薄层色谱方法课件.ppt

1、薄层色谱法薄层色谱法(TLC)一、薄层色谱法的概述平面色谱平面色谱二、薄层色谱法的技术参数薄层色谱薄层色谱保留值保留值表示方式有：比移值（表示方式有：比移值（Rf)比移值比移值是溶质移动距离与流动相移动距是溶质移动距离与流动相移动距离之比，是薄层色谱的基本离之比，是薄层色谱的基本定性定性参数。参数。薄层色谱法的技术参数包括薄层色谱法的技术参数包括分配系数与容量因分配系数与容量因子子，理论塔板数与塔板高度理论塔板数与塔板高度，分离度分离度，保留值等保留值等。三、薄层色谱法的基本操作薄层板的准备薄层板的准备点样点样展开展开定位定位定性与定量定性与定量样品处理样品处理 （1 1）硅胶）硅胶 普通硅胶

2、普通硅胶和和改性硅胶改性硅胶两种类型。两种类型。改性硅胶改性硅胶（3）其他固定相）其他固定相 为了特殊需要可在制备薄层时加入某些添加剂制备成具有特殊性能的薄层。包括有荧光指示剂，酸、碱或缓冲液，硝酸银溶液和其他。带有荧光指示剂的带有荧光指示剂的薄层在薄层在紫外灯紫外灯下整个薄下整个薄层呈现层呈现荧光荧光，被分离化合物的斑点处的荧光被，被分离化合物的斑点处的荧光被猝灭猝灭而呈而呈暗色暗色。薄层板包括有薄层板包括有预制板预制板和和手工制板手工制板两种。两种。手工制板一般分为手工制板一般分为不含粘合剂的软板不含粘合剂的软板及及含粘合剂的硬板含粘合剂的硬板两种。两种。洗净的玻璃板用洗净的玻璃板用乙醇乙

3、醇擦拭干净，挥干乙擦拭干净，挥干乙醇后，用手动或自动涂布器（最好用自动涂醇后，用手动或自动涂布器（最好用自动涂布器）将已调制好的固定相布器）将已调制好的固定相均匀均匀地涂铺在玻地涂铺在玻璃板上，涂布后的薄层板应璃板上，涂布后的薄层板应水平放置水平放置，室温室温阴干阴干备用。备用。制备薄层板时的注意事项制备薄层板时的注意事项薄层板活化的原因薄层板活化的原因 点样时通常使用点样时通常使用点样针点样针和和毛细管毛细管进行点样。进行点样。毛细管规格毛细管规格(mm)：内径：内径0.1、0.2、0.3、0.4、0.5长度长度100。原点直径原点直径5mm，一般为，一般为3mm（经典薄层）（经典薄层）和和

4、 12mm（高效薄层）。（高效薄层）。展开后的斑点不仅分辨率明显高于点状点展开后的斑点不仅分辨率明显高于点状点样，而且精密准确，为定量分析提供最佳条件。样，而且精密准确，为定量分析提供最佳条件。1.原点直径过大会降低分辨率及分离度；尽原点直径过大会降低分辨率及分离度；尽可能可能避免多次点样避免多次点样。2.点样量：经典薄层一般为点样量：经典薄层一般为15ul，高效薄，高效薄层为层为100500nl，总量不要超载总量不要超载。3.点样速度尽可能快，耗时尽可能短。点样速度尽可能快，耗时尽可能短。注意：注意：ABCD1、展开室、展开室（a）、（b）为线性，（c）为环形，（d）为向心2、展开方式、展开

5、方式线性展开：线性展开：上行展开上行展开、下行展开、下行展开、双向展开双向展开、近水平展开近水平展开、水平展开。、水平展开。3、展开剂、展开剂 展开剂又可称为溶剂系统、流动相或洗脱剂，展开剂又可称为溶剂系统、流动相或洗脱剂，是在平面色谱法中用作流动相的液体。理想的展开是在平面色谱法中用作流动相的液体。理想的展开剂分离样品得到的剂分离样品得到的Rf值应在值应在0.20.8之间。之间。溶剂分成溶剂分成6类：第类：第类为类为电子授受体溶电子授受体溶剂剂；第；第类为类为质子给予体溶剂质子给予体溶剂；第；第类为类为强质子给予体溶剂强质子给予体溶剂；第；第类为类为质子受体溶质子受体溶剂剂；第；第类为类为偶

