最新基因工程11大肠杆菌基因工程课件.ppt

1、D 基因工程菌的遗传不稳定性及其对策基因工程菌的遗传不稳定性及其对策大肠杆菌基因工程大肠杆菌基因工程C 大肠杆菌基因工程菌的构建策略大肠杆菌基因工程菌的构建策略B 外源基因在大肠杆菌中高效表达的原理外源基因在大肠杆菌中高效表达的原理A 大肠杆菌作为表达外源基因受体菌的特征大肠杆菌作为表达外源基因受体菌的特征E 利用重组大肠杆菌生产人胰岛素利用重组大肠杆菌生产人胰岛素强终止子的选择与使用强终止子的选择与使用 目前外源基因表达质粒中常用的终止子是来自大肠杆菌目前外源基因表达质粒中常用的终止子是来自大肠杆菌rRNA操纵子上的操纵子上的rrnT1T2以及以及T7噬菌体噬菌体DNA上的上的Tf f。对于

2、一些终止作对于一些终止作用较弱的终止子，通常可以采用二聚体终止子串联的特殊结构，用较弱的终止子，通常可以采用二聚体终止子串联的特殊结构，以增强其转录终止作用以增强其转录终止作用核糖体结合位点核糖体结合位点 外源基因在大肠杆菌细胞中的高效表达不仅取决于转录启动外源基因在大肠杆菌细胞中的高效表达不仅取决于转录启动的频率，而且在很大程度上还与的频率，而且在很大程度上还与mRNA的翻译起始效率密切相关。的翻译起始效率密切相关。mRNA翻译的起始效率主要由其翻译的起始效率主要由其5端的结构序列所决定，称为端的结构序列所决定，称为核核糖体结合位点糖体结合位点（RBS）大肠杆菌核糖体结合位点包括下列四个特征

3、结构要素：大肠杆菌核糖体结合位点包括下列四个特征结构要素：n位于翻译起始密码子上游的位于翻译起始密码子上游的6-8个核苷酸序列个核苷酸序列5 UAAGGAGG 3，即即Shine-Dalgarno（SD）序列，它识别并与序列，它识别并与16S rRNA 3端端的的3 AUUCCUCC 5 专一性结合，将专一性结合，将mRNA定位于核糖体上，定位于核糖体上，从而启动翻译；从而启动翻译；n翻译起始密码子，大肠杆菌绝大部分基因以翻译起始密码子，大肠杆菌绝大部分基因以AUG作为阅读框架作为阅读框架的起始位点；的起始位点；nSD序列与翻译起始密码子之间的距离重要而碱基组成不重要序列与翻译起始密码子之间的

4、距离重要而碱基组成不重要；在很多情况下，在很多情况下，SD序列位于序列位于AUG之前大约之前大约七个碱基七个碱基处。处。n基因编码区基因编码区5 端若干密码子的碱基组成也较重要，端若干密码子的碱基组成也较重要，这一序列这一序列不能与不能与mRNA的的5 端非编码区形成茎环结构端非编码区形成茎环结构。核糖体结合位点的结构核糖体结合位点的结构生物体对密码子的偏爱性生物体对密码子的偏爱性 不同的生物，甚至同种生物不同的蛋白质编码基因，对简并不同的生物，甚至同种生物不同的蛋白质编码基因，对简并密码子使用频率并不相同，具有一定的偏爱性，其决定因素是：密码子使用频率并不相同，具有一定的偏爱性，其决定因素是

5、：生物基因组中的碱基含量生物基因组中的碱基含量 在富含在富含AT的生物（如单链的生物（如单链DNA噬菌噬菌体体f fX174X174）基因组中，密码子第三位上的基因组中，密码子第三位上的U和和A出现的频率较高；出现的频率较高；而在而在GC丰富的生物（如链霉菌）基因组中，第三位上含有丰富的生物（如链霉菌）基因组中，第三位上含有G或或C的简并密码子占的简并密码子占90%以上的绝对优势以上的绝对优势密码子与反密码子相互作用的自由能密码子与反密码子相互作用的自由能 如如GGG、CCC、GCG、GGC、AAA、UUU、AUA、UAU等使用少；如等使用少；如GUG、CAC、UCG、AGC、ACA、UGU、

