酶联免疫吸附分析课件.pptx

1、 抗原：抗原：抗原是指进入人或动物机体后，可刺激机体免疫系统发生免疫应答，从而引起动物产生抗体或形成致敏淋巴细胞，并能和抗体或致敏淋巴细胞发生特异性反应的物质。抗体：抗体：是由抗原刺激动物的免疫系统后，由免疫系统产生分泌的能和相应抗原发生特异性结合的免疫球蛋白。抗原抗体的基本特性：a、反应的特异性；b、反应的等比例性抗原-抗体识别反应示意图 它采用抗原与抗体的特异反应将待测物与酶连接，然后它采用抗原与抗体的特异反应将待测物与酶连接，然后通过酶与底物产生颜色反应，用于定量测定。测定的对象可通过酶与底物产生颜色反应，用于定量测定。测定的对象可以是抗体也可以是抗原。以是抗体也可以是抗原。在这种测定方

2、法中有在这种测定方法中有3种必要的试剂：种必要的试剂：固相的抗原或抗体（免疫吸附剂）固相的抗原或抗体（免疫吸附剂）酶标记的抗原或抗体（标记物）酶标记的抗原或抗体（标记物）酶作用的底物（显色剂）酶作用的底物（显色剂）一、一、ELISA原理原理 测量时，抗原（抗体）先结合在固相载体上，但仍保测量时，抗原（抗体）先结合在固相载体上，但仍保留其免疫活性，然后加一种抗体（抗原）与酶结合成的偶留其免疫活性，然后加一种抗体（抗原）与酶结合成的偶联物（标记物），此偶联物仍保留其原免疫活性与酶活性，联物（标记物），此偶联物仍保留其原免疫活性与酶活性，当偶联物与固相载体上的抗原（抗体）反应结合后，当偶联物与固相载

3、体上的抗原（抗体）反应结合后，再加上酶的再加上酶的相应底物，相应底物，即起催化水即起催化水解或氧化还解或氧化还原反应而呈原反应而呈颜色。颜色。ELISA原理原理 其所生成的颜色深浅与欲测其所生成的颜色深浅与欲测的抗原（抗体）含量成正比。的抗原（抗体）含量成正比。这种有色产物可用肉眼、光这种有色产物可用肉眼、光学显微镜、电子显微镜观察，也学显微镜、电子显微镜观察，也可以用分光光度计（酶标仪）加可以用分光光度计（酶标仪）加以测定。以测定。方法简单，方便迅速，特异性方法简单，方便迅速，特异性强。强。ELISA原理原理酶及其底物酶及其底物 酶结合物（过碘酸盐氧化法、戊二醛交联法）是酶与抗体酶结合物（过

4、碘酸盐氧化法、戊二醛交联法）是酶与抗体或抗原在交联剂作用下联结的产物。是或抗原在交联剂作用下联结的产物。是ELISA成败的关键试剂，成败的关键试剂，它不仅具有抗体抗原特异的免疫反应，还具有酶促反应，显示它不仅具有抗体抗原特异的免疫反应，还具有酶促反应，显示出生物放大作用，但不同的酶选用不同的底物出生物放大作用，但不同的酶选用不同的底物，将得到不同，将得到不同的颜色反应。的颜色反应。ELISA原理原理酶酶 底底 物物显色反显色反应应 测定波长测定波长 辣根过氧化物酶辣根过氧化物酶 邻苯二胺邻苯二胺四甲替联苯胺四甲替联苯胺氨基水杨酸氨基水杨酸邻联苯甲胺邻联苯甲胺2,22,2-连胺基连胺基-2(3-

5、2(3-乙基乙基-并噻唑并噻唑啉磺酸啉磺酸-6)-6)铵盐铵盐 橘红色橘红色黄色黄色棕色棕色兰色兰色蓝绿色蓝绿色492492460460449449425425642642碱性磷酸酯酶碱性磷酸酯酶 4-4-硝基酚磷酸盐硝基酚磷酸盐(PNP)(PNP)萘酚萘酚-AS-Mx-AS-Mx磷酸盐磷酸盐+重氮盐重氮盐 黄色黄色红色红色 400400500 500 葡萄糖氧化酶葡萄糖氧化酶 ABTS+HRP+ABTS+HRP+葡萄糖葡萄糖葡萄糖葡萄糖+甲硫酚嗪甲硫酚嗪+噻唑兰噻唑兰 黄色黄色深蓝色深蓝色 405405420 420-半乳糖苷半乳糖苷酶酶 甲基伞酮基半乳糖苷甲基伞酮基半乳糖苷(4MuG)(4

6、MuG)硝基酚半乳糖苷硝基酚半乳糖苷(ONPG)(ONPG)荧光荧光黄色黄色 360,450360,450420420 ELISA的种类和变化的种类和变化 （一）双抗体夹心法（一）双抗体夹心法（二）间接法（二）间接法（三）竞争法（三）竞争法 （四）双位点一步法（四）双位点一步法（五）捕获法测（五）捕获法测IgMIgM抗体抗体（六）应用亲和素和生物素的（六）应用亲和素和生物素的ELISAELISA （一）双抗体夹心法（一）双抗体夹心法此法适用于检验各种蛋白质等大分子此法适用于检验各种蛋白质等大分子抗原抗原获得待分析物的未标定抗体获得待分析物的未标定抗体将特异性抗体与固相将特异性抗体与固相载体连接

