咳杆菌、抗酸杆菌（结核分枝杆菌）以及革兰阴性杆菌等；另一种本身杆菌）以及革兰阴性杆菌等；另一种本身无免疫原性，如氢氧化铝、磷酸钙、矿物无免疫原性，如氢氧化铝、磷酸钙、矿物油乳剂、表面活性剂等。油乳剂、表面活性剂等。n目前实践中常应用的佐剂

28、福氏佐剂。目前实践中常应用的佐剂福氏佐剂。n福氏佐剂（福氏佐剂（Freund adjuvantFreund adjuvant）,通常是由羊通常是由羊毛脂毛脂1 1份、石腊油份、石腊油5 5份。这是不完全福氏佐剂。份。这是不完全福氏佐剂。n在每毫升不完全佐剂加入在每毫升不完全佐剂加入1 120mg20mg卡介苗就成卡介苗就成为完全佐剂。为完全佐剂。抗体（antibodies，Ab)是专门对抗抗原特异结构的球蛋白，故也称为免疫球蛋白（immunoglobulins,Ig)。（二）适应性免疫应答（adaptive immune response）在无菌条件，吸出血清，分装（0.通常以结合率为50%的

29、血清稀度和为效价。体内反应可介导吞噬、溶菌、杀菌、中和毒素等作用；倒掉一抗溶液，用PBS漂洗液滤膜3次，每次10min。（七）抗血清的采集与保存在无菌条件，吸出血清，分装（0.目前实践中常应用的佐剂福氏佐剂。2mL），贮于80以下冰箱，或冻干后贮存于4冰箱保存。免疫监视 清除突变或畸变细胞如要是获得直接标记诊断的抗体，则直接采用本动物；硝酸纤维素膜：80g/cm2）体内反应可介导吞噬、溶菌、杀菌、中和毒素等作用；（具有特异性、多样性、记忆性、耐受性、自限性）将凝胶和固相基质夹在滤纸中间，浸泡在转移装单向扩射免疫法 以不同稀释度的抗血清与优质标记抗原混合，孵育24h后，测定其结合率。（一）固有性

30、免疫应答（innate immune response)（六）免疫方法（六）免疫方法n抗原剂量，首次剂量为抗原剂量，首次剂量为101050g50g，加强免疫的剂量，加强免疫的剂量约为首次剂量的约为首次剂量的1/41/4。n首次免疫时抗原与完全佐剂等体积混合。加强免疫首次免疫时抗原与完全佐剂等体积混合。加强免疫时用不完全佐剂。时用不完全佐剂。n每每2 23 3周加强免疫一次。周加强免疫一次。n在第在第2 2次加强免疫后次加强免疫后2 2周，从耳缘静脉取周，从耳缘静脉取2 23mL3mL血，血，制备血清，检测抗体效价。如未达到预期效价，需制备血清，检测抗体效价。如未达到预期效价，需再进行加强免疫，

31、直到满意时为止。当抗体效价达再进行加强免疫，直到满意时为止。当抗体效价达到预期水平时，即可放血制备抗血清。到预期水平时，即可放血制备抗血清。n抗体的产生顺序与丰度抗体的产生顺序与丰度（七）抗血清的采集与保存（七）抗血清的采集与保存n取兔血有两种方法，一是耳缘静脉或耳动脉放血，取兔血有两种方法，一是耳缘静脉或耳动脉放血，一是颈动脉放血，也可心脏采血。一是颈动脉放血，也可心脏采血。n小鼠取血。小鼠取血。n收集的血液置于室温下收集的血液置于室温下1h1h左右，凝固后，置左右，凝固后，置44下，下，过夜（切勿冰冻）析出血清，离心，过夜（切勿冰冻）析出血清，离心，4000rpm,10min4000rpm