6、AUC、UUG等使用多；等使用多；细胞细胞内内tRNA的含量的含量使外源基因上的密码子在大肠杆菌细胞中获得最佳表达的使外源基因上的密码子在大肠杆菌细胞中获得最佳表达的策略：策略：外源基因全合成外源基因全合成同步表达相关同步表达相关tRNA编码基因编码基因 对于那些含有稀有密码子出现频率较高、而本身分子量又较对于那些含有稀有密码子出现频率较高、而本身分子量又较大的外源基因而言，选择相关大的外源基因而言，选择相关tRNA编码基因同步克隆表达的策编码基因同步克隆表达的策略较为有利。例如，在略较为有利。例如，在人尿激酶原人尿激酶原cDNA的的412个密码子中，共个密码子中，共含有含有22个个精氨酸密码

7、子精氨酸密码子，其中，其中7个个AGG、2个个AGA，而大肠杆菌而大肠杆菌受体细胞中受体细胞中tRNAAGG和和tRNAAGA的丰度较低。为了提高人尿激酶的丰度较低。为了提高人尿激酶原原cDNA在大肠杆菌中的高效表达，将大肠杆菌的这两个在大肠杆菌中的高效表达，将大肠杆菌的这两个tRNA编编码基因克隆在另一个高表达的质粒上。由此构建的大肠杆菌双质码基因克隆在另一个高表达的质粒上。由此构建的大肠杆菌双质粒系统有效地解除了受体细胞对外源基因高效表达的制约作用。粒系统有效地解除了受体细胞对外源基因高效表达的制约作用。同步表达相关同步表达相关tRNA编码基因编码基因质粒拷贝数质粒拷贝数质粒拷贝数对细菌生

8、长代谢的影响质粒拷贝数对细菌生长代谢的影响 目前广泛使用的表达型质粒在每个大肠杆菌细胞中可达数百目前广泛使用的表达型质粒在每个大肠杆菌细胞中可达数百甚至上千个拷贝，质粒的扩增过程通常发生在受体细胞的对数生甚至上千个拷贝，质粒的扩增过程通常发生在受体细胞的对数生长期内，正是细菌生理代谢最旺盛的阶段。质粒分子的过度增殖长期内，正是细菌生理代谢最旺盛的阶段。质粒分子的过度增殖以及其后目的基因的高效表达势必会影响受体细胞的生长代谢，以及其后目的基因的高效表达势必会影响受体细胞的生长代谢，进而导致重组质粒的不稳定性以及目的基因宏观表达水平的下降进而导致重组质粒的不稳定性以及目的基因宏观表达水平的下降 解

9、决上述难题的一种有效策略是将重组质粒的扩增纳入可控解决上述难题的一种有效策略是将重组质粒的扩增纳入可控制的轨道制的轨道质粒拷贝数质粒拷贝数质粒扩增时序的控制质粒扩增时序的控制pCP3拥有一个温度可诱导型的复制子拥有一个温度可诱导型的复制子pCP3PLMCSoriApr在在28时，每个细胞的质粒拷贝数为时，每个细胞的质粒拷贝数为60在在42时，拷贝数迅速增至时，拷贝数迅速增至300-600在此温度下，受体细胞染色体上的在此温度下，受体细胞染色体上的CI基基 因表达的温度敏感型阻遏蛋白失活因表达的温度敏感型阻遏蛋白失活 因此，用一种手段同时控制质粒拷因此，用一种手段同时控制质粒拷 贝数和基因的表达