7、形成固相抗体载体连接形成固相抗体 洗涤除去未结合的洗涤除去未结合的抗体及杂质抗体及杂质 加入封闭蛋白溶液以封闭载体加入封闭蛋白溶液以封闭载体表面残留的蛋白结合位点表面残留的蛋白结合位点洗涤并除去未结合的封闭蛋白洗涤并除去未结合的封闭蛋白加受检标本（抗原）形成加受检标本（抗原）形成固相抗体抗原复合物固相抗体抗原复合物 洗涤除去其他洗涤除去其他未结合的物质未结合的物质 加酶标抗体生成加酶标抗体生成抗体抗体待测抗原待测抗原酶标记抗体酶标记抗体的复合物的复合物 彻底洗涤彻底洗涤未结合的未结合的 酶标抗体酶标抗体 加底物进行加底物进行酶催化反应酶催化反应 根据颜色反应的根据颜色反应的程度进行该抗原程度进

8、行该抗原的定性或定量测定的定性或定量测定 间接法是检测间接法是检测抗体抗体最常用的方法，最常用的方法，其原理为利用酶标其原理为利用酶标记的抗抗体以检测记的抗抗体以检测已与固相抗原结合已与固相抗原结合的受检抗体，故称的受检抗体，故称为间接法。为间接法。（二）间接法（二）间接法用NaOH终止酶反应后，黄色可稳定一时间。定量测定的ELISA试剂盒应含有制作标准曲线用的标准品，应包括覆盖可检测范围的4-5个浓度，一般均配入含蛋白保护剂及防腐剂的缓冲液中。加入封闭蛋白溶液以封闭载体载体对不同蛋白质的吸附能力是不相同的，大分子蛋白质较小分子蛋白质通常含有更多的疏水基团，故更易吸附到固相载体表面。抗体或蛋白

9、质等抗原是通过物理吸附与聚苯乙烯等固相载体结合的，靠的是蛋白质分子结构上的疏水基团与固相载体表面的疏水基团间的相互作用。TMB性质较稳定，可配成溶液试剂，只需与H2O2溶液混和即成应用液，可直接作底物使用。换言之，包被即是抗原或抗体结合到固相载体表面的过程。抗体或蛋白质等抗原是通过物理吸附与聚苯乙烯等固相载体结合的，靠的是蛋白质分子结构上的疏水基团与固相载体表面的疏水基团间的相互作用。例如，在测定血清中某一物质的含量时，化学比色法的敏感度为mg/ml水平，酶反应测定法的敏感度约为5-10g/ml。对照管由于只加酶标抗原，与固相抗体充分结合，故分解底物显色深；再加上酶的相应底物，即起催化水解或氧

10、化还原反应而呈颜色。这是一个逐步平衡的过程，因此需经扩散才能达到反应的终点。高质量的速溶食用低脂奶粉即可直接当作封闭剂使用，但由于奶粉的成份复杂，而且封闭后的载体不易长期保存，因此在试剂盒的制备中较少应用。OPD氧化后的产物呈橙红色，用酸终止酶反应后，在492nm处有最高吸收峰，灵敏度高，比色方便，是HRP结合物最常用的底物。酶结合物（过碘酸盐氧化法、戊二醛交联法）是酶与抗体或抗原在交联剂作用下联结的产物。底物液受光照会自行变色，显色反应应避光进行，显色反应结束时加入终止液终止反应。研究表明，脱脂奶粉也是一种良好的封闭剂，其最大的特点是价廉，可以高浓度使用（5%）。根据对照管与测定管吸光度值之

11、比，酶作用的底物（显色剂）由于两者在化学结构和空间构型上呈互补关系，所以抗原抗体反应具有高度的特异性。包被固相载体包被固相载体:用已知抗原包被用已知抗原包被固相载体固相载体 加待检标本加待检标本:使相应抗体与固相抗原结合使相应抗体与固相抗原结合洗涤，除去无关的物质洗涤，除去无关的物质 加酶标抗抗体加酶标抗抗体:与固相载体上抗原抗体与固相载体上抗原抗体复合物结合；洗涤，除去复合物结合；洗涤，除去未结合的酶标抗抗体未结合的酶标抗抗体 加底物加底物显色显色 根据颜色反应的程度进行根据颜色反应的程度进行该抗原的定性或定量测定该抗原的定性或定量测定ELISAELISA法法间接法测定抗体间接法测定抗体1.

12、1.原理原理（三）竞争法（三）竞争法 对照管由于只加酶标抗原，与固相抗体充分结合，故分解底物对照管由于只加酶标抗原，与固相抗体充分结合，故分解底物显色深；测定管的显色程度则随待测抗原和酶标抗原与固相抗体竞显色深；测定管的显色程度则随待测抗原和酶标抗原与固相抗体竞争结合的结果而异。如待测抗原量多，竞争性地抑制酶标抗原与固争结合的结果而异。如待测抗原量多，竞争性地抑制酶标抗原与固相抗体结合，使固相上结合的酶标抗原量减少。因此，加入底物后相抗体结合，使固相上结合的酶标抗原量减少。因此，加入底物后显色反应较弱。显色反应较弱。用已知特异性用已知特异性抗体包被抗体包被固相载体固相载体 测定管加待测抗原和测