6、极作用力溶剂偶极作用力溶剂；第；第类为类为惰性溶剂惰性溶剂（即非极性溶剂）。（即非极性溶剂）。（2 2）溶剂强度）溶剂强度 展开剂的选择方法：展开剂的选择方法：三角形法三角形法。根据展开剂、。根据展开剂、固定相及被分离物质三者间的相互影响，三者固定相及被分离物质三者间的相互影响，三者的关系如下：的关系如下：极性极性展开剂展开剂样品样品亲脂性亲脂性活性展开剂选择的步骤：展开剂选择的步骤：4、影响薄层展开的因素、影响薄层展开的因素 产生边缘效应时，只需用展开剂将产生边缘效应时，只需用展开剂将展开展开室及薄层板饱和后室及薄层板饱和后再展开就可以消除。再展开就可以消除。饱和对展开影响很大，因此对展开室

7、的饱和饱和对展开影响很大，因此对展开室的饱和及对薄层的预平衡非常重要。及对薄层的预平衡非常重要。此外，展开时展开室的此外，展开时展开室的密闭密闭也很重要。也很重要。（3 3）温度的影响）温度的影响 展开时环境的温度对薄层色谱的展开影响很小。展开时环境的温度对薄层色谱的展开影响很小。通常在室温下进行展开。通常在室温下进行展开。不同的展开方式，不同的展开条件对平面色谱的不同的展开方式，不同的展开条件对平面色谱的分离效果有明显的影响。分离效果有明显的影响。常规薄层展距为常规薄层展距为1020cm，高效薄层为，高效薄层为510cm。不能放在空气对流强的地方，并且注意避光。不能放在空气对流强的地方，并且

8、注意避光。展开后的薄层板需展开后的薄层板需挥干挥干表面表面多余多余的展开剂，然后的展开剂，然后采用适当的方法对被分离物质进行定位。采用适当的方法对被分离物质进行定位。光学检出法的使用范围：光学检出法的使用范围：光学检出法光学检出法使用方便使用方便，被检出物质不被破坏被检出物质不被破坏，适用于适用于双向展开双向展开，多次展开多次展开等的定位，也宜应用于等的定位，也宜应用于洗脱定量洗脱定量时定位，是平面色谱定位的首选方法。时定位，是平面色谱定位的首选方法。3 3、试剂显色法、试剂显色法 分离后的化合物在紫外光或可见光下不能显示斑分离后的化合物在紫外光或可见光下不能显示斑点，可根据被检出化合物的理化

9、性质选择适当的显点，可根据被检出化合物的理化性质选择适当的显色剂使之生成颜色或荧光稳定、轮廓清楚、灵敏度色剂使之生成颜色或荧光稳定、轮廓清楚、灵敏度高、专属性强的斑点。高、专属性强的斑点。这种方法是通过一种或几种试剂与被检物质产生这种方法是通过一种或几种试剂与被检物质产生化学反应，生成有色物质，是平面色谱广泛应用的化学反应，生成有色物质，是平面色谱广泛应用的定位方法。定位方法。喷雾显色的显色剂溶液以喷雾显色的显色剂溶液以气溶胶气溶胶的形式的形式均匀均匀的喷的喷洒在薄层上。洒在薄层上。（1 1）显色方法：）显色方法：喷雾显色喷雾显色、浸渍显色浸渍显色、超压衍生化等。、超压衍生化等。喷雾显色法务必