10、贝数和基因的表达C 大肠杆菌基因工程菌的构建策略大肠杆菌基因工程菌的构建策略包涵体型异源蛋白的表达包涵体型异源蛋白的表达分泌型异源蛋白的表达分泌型异源蛋白的表达融合型异源蛋白的表达融合型异源蛋白的表达寡聚型异源蛋白的表达寡聚型异源蛋白的表达整合型异源蛋白的表达整合型异源蛋白的表达蛋白酶抗性或缺陷型表达系统的构建蛋白酶抗性或缺陷型表达系统的构建包涵体型异源蛋白的表达包涵体型异源蛋白的表达包涵体及其性质包涵体及其性质 在特定生长条件下，大肠杆菌能积累某种特殊的生物大分子，在特定生长条件下，大肠杆菌能积累某种特殊的生物大分子，它们致密地集聚在细胞内，或被膜包裹或形成无膜裸露结构，这它们致密地集聚在细

11、胞内，或被膜包裹或形成无膜裸露结构，这种水不溶性的结构称为种水不溶性的结构称为包涵体（包涵体（Inclusion Bodies，IB）。）。由高效表达质粒构建的工程菌大量合成异源蛋白质，一般情由高效表达质粒构建的工程菌大量合成异源蛋白质，一般情况下也以包涵体的形式存在于细菌细胞内。此外包涵体中还含有况下也以包涵体的形式存在于细菌细胞内。此外包涵体中还含有少量的少量的DNA、RNA和脂多糖等非蛋白分子。和脂多糖等非蛋白分子。以包涵体形式表达目的蛋白的优缺点以包涵体形式表达目的蛋白的优缺点能简化外源基因表达产物的分离操作能简化外源基因表达产物的分离操作 包涵体表达形式的优点：包涵体表达形式的优点：

12、包涵体的水难溶性及其密度远大于其它细胞碎片和细胞成分，菌包涵体的水难溶性及其密度远大于其它细胞碎片和细胞成分，菌体经超声波裂解后，直接通过高速离心即可将重组异源蛋白从细体经超声波裂解后，直接通过高速离心即可将重组异源蛋白从细菌裂解物中分离出来菌裂解物中分离出来能在一定程度上保持表达产物的结构稳定能在一定程度上保持表达产物的结构稳定 在形成包涵体之后，大肠杆菌的蛋白酶降解作用对异源重组蛋白在形成包涵体之后，大肠杆菌的蛋白酶降解作用对异源重组蛋白的稳定性已构不成威胁的稳定性已构不成威胁包涵体表达形式的缺点：包涵体表达形式的缺点：以包涵体形式表达的重组蛋白丧失了原有的生物活性，必须以包涵体形式表达的

13、重组蛋白丧失了原有的生物活性，必须通过有效的变性复性操作，才能回收得到具有正确空间构象的目通过有效的变性复性操作，才能回收得到具有正确空间构象的目标蛋白。而这是一个技术难题，尤其当目标蛋白分子中的标蛋白。而这是一个技术难题，尤其当目标蛋白分子中的Cys残残基数目较高时，体外复性蛋白质的成功率相当低，一般不超过基数目较高时，体外复性蛋白质的成功率相当低，一般不超过30%。如果未进行特殊设计（如分泌型表达或融合型表达），外源如果未进行特殊设计（如分泌型表达或融合型表达），外源基因在大肠杆菌中表达的蛋白量占细胞总蛋白量基因在大肠杆菌中表达的蛋白量占细胞总蛋白量20%20%以上时，表以上时，表达产物一

14、般倾向于形成包涵体。达产物一般倾向于形成包涵体。包涵体型异源蛋白的表达包涵体型异源蛋白的表达包涵体的变性与复性操作包涵体的变性与复性操作C 共价修饰的蛋白质共价修饰的蛋白质蛋白质变性复性的动力学原理：蛋白质变性复性的动力学原理：C1C2CnCUI 1I nNX1X2XnXAAAAI 有效变复性过程中的中间状态有效变复性过程中的中间状态X 脱离有效变复性过程而进入集聚的中间状态脱离有效变复性过程而进入集聚的中间状态N 天然状态的蛋白质天然状态的蛋白质U 变性状态的蛋白质变性状态的蛋白质A 集聚状态的蛋白质集聚状态的蛋白质在细菌细胞内，在细菌细胞内，集聚状态集聚状态和和共价修饰共价修饰的蛋白质的蛋