13、定管加待测抗原和一定量的酶标抗原使二者与一定量的酶标抗原使二者与固相抗体竞争结合固相抗体竞争结合 对照管只加一定量酶标抗原对照管只加一定量酶标抗原与固相抗体直接结合与固相抗体直接结合 分别洗涤分别洗涤除去未结合除去未结合的成分的成分 加底物显色加底物显色分别测定两管的吸光度值，分别测定两管的吸光度值，根据对照管与测定管吸光度值之比，根据对照管与测定管吸光度值之比，计算标本中待测抗原含量计算标本中待测抗原含量ELISAELISA特点一：特点一：灵敏性灵敏性 该测定法的灵敏度来自作为报告该测定法的灵敏度来自作为报告基团基团的酶。的酶。酶是一种有机催化剂，很少量的酶即可诱导大酶是一种有机催化剂，很少

14、量的酶即可诱导大量的催化反应量的催化反应 ，产生可供观察的显色反应现象。，产生可供观察的显色反应现象。因此该体系常被称为因此该体系常被称为酶放大体系酶放大体系。ELISAELISA实现了实现了在细胞或亚细胞水平上示踪抗原或抗体的所在在细胞或亚细胞水平上示踪抗原或抗体的所在部位，或在微克、甚至纳克水平上对其进行定部位，或在微克、甚至纳克水平上对其进行定量。量。例如，在测定血清中某一物质的含量时，例如，在测定血清中某一物质的含量时，化学比色法的敏感度为化学比色法的敏感度为mg/ml水平，酶反应测定水平，酶反应测定法的敏感度约为法的敏感度约为5-10g/ml 。特点二：特点二：特异性特异性 其特异性

15、来自抗体或抗原的选择性。其特异性来自抗体或抗原的选择性。抗原抗体的结合实质上只发生在抗原的抗原抗体的结合实质上只发生在抗原的抗原决定簇与抗体的抗原结合位点之间。抗原决定簇与抗体的抗原结合位点之间。由于两者在化学结构和空间构型上呈互由于两者在化学结构和空间构型上呈互补关系，所以抗原抗体反应具有高度的补关系，所以抗原抗体反应具有高度的特异性。特异性。ELISA要有三个必要的试剂，即要有三个必要的试剂，即免疫吸附剂免疫吸附剂、结合物结合物和和酶酶的底物的底物。完整的完整的ELISA试剂盒应包含以下各组分：试剂盒应包含以下各组分：（1）已包被抗原或抗体的固相载体（免疫吸附剂，俗称酶）已包被抗原或抗体的

16、固相载体（免疫吸附剂，俗称酶标板）；标板）；（2）酶标记的抗原或抗体（酶标记物）；）酶标记的抗原或抗体（酶标记物）；（3）酶的底物；）酶的底物；（4）系列参考标准品（定量测定）；）系列参考标准品（定量测定）；（5）酶标记物及样本的稀释液；）酶标记物及样本的稀释液；（6）洗涤液；）洗涤液；（7）反应终止液。）反应终止液。二、ELISA试剂ELISA试剂盒试剂盒ELISA试剂的作用试剂的作用 2.1 免疫吸附剂：免疫吸附剂：已包被抗原或抗体的固相载体，是已包被抗原或抗体的固相载体，是ELISA方法中的核心试剂。方法中的核心试剂。固相载体：固相载体：固相载体在固相载体在ELISA测定过程中作为吸附剂

17、和容器，不参与化学反测定过程中作为吸附剂和容器，不参与化学反应。可作应。可作ELISA中载体的材料很多，最常用的是聚苯乙烯。专用于中载体的材料很多，最常用的是聚苯乙烯。专用于EILSA的产品称为的产品称为ELISA板，国际上标准的微量滴定板为板，国际上标准的微量滴定板为812的的96孔孔式。式。良好的良好的ELISA板应该是吸附性能好，空白值低，孔底透明度高，各板应该是吸附性能好，空白值低，孔底透明度高，各板之间、同一板各孔之间、同一板各孔之间性能相近。板之间、同一板各孔之间、同一板各孔之间性能相近。包被包被 将抗原或抗体固定化的过程称为包被将抗原或抗体固定化的过程称为包被(coating)。

18、换言之，。换言之，包被即是抗原或抗体结合到固相载体表面的过程。包被即是抗原或抗体结合到固相载体表面的过程。抗体或蛋白质等抗原是通过物理吸附与聚苯乙烯等固相抗体或蛋白质等抗原是通过物理吸附与聚苯乙烯等固相载体结合的，靠的是蛋白质分子结构上的疏水基团与固载体结合的，靠的是蛋白质分子结构上的疏水基团与固相载体表面的疏水基团间的相互作用。这种物理吸附是相载体表面的疏水基团间的相互作用。这种物理吸附是非特异性的，受蛋白质的分子量、等电点、浓度等的影非特异性的，受蛋白质的分子量、等电点、浓度等的影响。响。载体对不同蛋白质的吸附能力是不相同的，大分子蛋白载体对不同蛋白质的吸附能力是不相同的，大分子蛋白质较小

19、分子蛋白质通常含有更多的疏水基团，故更易吸质较小分子蛋白质通常含有更多的疏水基团，故更易吸附到固相载体表面。附到固相载体表面。封闭封闭 封闭封闭(blocking)是继包被之后用高浓度的无关蛋白质溶液再是继包被之后用高浓度的无关蛋白质溶液再包被固相载体表面剩余吸附位点的过程。包被固相载体表面剩余吸附位点的过程。蛋白质抗原或抗体包被时所用的一般浓度较低，吸收后固相蛋白质抗原或抗体包被时所用的一般浓度较低，吸收后固相载体表面尚有未被占据的吸附位点，载体表面尚有未被占据的吸附位点，封闭就是让大量不相关封闭就是让大量不相关的蛋白质充填这些吸附位点，从而排斥在的蛋白质充填这些吸附位点，从而排斥在ELIS