32、,10min。在无菌条件，吸出血清，分装。在无菌条件，吸出血清，分装（0.050.050.2mL0.2mL），贮于），贮于8080以下冰箱，或冻干后以下冰箱，或冻干后贮存于贮存于44冰箱保存。冰箱保存。（八）抗血清质量的评价（八）抗血清质量的评价n在免疫期间，不仅各个不同的动物，而且同一动物在在免疫期间，不仅各个不同的动物，而且同一动物在不同的时间内抗血清效价、特异性、亲合力等都可能不同的时间内抗血清效价、特异性、亲合力等都可能发生变化，因而必须经常地采血测试。只有在对抗血发生变化，因而必须经常地采血测试。只有在对抗血清的效价、特异性、亲合力等方面作彻底的评价后，清的效价、特异性、亲合力等方面

33、作彻底的评价后，才可使用所取得的抗血清。才可使用所取得的抗血清。n效价效价 抗血清的效价，就是指血清中所含抗血清的效价，就是指血清中所含抗体的浓度或含量。效价测定的方法常用抗体的浓度或含量。效价测定的方法常用的是单向扩散免疫法，此法对所有的抗体的是单向扩散免疫法，此法对所有的抗体均适用。均适用。n某些由大分子（如蛋白类）抗原所产生的某些由大分子（如蛋白类）抗原所产生的抗体，可用双扩散等方法测定。抗体，可用双扩散等方法测定。n单向扩射免疫法单向扩射免疫法 以不同稀释度的抗血清与优质标记抗原混合，孵以不同稀释度的抗血清与优质标记抗原混合，孵育育24h24h后，测定其结合率。通常以结合率为后，测定其

34、结合率。通常以结合率为50%50%的血清稀度和为效的血清稀度和为效价。价。n如某抗血清的结合率为如某抗血清的结合率为50%50%时的稀释度为时的稀释度为115000,115000,则该血清的效价则该血清的效价就是就是115000 115000 n制备含有一定浓度抗血清的琼脂凝胶板（抗体固定不变）。打孔，制备含有一定浓度抗血清的琼脂凝胶板（抗体固定不变）。打孔，加入不同稀释度的抗原量，进行免疫扩散。抗原与相应抗体在浓加入不同稀释度的抗原量，进行免疫扩散。抗原与相应抗体在浓度合适时，则形成清晰的沉淀环，其直径大小与所加抗原量成正度合适时，则形成清晰的沉淀环，其直径大小与所加抗原量成正比。将已知参考

35、抗原形成的沉淀环绘成曲线，然后以待测标本的比。将已知参考抗原形成的沉淀环绘成曲线，然后以待测标本的沉淀环直径查标准曲线，计算出待测抗原的含量。沉淀环直径查标准曲线，计算出待测抗原的含量。n双向扩散法利用大分子抗原和抗体在琼脂平板上扩散，双向扩散法利用大分子抗原和抗体在琼脂平板上扩散，两者在相交处产生沉淀线，以观察和判断抗血清中是两者在相交处产生沉淀线，以观察和判断抗血清中是否有抗体及其浓度。否有抗体及其浓度。双向免疫扩散 免疫扩散试验免疫扩散试验 1 1抗原；抗原；2 27 7为不同稀释倍数的抗体为不同稀释倍数的抗体分分 子子 杂杂 交交 原原 理理 及及 流流 程程 图图样样 品品 制制 备

36、备电电 泳泳杂杂 交交转转 膜膜结果显示结果显示探探 针针 制制 备备第二部分第二部分 WesternWesternblotting blotting 检测抗血清检测抗血清 如要是获得直接标记诊断的抗体，则直接采用本动物；（2）用酒精棉球消毒待注射部位学习掌握动物抗血清的制备原理及技术取兔血有两种方法，一是耳缘静脉或耳动脉放血，一是颈动脉放血，也可心脏采血。人体血清中IgG含量最多，IgA次之，IgM较少，IgD和IgE微量。免疫印迹法(immunoblotting test,IBT)，亦称酶联免疫电转移印斑法(enzyme linked immunoelectrotransfer blot,