15、白质不能进入复性过程，因此成为永远不能进入复性过程，因此成为永远无活性的蛋无活性的蛋白质。包涵体中的蛋白质就属于这两种状态，白质。包涵体中的蛋白质就属于这两种状态，因此需要在体外进行人工变性和复性操作。因此需要在体外进行人工变性和复性操作。包涵体的溶解与变性：包涵体的溶解与变性：主要任务是拆开错配的主要任务是拆开错配的二硫键二硫键和和次级键；次级键；在人工条件下使在人工条件下使蛋白溶解并重新进入复性途径中。能有效促进包涵体溶解蛋白溶解并重新进入复性途径中。能有效促进包涵体溶解变性的试剂和条件包括：变性的试剂和条件包括：清洗剂清洗剂 SDS、正十二醇肌氨酸，廉价，但影响复性和纯化正十二醇肌氨酸，

16、廉价，但影响复性和纯化促溶剂促溶剂 盐酸胍盐酸胍、尿素，前者昂贵，尿素便宜，但常被自发形、尿素，前者昂贵，尿素便宜，但常被自发形成的氰酸盐污染，后者能与多肽链中的氨基反应成的氰酸盐污染，后者能与多肽链中的氨基反应 混合溶剂混合溶剂 如如尿素与醋酸、二甲基砜等联合使用，溶解力增强尿素与醋酸、二甲基砜等联合使用，溶解力增强极端极端pH 廉价，但许多蛋白质在极端廉价，但许多蛋白质在极端pH条件下发生修饰反应条件下发生修饰反应包涵体的复性与重折叠（包涵体的复性与重折叠（refolding）：）：包涵体的复性与重折叠的主要任务是：包涵体的复性与重折叠的主要任务是：通过通过次级键次级键的形成使蛋白质复性的

17、形成使蛋白质复性使多肽链中被拆开的使多肽链中被拆开的游离巯基游离巯基重新折叠重新折叠包涵体的复性与重折叠（包涵体的复性与重折叠（refolding）：）：复性操作复性操作包涵体复性操作的方法包括：包涵体复性操作的方法包括：分段稀释法，分段稀释法，逐步降低变性剂的浓度，防止二次集聚的发生逐步降低变性剂的浓度，防止二次集聚的发生一步稀释法，一步稀释法，蛋白复性与浓度无关，但集聚与浓度关系很大蛋白复性与浓度无关，但集聚与浓度关系很大试剂添加法，试剂添加法，精氨酸、甘氨酸、甘油、蔗糖、精氨酸、甘氨酸、甘油、蔗糖、PEG、Ca2+蛋白修饰法，蛋白修饰法，氨基柠檬酸酐酰化，蛋白带负电，抑制集聚氨基柠檬酸酐

18、酰化，蛋白带负电，抑制集聚产物隔离法，产物隔离法，将变性的蛋白分子固定化，避免其相互碰撞将变性的蛋白分子固定化，避免其相互碰撞分子伴侣法，分子伴侣法，GroEL、GroES、DnaK，固定化固定化分泌型异源蛋白的表达分泌型异源蛋白的表达表达的异源蛋白可通过运输或分泌方式定位于细胞周质，表达的异源蛋白可通过运输或分泌方式定位于细胞周质，甚至穿过外膜进入培养基中。蛋白产物甚至穿过外膜进入培养基中。蛋白产物N端端信号肽信号肽序列的序列的存在是蛋白质分泌的前提条件。存在是蛋白质分泌的前提条件。以分泌形式表达目的蛋白的优缺点以分泌形式表达目的蛋白的优缺点分泌表达形式的优点：分泌表达形式的优点：目的蛋白稳