20、A其后的步骤其后的步骤中干扰物质的再吸附，增加中干扰物质的再吸附，增加ELISA反应得专一性和灵敏度。反应得专一性和灵敏度。封闭的程序与包被过程相类似。最常用的封闭剂是封闭的程序与包被过程相类似。最常用的封闭剂是0.05%-0.5%的牛血清白蛋白。研究表明，脱脂奶粉也是一种良好的的牛血清白蛋白。研究表明，脱脂奶粉也是一种良好的封闭剂，其最大的特点是价廉，可以高浓度使用（封闭剂，其最大的特点是价廉，可以高浓度使用（5%）。）。高质量的速溶食用低脂奶粉即可直接当作封闭剂使用，但由高质量的速溶食用低脂奶粉即可直接当作封闭剂使用，但由于奶粉的成份复杂，而且封闭后的载体不易长期保存，因此于奶粉的成份复杂

21、，而且封闭后的载体不易长期保存，因此在试剂盒的制备中较少应用。在试剂盒的制备中较少应用。ELISA法间接法测定抗体该测定法的灵敏度来自作为报告基团的酶。因此，加入底物后显色反应较弱。良好的酶标记物应该是既保有酶的催化活性，也保持了抗体（或抗原）的免疫活性。间接法是检测抗体最常用的方法，其原理为利用酶标记的抗抗体以检测已与固相抗原结合的受检抗体，故称为间接法。抗原抗体的基本特性：a、反应的特异性；此外酶标记物还要有良好的稳定性。上式中，DH2为供氢体，H2O2为受氢体。该抗原的定性或定量测定ELISA实现了在细胞或亚细胞水平上示踪抗原或抗体的所在部位，或在微克、甚至纳克水平上对其进行定量。用Na

22、OH终止酶反应后，黄色可稳定一时间。（六）应用亲和素和生物素的ELISAABTS+HRP+葡萄糖葡萄糖+甲硫酚嗪+噻唑兰抗体或蛋白质等抗原是通过物理吸附与聚苯乙烯等固相载体结合的，靠的是蛋白质分子结构上的疏水基团与固相载体表面的疏水基团间的相互作用。这种物理吸附是非特异性的，受蛋白质的分子量、等电点、浓度等的影响。对照管由于只加酶标抗原，与固相抗体充分结合，故分解底物显色深；加入封闭蛋白溶液以封闭载体根据对照管与测定管吸光度值之比，对照管由于只加酶标抗原，与固相抗体充分结合，故分解底物显色深；橘红色黄色棕色兰色蓝绿色2.2 酶标记物酶标记物 即酶标记的抗原或抗体，是即酶标记的抗原或抗体，是EL

23、ISA中最关键的试剂。良好的中最关键的试剂。良好的酶标记物应该是既保有酶标记物应该是既保有酶的催化活性酶的催化活性，也保持了抗体（或抗也保持了抗体（或抗原）的免疫活性。原）的免疫活性。酶标记物中酶与抗体（或抗原）之间有恰当的分子比例，在酶标记物中酶与抗体（或抗原）之间有恰当的分子比例，在酶标记物中应尽量不含有或少含有游离的（未结合的）酶或酶标记物中应尽量不含有或少含有游离的（未结合的）酶或游离的抗体（或抗原）。游离的抗体（或抗原）。此外酶标记物还要有良好的稳定性。在此外酶标记物还要有良好的稳定性。在ELISA中，常用的酶中，常用的酶为辣根过氧化物酶为辣根过氧化物酶(horseradish pe

24、roxidase,HRP)和碱性磷酸和碱性磷酸酶酶(alkaline phosohatase,AP)。2.3 酶的底物酶的底物 2.3.1、HRP的底物的底物HRP催化过氧化物的氧化反应，最具代表性的过氧化物为催化过氧化物的氧化反应，最具代表性的过氧化物为H2O2，其反应式如下：，其反应式如下：DH2+H2O2 D+H2O 上式中，上式中，DH2为供氢体，为供氢体，H2O2为受氢体。在为受氢体。在ELISA中，中，DH2一般为无色化合物，经酶作用后成为有色的产物，以便作比一般为无色化合物，经酶作用后成为有色的产物，以便作比色测定。常用的供氢体有邻苯二胺色测定。常用的供氢体有邻苯二胺(O-phe

25、nylenediamine,OPD)、四甲基联苯胺、四甲基联苯胺(3,3,5,5-tetramethylbenzidine,TMB)2.3.1 HRP的底物的底物OPD氧化后的产物呈氧化后的产物呈橙红色橙红色，用酸终止酶反应后，在，用酸终止酶反应后，在492nm处有处有最高吸收峰，灵敏度高，比色方便，是最高吸收峰，灵敏度高，比色方便，是HRP结合物最常用的底物。结合物最常用的底物。OPD见光易变质，与过氧化氢混合成底物应用液后更不稳定，须见光易变质，与过氧化氢混合成底物应用液后更不稳定，须现配置现用。现配置现用。TMB经经HRP作用后产物显作用后产物显蓝色蓝色，酶反应用，酶反应用HCl或或H2