37、EITB常用的实验动物为羊、家兔、豚鼠和鼠等。单向扩射免疫法 以不同稀释度的抗血清与优质标记抗原混合，孵育24h后，测定其结合率。收集的血液置于室温下1h左右，凝固后，置4下，过夜（切勿冰冻）析出血清，离心，4000rpm,10min。倒掉一抗溶液，用PBS漂洗液滤膜3次，每次10min。（2）用酒精棉球消毒待注射部位（2）用酒精棉球消毒待注射部位免疫应答产物的结构和功能；目前实践中常应用的佐剂福氏佐剂。加强免疫初级免疫后两周进行。三、蛋白免疫印迹的应用第二次加强免疫加强免疫一周后进行。（一）多克隆抗体的概念Western BlotWestern Blot原理原理n将通过将通过PAGEPAGE

38、分离的蛋白质转移到分离的蛋白质转移到NCNC膜或膜或PVDFPVDF膜上；膜上；n然后与能特异性识别待检蛋白的抗体进行反应；然后与能特异性识别待检蛋白的抗体进行反应；n洗涤去除没有结合的特异性抗体后；洗涤去除没有结合的特异性抗体后；n加入标记的、能识别特异性抗体的种属特异性抗加入标记的、能识别特异性抗体的种属特异性抗体，反应一段时间后再次洗涤去除非特异性结合体，反应一段时间后再次洗涤去除非特异性结合的标记抗体；的标记抗体；n加入适合标记物的检测试剂进行显色或发光等，加入适合标记物的检测试剂进行显色或发光等，观察有无特异性蛋白条带的出现。观察有无特异性蛋白条带的出现。n免疫印迹的实验包括五个步骤

39、免疫印迹的实验包括五个步骤n 固定蛋白质进行聚丙烯酰胺凝胶电泳固定蛋白质进行聚丙烯酰胺凝胶电泳（PAGEPAGE）并从胶上转移到硝酸纤维素膜上。）并从胶上转移到硝酸纤维素膜上。n 封闭保持膜上没有抗体的结合场所，使场封闭保持膜上没有抗体的结合场所，使场所处于饱和状态，用以避免特殊性抗体单独结所处于饱和状态，用以避免特殊性抗体单独结合到膜上。合到膜上。l一抗杂交初级抗体（第一抗体）是特异性的。一抗杂交初级抗体（第一抗体）是特异性的。l二抗杂交第二抗体或配体试剂对于初级抗体二抗杂交第二抗体或配体试剂对于初级抗体是特异性结合并作为指示物。是特异性结合并作为指示物。l底物显色被适当保温后的酶标记蛋白质

40、区带，底物显色被适当保温后的酶标记蛋白质区带，产生可见的、不溶解状态的颜色反应。产生可见的、不溶解状态的颜色反应。三、实验仪器三、实验仪器n动物的常规免疫动物的常规免疫n WesternWesternblotting blotting 检测抗血清检测抗血清 免疫缺陷病（弱）加入标记的、能识别特异性抗体的种属特异性抗体，反应一段时间后再次洗涤去除非特异性结合的标记抗体；收集的血液置于室温下1h左右，凝固后，置4下，析出血清，离心，3000rpm,10min。（2）皮下多点注射，每点注射量应小于0.Westernblotting 检测抗血清抗体（antibodies，Ab)是专门对抗抗原特异结构的

41、球蛋白，故也称为免疫球蛋白（immunoglobulins,Ig)。Westernblotting 检测抗血清通过实际操作学会动物抗血清的制备目前实践中常应用的佐剂福氏佐剂。如要获得间接的标记诊断用抗体，则必须用异源动物制备抗体；润滤纸之间，电转1030min。免疫监视 清除突变或畸变细胞加强免疫初级免疫后两周进行。把硝酸纤维素滤膜放在密闭塑料袋或者培养皿中，根据滤膜面积以0.倒掉一抗溶液，用PBS漂洗液滤膜3次，每次10min。免疫防御 清除病原微生物及其它抗原性异物 超敏反应（强）2mL），贮于80以下冰箱，或冻干后贮存于4冰箱保存。目的蛋白与硝酸纤维膜的结合能力弱在无菌条件，吸出血清，分