19、定性高目的蛋白稳定性高 重组人胰岛素原若分泌到细胞周中，其重组人胰岛素原若分泌到细胞周中，其稳定性大约是在细胞质中的稳定性大约是在细胞质中的1010倍。倍。目的蛋白易于分离目的蛋白易于分离目的蛋白末端完整目的蛋白末端完整 真核生物成熟蛋白真核生物成熟蛋白N端并不含有甲硫氨酸端并不含有甲硫氨酸残基，在大肠杆菌中表达时，残基，在大肠杆菌中表达时，N端的甲硫氨酸残基往往不能被端的甲硫氨酸残基往往不能被切除。若将外源基因与大肠切除。若将外源基因与大肠杆菌的杆菌的信号肽编码序列重组在一信号肽编码序列重组在一起，一旦分泌型表达，起，一旦分泌型表达，N端的甲硫氨酸残基便可在信号肽的剪端的甲硫氨酸残基便可在信

20、号肽的剪切过程中被有效除去。切过程中被有效除去。分泌表达形式的缺点：分泌表达形式的缺点：相对其它生物细胞而言，大肠杆菌的蛋白分泌机制并相对其它生物细胞而言，大肠杆菌的蛋白分泌机制并不健全。外源真核生物基因很难在大肠杆菌中进行分泌型不健全。外源真核生物基因很难在大肠杆菌中进行分泌型表达，少数外源基因既便能分泌表达，但其表达率通常要表达，少数外源基因既便能分泌表达，但其表达率通常要比包涵体方式低很多，因此目前用于产业化的异源蛋白分比包涵体方式低很多，因此目前用于产业化的异源蛋白分泌型重组大肠杆菌并不多见。泌型重组大肠杆菌并不多见。融合型异源蛋白的表达融合型异源蛋白的表达将外源基因与受体菌自身的蛋白

21、质编码基因拼接在一起，作为一将外源基因与受体菌自身的蛋白质编码基因拼接在一起，作为一个个开放阅读框架开放阅读框架进行表达。由这种杂合基因表达出的蛋白质称为进行表达。由这种杂合基因表达出的蛋白质称为融合蛋白融合蛋白。在融合蛋白中，受体细菌的蛋白通常位于。在融合蛋白中，受体细菌的蛋白通常位于N端，异源端，异源蛋白位于蛋白位于C端。通过在端。通过在DNA水平上设计引入的蛋白酶切割位点或水平上设计引入的蛋白酶切割位点或化学试剂特异性断裂位点，可以释放回收异源蛋白。化学试剂特异性断裂位点，可以释放回收异源蛋白。以融合形式表达目的蛋白的优缺点以融合形式表达目的蛋白的优缺点目的蛋白稳定性高目的蛋白稳定性高

22、尤其对分子量较小的多肽效果更佳。尤其对分子量较小的多肽效果更佳。目的蛋白易于分离目的蛋白易于分离 利用受体蛋白成熟的抗体、配体、底物利用受体蛋白成熟的抗体、配体、底物进行亲和层析，可以快速获得纯度较高的融合蛋白。进行亲和层析，可以快速获得纯度较高的融合蛋白。目的蛋白表达率高目的蛋白表达率高 与受体蛋白共用一套完善的表达元件。与受体蛋白共用一套完善的表达元件。目的蛋白溶解性好目的蛋白溶解性好 由于受体蛋白的存在，融合蛋白往往能由于受体蛋白的存在，融合蛋白往往能在在胞内形成良好的空间构象，且大多具有水溶性。胞内形成良好的空间构象，且大多具有水溶性。目的蛋白需要回收目的蛋白需要回收 融合蛋白需要裂解

23、和进一步分离，才能融合蛋白需要裂解和进一步分离，才能获得目的蛋白。在实际生产中，产品主要的成本往往就在该获得目的蛋白。在实际生产中，产品主要的成本往往就在该工段。工段。融合型目的蛋白表达系统的构建融合型目的蛋白表达系统的构建融合蛋白表达质粒的构建原则：融合蛋白表达质粒的构建原则：受体蛋白受体蛋白能高效表达，可通过亲和层析进行特异性简单纯化能高效表达，可通过亲和层析进行特异性简单纯化两个结构基因拼接位点处的序列设计直接决定着融合蛋白的两个结构基因拼接位点处的序列设计直接决定着融合蛋白的裂解工艺裂解工艺外源基因应装在受体蛋白编码基因的下游。有时不需要完整外源基因应装在受体蛋白编码基因的下游。有时不