10、在喷雾显色法务必在通通风柜风柜中进行。中进行。自动自动喷雾器适用于喷雾器适用于定定量量。手动喷雾器用于定量。手动喷雾器用于定量分析时可能因喷雾不均匀分析时可能因喷雾不均匀而产生较大误差。而产生较大误差。（2 2）显色试剂）显色试剂 显色试剂有显色试剂有通用显色剂通用显色剂和和专属性显色剂专属性显色剂。专属性显色剂专属性显色剂（1）斑点的）斑点的值值 经过经过两种以上两种以上不同组成的展开剂展开后得到的不同组成的展开剂展开后得到的值均与值均与随行对照品随行对照品一致时，才可确定该斑点与随行对一致时，才可确定该斑点与随行对照品是同一化合物。照品是同一化合物。（2）斑点的显色特性）斑点的显色特性 在

11、在自然光或紫外光或荧光或用显色剂自然光或紫外光或荧光或用显色剂后观察斑点后观察斑点颜色与随行对照品比较可以定性。颜色与随行对照品比较可以定性。样品通过薄层分离，并用适当方法定位后，常样品通过薄层分离，并用适当方法定位后，常用以下方法进行定性。用以下方法进行定性。待测物的含量测定方法包括待测物的含量测定方法包括半定量半定量和和定量定量两种。两种。可以从斑点的大小和颜色的深浅与可以从斑点的大小和颜色的深浅与随行对照品随行对照品斑点斑点比较，从而近似的估计样品中待测成分的含量。比较，从而近似的估计样品中待测成分的含量。也可在测出待测物质对照品在薄层上的检出灵敏度也可在测出待测物质对照品在薄层上的检出

12、灵敏度后，对样品中的该成分进行后，对样品中的该成分进行限量检查限量检查。（1 1）半定量）半定量 定量方法分为定量方法分为间接定量间接定量（洗脱测定法）和（洗脱测定法）和直接定直接定量量（原位薄层扫描法）两种。（原位薄层扫描法）两种。（2 2）定量）定量 洗脱测定洗脱测定 此方法是取下色谱上分离的斑点，用溶剂此方法是取下色谱上分离的斑点，用溶剂将化合物的斑点从吸附剂上定量的洗脱下来，将化合物的斑点从吸附剂上定量的洗脱下来，收集洗脱液，并用适当的方法进行测定。收集洗脱液，并用适当的方法进行测定。洗脱测定的步骤：洗脱测定的步骤：a.斑点的定位斑点的定位b.斑点的洗脱斑点的洗脱c.测定方法：紫外分光

13、光度法，比色法等。测定方法：紫外分光光度法，比色法等。原位薄层扫描法原位薄层扫描法 用一束长宽可以调节的一定波长、一定强度的光用一束长宽可以调节的一定波长、一定强度的光照射到薄层斑点上进行整个斑点的扫描，用仪器测照射到薄层斑点上进行整个斑点的扫描，用仪器测量通过斑点或被斑点反射的光束强度的变化达到定量通过斑点或被斑点反射的光束强度的变化达到定量的目的。量的目的。薄层扫描的基本原理薄层扫描的基本原理薄层扫描的基本用途薄层扫描的基本用途a.a.定性定性光谱测定光谱测定b.b.定量定量色谱测定色谱测定四、薄层色谱法的应用四、薄层色谱法的应用 薄层色谱主要应用于医药方面，但在其他方面薄层色谱主要应用于

14、医药方面，但在其他方面也有重要的应用。在其他方面主要又应用于也有重要的应用。在其他方面主要又应用于环境环境有害物质的分析有害物质的分析和和食品分析食品分析。在环境方面应用于农药及农药残留分析、有毒在环境方面应用于农药及农药残留分析、有毒金属测定和多环芳烃测定等方面，对环境保护发金属测定和多环芳烃测定等方面，对环境保护发挥一定的作用。挥一定的作用。在食品分析方面薄层色谱法可应用于分离测定在食品分析方面薄层色谱法可应用于分离测定食品中所含有的碳水化合物、维生素、有机酸、氨食品中所含有的碳水化合物、维生素、有机酸、氨基酸等天然营养成分，也可用于食品添加剂如色素基酸等天然营养成分，也可用于食品添加剂如色素等的分析以及对某些有毒成分的控制。等的分析以及对某些有毒成分的控制。