42、装（0.（二）适应性免疫应答（adaptive immune response）半抗原能与相应的抗体或致敏淋巴细胞发生特异性结合反应。一般实验室采用的抗体，多用兔和羊制备，因动物反应良好，而且能够提供足够数量的血清。动物的常规免疫动物的常规免疫n注射器注射器n蜗旋混合器蜗旋混合器四、操作步骤四、操作步骤n动物的常规免疫动物的常规免疫n WesternWesternblotting blotting 检测抗血清检测抗血清 n抗原的提取与制备抗原的提取与制备 1 1）0.5mg/mL0.5mg/mL菠萝蛋白酶以菠萝蛋白酶以0.9%0.9%生理盐水溶生理盐水溶解配置（加少量解配置（加少量NaOHNa

43、OH促溶）（周二上、周五促溶）（周二上、周五上）。上）。2 2）纯化的鸡卵类粘蛋白（周四上午）。）纯化的鸡卵类粘蛋白（周四上午）。3 3）1mg/mL1mg/mL酪蛋白以酪蛋白以0.9%0.9%生理盐水溶解配置生理盐水溶解配置（加少量（加少量NaOHNaOH促溶）促溶）（周四下午）。（周四下午）。动物的常规免疫动物的常规免疫苦味酸（以苦味酸（以75%75%乙醇配置）标记小鼠乙醇配置）标记小鼠标记部位标记部位组号组号头头1左前肢左前肢2左后肢左后肢3背背4右前肢右前肢5右后肢右后肢6左耳朵左耳朵7右耳朵右耳朵8n初级免疫小鼠背部多点皮下注射，初级免疫小鼠背部多点皮下注射，0.2mL/0.2mL/

44、只小鼠只小鼠n （1 1）抗原与佐剂的混合取）抗原与佐剂的混合取1.5mL1.5mL蛋白与蛋白与1.5mL1.5mL完完全佐剂混合，震荡混匀，制成油包水的形态全佐剂混合，震荡混匀，制成油包水的形态n （2 2）用酒精棉球消毒待注射部位）用酒精棉球消毒待注射部位n （3 3）皮下多点注射，每点注射量应小于）皮下多点注射，每点注射量应小于0.1mL0.1mLn 初级免疫后仔细观察小鼠对外源抗原的反应，初级免疫后仔细观察小鼠对外源抗原的反应，两周后进行加强免疫两周后进行加强免疫n加强免疫初级免疫后两周进行。加强免疫初级免疫后两周进行。n取取1.5mL1.5mL蛋白与蛋白与1.5mL1.5mL不完全佐

45、剂混合震荡混匀，制成油包水不完全佐剂混合震荡混匀，制成油包水的形态。的形态。n加强免疫小鼠背部多点皮下注射，加强免疫小鼠背部多点皮下注射，0.15mL/0.15mL/只小鼠只小鼠n （1 1）用酒精棉球消毒待注射部位）用酒精棉球消毒待注射部位n （2 2）皮下多点注射，每点注射量应小于）皮下多点注射，每点注射量应小于0.1mL0.1mL。n第二次加强免疫加强免疫一周后进行。操作相同。第二次加强免疫加强免疫一周后进行。操作相同。n第二次加强免疫后一周，即可采血，收集抗血清。第二次加强免疫后一周，即可采血，收集抗血清。n小鼠取血。收集的血液置于室温下小鼠取血。收集的血液置于室温下1h1h左右，凝固