24、需要完整的受体结构基因，以避免融合蛋白分子中两种组份的分子量的受体结构基因，以避免融合蛋白分子中两种组份的分子量过于接近，过于接近，不利于目的蛋白分离回收不利于目的蛋白分离回收两个蛋白编码序列应保持一致的翻译阅读框架两个蛋白编码序列应保持一致的翻译阅读框架 融合型目的蛋白表达系统的构建融合型目的蛋白表达系统的构建用于融合蛋白构建的受体蛋白：用于融合蛋白构建的受体蛋白：谷胱甘肽转移酶（谷胱甘肽转移酶（GST）维持良好空间构象维持良好空间构象硫氧化还原蛋白（硫氧化还原蛋白（TrxA）维持良好空间构象维持良好空间构象 pTrxFus麦芽糖结合蛋白（麦芽糖结合蛋白（MBP）促进分泌促进分泌金黄色葡萄球

25、菌蛋白金黄色葡萄球菌蛋白A（SAPA）免疫亲和层析免疫亲和层析 pRIT2T外膜蛋白（外膜蛋白（OmpF）促进分泌促进分泌b b-半乳糖苷酶（半乳糖苷酶（LacZ）免疫亲和层析免疫亲和层析泛素蛋白（泛素蛋白（Ubi）维持良好空间构象维持良好空间构象目的蛋白的回收目的蛋白的回收受体蛋白部分的存在可能会影响目的蛋白的空间构象和生受体蛋白部分的存在可能会影响目的蛋白的空间构象和生物活性；如果注入人体还会导致免疫反应。因此在生产药物活性；如果注入人体还会导致免疫反应。因此在生产药用目的蛋白时，将融合蛋白中的受体蛋白部分完整除去是用目的蛋白时，将融合蛋白中的受体蛋白部分完整除去是必不可少的工序。融合蛋白

26、的位点专一性断裂方法有两种：必不可少的工序。融合蛋白的位点专一性断裂方法有两种：化学断裂法化学断裂法 酶促裂解法酶促裂解法 目的蛋白的回收目的蛋白的回收 用于蛋白位点专一性化学断裂的最佳试剂为用于蛋白位点专一性化学断裂的最佳试剂为溴化氰（溴化氰（CNBr）它与多肽链中的它与多肽链中的甲硫氨酸甲硫氨酸残基侧链的残基侧链的硫醚基硫醚基反应，生成溴化亚氨反应，生成溴化亚氨内酯，后者不稳定，在水的作用下肽键断裂，形成两个多肽降解内酯，后者不稳定，在水的作用下肽键断裂，形成两个多肽降解片段其中片段其中上游肽段上游肽段的甲硫氨酸残基转化为的甲硫氨酸残基转化为高丝氨酸高丝氨酸残基，而下游残基，而下游肽段肽段

27、N端的第一位氨基酸残基保持不变。这一方法的优点是回收端的第一位氨基酸残基保持不变。这一方法的优点是回收率高率高(可达到可达到85%以上以上)，专一性强，且所产生的目的蛋白的，专一性强，且所产生的目的蛋白的N端端不含甲硫氨酸，与真核生物细胞中的成熟表达产物较为接近。不含甲硫氨酸，与真核生物细胞中的成熟表达产物较为接近。然然而，如果异源蛋白分子内部含有甲硫氨酸残基，则不能用此方法。而，如果异源蛋白分子内部含有甲硫氨酸残基，则不能用此方法。化学断裂法：化学断裂法：目的蛋白的回收目的蛋白的回收酶促裂解法：酶促裂解法：单残基位点单残基位点蛋白内切酶蛋白内切酶切割位点切割位点梭菌蛋白酶梭菌蛋白酶 Arg-