26、SO4终止后，终止后，TMB产物由蓝色呈产物由蓝色呈黄色黄色，可在比色计中定量，最适吸收波长为，可在比色计中定量，最适吸收波长为405nm。TMB性质较稳定，可配成溶液试剂，只需与性质较稳定，可配成溶液试剂，只需与H2O2溶液混溶液混和即成应用液，可直接作底物使用。另外，和即成应用液，可直接作底物使用。另外，TMB又有无致癌性等又有无致癌性等优点，因此在优点，因此在ELISA中应用日趋广泛。中应用日趋广泛。AP的底物的底物AP为磷酸酯酶，一般采用对硝基苯磷酸酯为磷酸酯酶，一般采用对硝基苯磷酸酯(p-nitrophenyl phosphate,p-NPP)作为底物，可制成片剂，使用方便。产物为作

27、为底物，可制成片剂，使用方便。产物为黄色的对硝基酚，在黄色的对硝基酚，在405nm波长处有吸收峰。用波长处有吸收峰。用NaOH终止酶终止酶反应后，黄色可稳定一时间。反应后，黄色可稳定一时间。2.5 洗涤液洗涤液涤液多为含非离子型洗涤剂的中性缓冲液。涤液多为含非离子型洗涤剂的中性缓冲液。聚苯乙烯载体与蛋白质的结合是疏水性的，非离子型洗涤剂聚苯乙烯载体与蛋白质的结合是疏水性的，非离子型洗涤剂既含疏水基团，也含亲水基团，其疏水基团与蛋白质的疏水既含疏水基团，也含亲水基团，其疏水基团与蛋白质的疏水基团借疏水键结合，从而削弱蛋白质与固相载体的结合，并基团借疏水键结合，从而削弱蛋白质与固相载体的结合，并借

28、助于亲水基团和水分子的结合作用，使蛋白质回复到水溶借助于亲水基团和水分子的结合作用，使蛋白质回复到水溶液状态，从而脱离固相载体。液状态，从而脱离固相载体。洗涤液中的非离子型洗涤剂一般是吐温洗涤液中的非离子型洗涤剂一般是吐温20，其浓度可在，其浓度可在0.05%-0.2%之间，高于之间，高于0.2%时，可使包被在固相上的抗原或时，可使包被在固相上的抗原或抗体解吸附而减低试验的灵敏度。抗体解吸附而减低试验的灵敏度。2.6 对照品对照品 阴性对照品须先行检测，确定其中不含待测物质。例如阴性对照品须先行检测，确定其中不含待测物质。例如HBsAg检测的阴性对照品中不可含检测的阴性对照品中不可含HBsAg

29、。阳性对照品多以含蛋白保护剂的缓冲液为基质，其中加入一阳性对照品多以含蛋白保护剂的缓冲液为基质，其中加入一定量的待检物质，此量最好在试剂说明书中标明。加入的量定量的待检物质，此量最好在试剂说明书中标明。加入的量应与试剂的敏感度相称。国外检测应与试剂的敏感度相称。国外检测HBsAg的的ELISA试剂盒检试剂盒检测敏感度约为测敏感度约为0.5 ng/ml，阳性对照品中含量约为，阳性对照品中含量约为10 ng/ml。在。在对照品中一般加入抗生素和防腐剂，以利保存。对照品中一般加入抗生素和防腐剂，以利保存。2.7 标准品标准品 定量测定的定量测定的ELISA试剂盒应含有制作标准曲线用的标准品，试剂盒应

30、含有制作标准曲线用的标准品，应包括覆盖可检测范围的应包括覆盖可检测范围的4-5个浓度，一般均配入含蛋白保护个浓度，一般均配入含蛋白保护剂及防腐剂的缓冲液中。剂及防腐剂的缓冲液中。1 1、样品的采集与保存、样品的采集与保存2 2、试剂的准备、试剂的准备3 3、包被、包被4 4、加样、加样在在ELISAELISA实验中一般有实验中一般有5 5次加样步聚，即加标准品、加样次加样步聚，即加标准品、加样本、加酶标记物、加底物、加反应终止液。本、加酶标记物、加底物、加反应终止液。三、三、ELISA实验过程实验过程4、保温、保温在在ELISA中一般加标本和加酶标记物后会有一次抗原抗体反应。中一般加标本和加酶

31、标记物后会有一次抗原抗体反应。抗原抗体反应的完成需要有一定的温度和时间，这一保温过程称为抗原抗体反应的完成需要有一定的温度和时间，这一保温过程称为温育温育(incubation)。ELISA属固相免疫测定，抗原、抗体的结合只在固相表面上发生。属固相免疫测定，抗原、抗体的结合只在固相表面上发生。加入板孔中的标本，其中的抗原并不是都有均等的和固相抗结合的加入板孔中的标本，其中的抗原并不是都有均等的和固相抗结合的机会，只有最贴近孔壁的一层溶液中的抗原直接与抗体接触。这是机会，只有最贴近孔壁的一层溶液中的抗原直接与抗体接触。这是一个逐步平衡的过程，因此需经扩散才能达到反应的终点。在其后一个逐步平衡的过