46、后，置左右，凝固后，置44下，析出血清，离心，下，析出血清，离心，3000rpm,10min3000rpm,10min。吸出血清，分装。吸出血清，分装（0.050.050.2mL0.2mL），贮于），贮于2020以下冰箱保存。以下冰箱保存。免疫自稳 清除损伤或衰老细胞 自身免疫性疾病免疫反应性（immunoreactivity）是指抗原与相应免疫应答产物(即抗体)在体内或体外发生特异性结合反应的能力。一抗杂交初级抗体（第一抗体）是特异性的。倒掉一抗溶液，用PBS漂洗液滤膜3次，每次10min。9%生理盐水溶解配置（加少量NaOH促溶）（周二上、周五上）。加强免疫初级免疫后两周进行。体内反应可介

47、导吞噬、溶菌、杀菌、中和毒素等作用；2mL），贮于20以下冰箱保存。单向扩射免疫法 以不同稀释度的抗血清与优质标记抗原混合，孵育24h后，测定其结合率。人们用类似的方法，对RNA和蛋白质进行印迹分析，对RNA的印迹分析称为Northern印迹法，对单向电泳后的蛋白质分子的印迹分析称为Western印迹法，对双向电泳后蛋白质分子的印迹分析称为Eastern印迹法如要获得间接的标记诊断用抗体，则必须用异源动物制备抗体；是检测蛋白质特性、表达与分布的一种最常用的方法。体外反应可出现凝集反应、沉淀反应、补体参与的反应及中和反应等各种不同的反应类型。另一种本身无免疫原性，如氢氧化铝、磷酸钙、矿物油乳剂、

48、表面活性剂等。打孔，加入不同稀释度的抗原量，进行免疫扩散。抗原（antigens，Ag）是指能够刺激机体免疫活性细胞产生抗体或致敏淋巴细胞，并在体内或体外发生特异性反应的物质。目的蛋白与硝酸纤维膜的结合能力弱与蛋白质结合后成为完全抗原。抗体（antibodies，Ab)是专门对抗抗原特异结构的球蛋白，故也称为免疫球蛋白（immunoglobulins,Ig)。由多个抗原决定簇刺激机体，相应地就产生各种各样的单克隆抗体，这些单克隆抗体混杂在一起就是多克隆抗体。免疫监视 清除突变或畸变细胞Western BlotWestern Blot一般流程一般流程n蛋白样品的制备蛋白样品的制备nSDSSDSP

49、AGEPAGEl转膜转膜l封闭封闭l一抗杂交一抗杂交l二抗杂交二抗杂交l底物显色底物显色转移电泳设备 Western Westernblotting blotting 检测抗血清检测抗血清 转膜转膜膜的选择膜的选择尼龙膜尼龙膜硝酸纤硝酸纤维素膜维素膜封闭非特异性抗体结合麻烦封闭非特异性抗体结合麻烦简单快速封闭非特异性抗体结合简单快速封闭非特异性抗体结合价格昂贵价格昂贵价格便宜价格便宜特殊要求下的选择特殊要求下的选择需要更高的蛋白结合率需要更高的蛋白结合率（尼龙膜：（尼龙膜：480g/cm2；硝酸纤维素膜：；硝酸纤维素膜：80g/cm2）目的蛋白与硝酸纤维膜的结合能力弱目的蛋白与硝酸纤维膜的结合

50、能力弱需要更大的机械强度需要更大的机械强度二、印迹法（blotting）免疫应答产物的结构和功能；底物显色被适当保温后的酶标记蛋白质区带，产生可见的、不溶解状态的颜色反应。辣根过氧化物酶EC 1.5mL完全佐剂混合，震荡混匀，制成油包水的形态Westernblotting 检测抗血清收集的血液置于室温下1h左右，凝固后，置4下，过夜（切勿冰冻）析出血清，离心，4000rpm,10min。免疫应答产物的结构和功能；硝酸纤维素膜：80g/cm2）由于动物的遗传性不同，同一抗原对不同动物或同种不同品系动物、或不同个体，产生特异免疫应答的强弱是不同的。学习掌握动物抗血清的制备原理及技术一般实验室采用的