28、C葡萄球菌蛋白酶葡萄球菌蛋白酶 Glu-C假单孢菌蛋白酶假单孢菌蛋白酶 Lys-C猪胰蛋白酶猪胰蛋白酶 Arg-C Lys-C蛋白酶酶促裂解法的特点是断裂效率蛋白酶酶促裂解法的特点是断裂效率更高，断裂位点专一性强。在多肽链更高，断裂位点专一性强。在多肽链中的中的精氨酸精氨酸、谷氨酸、赖氨谷氨酸、赖氨酸酸残基处残基处切开酰胺键，形成不含上述残基的下切开酰胺键，形成不含上述残基的下游断裂肽段。但前提条件是外源蛋白游断裂肽段。但前提条件是外源蛋白分子内部不能含有精氨酸、谷氨酸或分子内部不能含有精氨酸、谷氨酸或赖氨酸残基，而大分子量的异源蛋白赖氨酸残基，而大分子量的异源蛋白含这三种氨基酸残基的比率相当

29、高。含这三种氨基酸残基的比率相当高。Arg CNNC受体蛋白受体蛋白目的蛋白目的蛋白目的蛋白的回收目的蛋白的回收酶促裂解法：酶促裂解法：多残基位点多残基位点 为克服单一残基的蛋白酶的应用局限性，可在受体蛋白编码为克服单一残基的蛋白酶的应用局限性，可在受体蛋白编码序列与不含起始密码子的外源基因之间加装一段编码序列与不含起始密码子的外源基因之间加装一段编码寡肽序列寡肽序列（Ile-Glu-Gly-Arg）的人工接头的人工接头DNADNA片段，该寡肽为具有蛋白酶片段，该寡肽为具有蛋白酶活性的活性的凝血因子凝血因子XaXa的识别和作用序列，其断裂位点在的识别和作用序列，其断裂位点在Arg的的C末末端端

30、。纯化后的融合蛋白用。纯化后的融合蛋白用Xa处理，即可获得目的蛋白。由于处理，即可获得目的蛋白。由于Xa的识别作用序列由四个氨基酸残基组成，大多数蛋白质中出现这的识别作用序列由四个氨基酸残基组成，大多数蛋白质中出现这种寡肽序列的概率极少，因此可广泛用于回收各种目的蛋白。种寡肽序列的概率极少，因此可广泛用于回收各种目的蛋白。目的蛋白的回收目的蛋白的回收酶促裂解法：多残基位点酶促裂解法：多残基位点启动子启动子受体基因受体基因接头接头目的基因目的基因MetStopIle-Glu-gly-ArgIle-Glu-gly-Arg表达表达亲和层析亲和层析酶解回收酶解回收寡聚型异源蛋白的表达寡聚型异源蛋白的表

31、达 通过增加质粒拷贝数通过增加质粒拷贝数,以提高目的蛋白产量往往不能获得满以提高目的蛋白产量往往不能获得满意的效果。意的效果。既增加外源基因剂量又能提高目标蛋白产量的有效方法是构既增加外源基因剂量又能提高目标蛋白产量的有效方法是构建建寡聚串联型异源蛋白表达载体寡聚串联型异源蛋白表达载体，即将多个拷贝的外源基因串联，即将多个拷贝的外源基因串联后克隆在一个低拷贝质粒上，以取代高拷贝载体仅含单拷贝外源后克隆在一个低拷贝质粒上，以取代高拷贝载体仅含单拷贝外源基因的策略。基因的策略。以寡聚形式表达目的蛋白的优缺点以寡聚形式表达目的蛋白的优缺点目的蛋白高效表达目的蛋白高效表达 在不提高质粒拷贝数的前提下，

32、增加目的在不提高质粒拷贝数的前提下，增加目的基因的拷贝数，可以在一定程度上改善表达量基因的拷贝数，可以在一定程度上改善表达量稳定表达小分子短肽稳定表达小分子短肽 短肽由于缺乏有效的空间结构，在细菌短肽由于缺乏有效的空间结构，在细菌细胞中的半衰期较短。串联短肽具有与蛋白质相似的长度及空细胞中的半衰期较短。串联短肽具有与蛋白质相似的长度及空间结构，因而抗蛋白酶降解的能力大幅度提高间结构，因而抗蛋白酶降解的能力大幅度提高目的产物回收困难目的产物回收困难 寡聚短肽需要裂解和进一步分离，才能获寡聚短肽需要裂解和进一步分离，才能获最终分子，但最终分子，但裂解后的短肽分子容易出现序列不均一性裂解后的短肽分子