32、程，因此需经扩散才能达到反应的终点。在其后加入的酶标记抗体与固相抗原的结合也同样如此。这就是为什么加入的酶标记抗体与固相抗原的结合也同样如此。这就是为什么ELISA反应总是需要一定时间的温育。反应总是需要一定时间的温育。5、洗涤、洗涤目的：目的：分离游离的酶标记物。通过洗涤以清除残留在板孔中没能分离游离的酶标记物。通过洗涤以清除残留在板孔中没能与固相抗原或抗体结合的物质，以及在反应过程中非特异性地吸附于与固相抗原或抗体结合的物质，以及在反应过程中非特异性地吸附于固相载体的干扰物质。聚苯乙烯等塑料对蛋白质的吸附是普遍性的，固相载体的干扰物质。聚苯乙烯等塑料对蛋白质的吸附是普遍性的，而在洗涤时又应

33、把这种非特异性吸附的干扰物质洗涤下来。而在洗涤时又应把这种非特异性吸附的干扰物质洗涤下来。洗涤的方式洗涤的方式：自动洗涤仪自动洗涤仪与与手工操作手工操作。a.吸干或甩干孔内反应液；吸干或甩干孔内反应液；b.用洗涤液过洗一遍用洗涤液过洗一遍;c.浸泡，即将洗涤液注满板孔，放置浸泡，即将洗涤液注满板孔，放置1-2分钟，分钟，间歇摇动，浸泡时间不可随意缩短；间歇摇动，浸泡时间不可随意缩短；d.吸干孔内液体吸干孔内液体;e.重复操作重复操作c和和d，洗涤，洗涤3-4次（或按说明规定）。次（或按说明规定）。6、显色和比色、显色和比色显色显色显色是显色是ELISA中的最后一步温育反应，此时酶催化无色的底物

34、生成中的最后一步温育反应，此时酶催化无色的底物生成有色的产物。反应的温度和时间仍是影响显色的因素。在定量测定有色的产物。反应的温度和时间仍是影响显色的因素。在定量测定中，加入底物后的反应温度和时间应按规定力求准确。中，加入底物后的反应温度和时间应按规定力求准确。底物显色一般在室外温或底物显色一般在室外温或37反应反应20-30分钟后即不再加深，约分钟后即不再加深，约40分钟将达到显色的顶峰，再延长反应时间，可使本底值增高。底物分钟将达到显色的顶峰，再延长反应时间，可使本底值增高。底物液受光照会自行变色，显色反应应避光进行，显色反应结束时加入液受光照会自行变色，显色反应应避光进行，显色反应结束时

35、加入终止液终止反应。产物用各类酸性终止液终止后会使蓝色转变成黄终止液终止反应。产物用各类酸性终止液终止后会使蓝色转变成黄色，此时可用特定的波长（色，此时可用特定的波长（450nm）测读吸光值。）测读吸光值。酶标比色仪酶标比色仪 酶标比色仪简称酶标仪，通常指专用于测读酶标比色仪简称酶标仪，通常指专用于测读ELISAELISA结果吸光结果吸光度的光度计。度的光度计。进行进行ELISAELISA分析时，酶和酶的底物结合时便产生呈分析时，酶和酶的底物结合时便产生呈色反应，凡应后用酶标仪测定反应液的吸光度，是色反应，凡应后用酶标仪测定反应液的吸光度，是“专业化专业化”的的光度计。光度计。DNM-9602

36、 DNM-9602 标配酶标分析仪标配酶标分析仪 DNM-9602ADNM-9602A酶标分析仪酶标分析仪结果判定结果判定定性测定：定性测定：1）间接法和夹心法。间接法和夹心法。在间接法和夹心法的在间接法和夹心法的ELISA反应体系反应体系中，反应的定性结果可以用肉眼直接判断。中，反应的定性结果可以用肉眼直接判断。若待检孔显色浅于或等于阴性对照判定为阴性若待检孔显色浅于或等于阴性对照判定为阴性 若待检孔显色深于或等于阳性对照孔则判定为阳性若待检孔显色深于或等于阳性对照孔则判定为阳性 若待检孔显色介于阴性对照孔和阳性对照孔之间则判定若待检孔显色介于阴性对照孔和阳性对照孔之间则判定为弱阳性为弱阳性

37、2）竞争法。竞争法。与间接法和夹心法与间接法和夹心法ELISA检测相反，在竞争法检测相反，在竞争法ELISA中阴性孔呈色要深于阳性孔。中阴性孔呈色要深于阳性孔。定量测定定量测定在定量测定中，每批测试均须用一系列不同浓度的参考标准品在在定量测定中，每批测试均须用一系列不同浓度的参考标准品在相同的条件下制作标准曲线。测定大分子量物质的夹心法相同的条件下制作标准曲线。测定大分子量物质的夹心法ELISA，标准曲线的范围一般较宽，曲线最高点的吸光度可接近标准曲线的范围一般较宽，曲线最高点的吸光度可接近2.0，绘，绘制时常用半对数纸，制时常用半对数纸，以检测物的浓度为横坐标，以吸光度为纵坐以检测物的浓度为

38、横坐标，以吸光度为纵坐标标，将各浓度的值逐点连接，所得曲线一般呈，将各浓度的值逐点连接，所得曲线一般呈S形，其头、尾部形，其头、尾部曲线趋于平坦，曲线趋于平坦，中央较呈直线的部分是最理想的检测区域。中央较呈直线的部分是最理想的检测区域。包被固相载体包被固相载体:用已知抗原包被用已知抗原包被固相载体固相载体 加待检标本加待检标本:使相应抗体与固相抗原结合使相应抗体与固相抗原结合洗涤，除去无关的物质洗涤，除去无关的物质 加酶标抗抗体加酶标抗抗体:与固相载体上抗原抗体与固相载体上抗原抗体复合物结合；洗涤，除去复合物结合；洗涤，除去未结合的酶标抗抗体未结合的酶标抗抗体 加底物加底物显色显色 根据颜色反

39、应的程度进行根据颜色反应的程度进行该抗原的定性或定量测定该抗原的定性或定量测定这是一个逐步平衡的过程，因此需经扩散才能达到反应的终点。邻苯二胺四甲替联苯胺氨基水杨酸邻联苯甲胺2,2-连胺基-2(3-乙基-并噻唑啉磺酸-6)铵盐底物液受光照会自行变色，显色反应应避光进行，显色反应结束时加入终止液终止反应。（六）应用亲和素和生物素的ELISA例如，在测定血清中某一物质的含量时，化学比色法的敏感度为mg/ml水平，酶反应测定法的敏感度约为5-10g/ml。用NaOH终止酶反应后，黄色可稳定一时间。聚苯乙烯等塑料对蛋白质的吸附是普遍性的，而在洗涤时又应把这种非特异性吸附的干扰物质洗涤下来。间歇摇动，浸

40、泡时间不可随意缩短；是ELISA成败的关键试剂，它不仅具有抗体抗原特异的免疫反应，还具有酶促反应，显示出生物放大作用，但不同的酶选用不同的底物，将得到不同的颜色反应。计算标本中待测抗原含量在其后加入的酶标记抗体与固相抗原的结合也同样如此。这种有色产物可用肉眼、光学显微镜、电子显微镜观察，也可以用分光光度计（酶标仪）加以测定。专用于EILSA的产品称为ELISA板，国际上标准的微量滴定板为812的96孔式。OPD见光易变质，与过氧化氢混合成底物应用液后更不稳定，须现配置现用。若待检孔显色深于或等于阳性对照孔则判定为阳性酶标记物中酶与抗体（或抗原）之间有恰当的分子比例，在酶标记物中应尽量不含有或少

41、含有游离的（未结合的）酶或游离的抗体（或抗原）。例如，在测定血清中某一物质的含量时，化学比色法的敏感度为mg/ml水平，酶反应测定法的敏感度约为5-10g/ml。4、保温在ELISA中一般加标本和加酶标记物后会有一次抗原抗体反应。底物液受光照会自行变色，显色反应应避光进行，显色反应结束时加入终止液终止反应。如待测抗原量多，竞争性地抑制酶标抗原与固相抗体结合，使固相上结合的酶标抗原量减少。（三）竞争法（三）竞争法 对照管由于只加酶标抗原，与固相抗体充分结合，故分解底物对照管由于只加酶标抗原，与固相抗体充分结合，故分解底物显色深；测定管的显色程度则随待测抗原和酶标抗原与固相抗体竞显色深；测定管的显

42、色程度则随待测抗原和酶标抗原与固相抗体竞争结合的结果而异。如待测抗原量多，竞争性地抑制酶标抗原与固争结合的结果而异。如待测抗原量多，竞争性地抑制酶标抗原与固相抗体结合，使固相上结合的酶标抗原量减少。因此，加入底物后相抗体结合，使固相上结合的酶标抗原量减少。因此，加入底物后显色反应较弱。显色反应较弱。包被包被 将抗原或抗体固定化的过程称为包被将抗原或抗体固定化的过程称为包被(coating)。换言之，。换言之，包被即是抗原或抗体结合到固相载体表面的过程。包被即是抗原或抗体结合到固相载体表面的过程。抗体或蛋白质等抗原是通过物理吸附与聚苯乙烯等固相抗体或蛋白质等抗原是通过物理吸附与聚苯乙烯等固相载体

43、结合的，靠的是蛋白质分子结构上的疏水基团与固载体结合的，靠的是蛋白质分子结构上的疏水基团与固相载体表面的疏水基团间的相互作用。这种物理吸附是相载体表面的疏水基团间的相互作用。这种物理吸附是非特异性的，受蛋白质的分子量、等电点、浓度等的影非特异性的，受蛋白质的分子量、等电点、浓度等的影响。响。载体对不同蛋白质的吸附能力是不相同的，大分子蛋白载体对不同蛋白质的吸附能力是不相同的，大分子蛋白质较小分子蛋白质通常含有更多的疏水基团，故更易吸质较小分子蛋白质通常含有更多的疏水基团，故更易吸附到固相载体表面。附到固相载体表面。2.3.1 HRP的底物的底物OPD氧化后的产物呈氧化后的产物呈橙红色橙红色，用

44、酸终止酶反应后，在，用酸终止酶反应后，在492nm处有处有最高吸收峰，灵敏度高，比色方便，是最高吸收峰，灵敏度高，比色方便，是HRP结合物最常用的底物。结合物最常用的底物。OPD见光易变质，与过氧化氢混合成底物应用液后更不稳定，须见光易变质，与过氧化氢混合成底物应用液后更不稳定，须现配置现用。现配置现用。TMB经经HRP作用后产物显作用后产物显蓝色蓝色，酶反应用，酶反应用HCl或或H2SO4终止后，终止后，TMB产物由蓝色呈产物由蓝色呈黄色黄色，可在比色计中定量，最适吸收波长为，可在比色计中定量，最适吸收波长为405nm。TMB性质较稳定，可配成溶液试剂，只需与性质较稳定，可配成溶液试剂，只需

45、与H2O2溶液混溶液混和即成应用液，可直接作底物使用。另外，和即成应用液，可直接作底物使用。另外，TMB又有无致癌性等又有无致癌性等优点，因此在优点，因此在ELISA中应用日趋广泛。中应用日趋广泛。2.5 洗涤液洗涤液涤液多为含非离子型洗涤剂的中性缓冲液。涤液多为含非离子型洗涤剂的中性缓冲液。聚苯乙烯载体与蛋白质的结合是疏水性的，非离子型洗涤剂聚苯乙烯载体与蛋白质的结合是疏水性的，非离子型洗涤剂既含疏水基团，也含亲水基团，其疏水基团与蛋白质的疏水既含疏水基团，也含亲水基团，其疏水基团与蛋白质的疏水基团借疏水键结合，从而削弱蛋白质与固相载体的结合，并基团借疏水键结合，从而削弱蛋白质与固相载体的结

46、合，并借助于亲水基团和水分子的结合作用，使蛋白质回复到水溶借助于亲水基团和水分子的结合作用，使蛋白质回复到水溶液状态，从而脱离固相载体。液状态，从而脱离固相载体。洗涤液中的非离子型洗涤剂一般是吐温洗涤液中的非离子型洗涤剂一般是吐温20，其浓度可在，其浓度可在0.05%-0.2%之间，高于之间，高于0.2%时，可使包被在固相上的抗原或时，可使包被在固相上的抗原或抗体解吸附而减低试验的灵敏度。抗体解吸附而减低试验的灵敏度。（六）应用亲和素和生物素的ELISA其所生成的颜色深浅与欲测的抗原（抗体）含量成正比。用NaOH终止酶反应后，黄色可稳定一时间。阳性对照品多以含蛋白保护剂的缓冲液为基质，其中加入

47、一定量的待检物质，此量最好在试剂说明书中标明。由于两者在化学结构和空间构型上呈互补关系，所以抗原抗体反应具有高度的特异性。ELISA特点一：灵敏性因此，加入底物后显色反应较弱。间歇摇动，浸泡时间不可随意缩短；固相载体在ELISA测定过程中作为吸附剂和容器，不参与化学反应。三、ELISA实验过程这种有色产物可用肉眼、光学显微镜、电子显微镜观察，也可以用分光光度计（酶标仪）加以测定。底物液受光照会自行变色，显色反应应避光进行，显色反应结束时加入终止液终止反应。ELISA要有三个必要的试剂，即免疫吸附剂、结合物和酶的底物。因此，加入底物后显色反应较弱。抗原-抗体识别反应示意图加入封闭蛋白溶液以封闭载

48、体研究表明，脱脂奶粉也是一种良好的封闭剂，其最大的特点是价廉，可以高浓度使用（5%）。酶是一种有机催化剂，很少量的酶即可诱导大量的催化反应，产生可供观察的显色反应现象。根据颜色反应的程度进行载体对不同蛋白质的吸附能力是不相同的，大分子蛋白质较小分子蛋白质通常含有更多的疏水基团，故更易吸附到固相载体表面。对照管只加一定量酶标抗原抗原抗体的基本特性：a、反应的特异性；固相的抗原或抗体（免疫吸附剂）酶标记物中酶与抗体（或抗原）之间有恰当的分子比例，在酶标记物中应尽量不含有或少含有游离的（未结合的）酶或游离的抗体（或抗原）。例如，在测定血清中某一物质的含量时，化学比色法的敏感度为mg/ml水平，酶反应

49、测定法的敏感度约为5-10g/ml。这种物理吸附是非特异性的，受蛋白质的分子量、等电点、浓度等的影响。它采用抗原与抗体的特异反应将待测物与酶连接，然后通过酶与底物产生颜色反应，用于定量测定。4、保温在ELISA中一般加标本和加酶标记物后会有一次抗原抗体反应。AP为磷酸酯酶，一般采用对硝基苯磷酸酯(p-nitrophenyl phosphate,p-NPP)作为底物，可制成片剂，使用方便。测定管的显色程度则随待测抗原和酶标抗原与固相抗体竞争结合的结果而异。通过洗涤以清除残留在板孔中没能与固相抗原或抗体结合的物质，以及在反应过程中非特异性地吸附于固相载体的干扰物质。洗涤并除去未结合的封闭蛋白通过洗

50、涤以清除残留在板孔中没能与固相抗原或抗体结合的物质，以及在反应过程中非特异性地吸附于固相载体的干扰物质。（5）酶标记物及样本的稀释液；底物液受光照会自行变色，显色反应应避光进行，显色反应结束时加入终止液终止反应。对照管只加一定量酶标抗原如待测抗原量多，竞争性地抑制酶标抗原与固相抗体结合，使固相上结合的酶标抗原量减少。洗涤并除去未结合的封闭蛋白载体对不同蛋白质的吸附能力是不相同的，大分子蛋白质较小分子蛋白质通常含有更多的疏水基团，故更易吸附到固相载体表面。间接法是检测抗体最常用的方法，其原理为利用酶标记的抗抗体以检测已与固相抗原结合的受检抗体，故称为间接法。浸泡，即将洗涤液注满板孔，放置1-2分