33、容易出现序列不均一性寡聚型目的蛋白表达系统的构建寡聚型目的蛋白表达系统的构建P SDgenegenegenegeneT1 T2H2NCOOHMetMetMetMetmRNACNBr基本战略：基本战略：整合型异源蛋白的表达整合型异源蛋白的表达以整合形式表达目的蛋白的优缺点以整合形式表达目的蛋白的优缺点目的基因稳定表达目的基因稳定表达整合型的目的基因随受体细胞染色体整合型的目的基因随受体细胞染色体DNA的复制而复制，相的复制而复制，相当稳定，工程菌在没有选择压力存在下可以连续培养而不丢当稳定，工程菌在没有选择压力存在下可以连续培养而不丢失目的基因表达盒，这对以改良物种遗传性状为目的基因工失目的基因

34、表达盒，这对以改良物种遗传性状为目的基因工程案例特别有意义程案例特别有意义目的基因表达率低目的基因表达率低单拷贝整合的目的基因表达率受到限制，此时可通过强化表单拷贝整合的目的基因表达率受到限制，此时可通过强化表达达元件而加以补偿元件而加以补偿DNA体内重组的基本原理体内重组的基本原理 在生物体细胞尤其是原核细菌细胞内，广泛存在着在生物体细胞尤其是原核细菌细胞内，广泛存在着DNA的遗的遗传重组机制，可能的生物学功能是促进生物种群的进化。细胞内传重组机制，可能的生物学功能是促进生物种群的进化。细胞内的的遗传重组遗传重组可分为两大类：可分为两大类：转座因子依赖型转座因子依赖型同源序列依赖型同源序列依

35、赖型 在原核细胞中，染色体在原核细胞中，染色体DNA链上的两个同源区之间可发生同链上的两个同源区之间可发生同源重组。距离越远、长度越长、同源性越高，重组的频率也就越源重组。距离越远、长度越长、同源性越高，重组的频率也就越高，反之亦然。高，反之亦然。同源重组有同源重组有整合整合和和交换交换两种形式两种形式同源序列依赖型的体内重组：同源序列依赖型的体内重组：基本形式基本形式同源序列依赖型的体内重组：同源序列依赖型的体内重组：同源整合同源整合ori目的基因目的基因同源区域同源区域标记基因标记基因整合位点整合位点染色体染色体DNA同源序列依赖型的体内重组：同源序列依赖型的体内重组：同源交换同源交换or

36、i目的基因目的基因同源区域同源区域标记基因标记基因交换区域交换区域染色体染色体DNAori标记基因标记基因+蛋白酶抗性或缺陷型表达系统的构建蛋白酶抗性或缺陷型表达系统的构建 重组目的蛋白表达后都会面临被降解的命运。重组目的蛋白表达后都会面临被降解的命运。重组目的蛋白的不稳定性源于对受体细胞蛋白酶系统的敏感重组目的蛋白的不稳定性源于对受体细胞蛋白酶系统的敏感性。重组蛋白的半衰期可以通过序列的人工设计以及受体细胞的性。重组蛋白的半衰期可以通过序列的人工设计以及受体细胞的改造加以控制。改造加以控制。大多数不稳定的重组目的蛋白是被大肠杆菌中的蛋白酶大多数不稳定的重组目的蛋白是被大肠杆菌中的蛋白酶La和

37、和Ti降解的，两者分别由降解的，两者分别由lon和和clp基因编码。基因编码。lon-的的大肠杆菌突变大肠杆菌突变株可使半衰期较短的细蛋白稳定性大增，因此被广泛用作外源基株可使半衰期较短的细蛋白稳定性大增，因此被广泛用作外源基因高效表达的受体菌。因高效表达的受体菌。蛋白酶缺陷型受体细胞的改造蛋白酶缺陷型受体细胞的改造lon基因缺陷的大肠杆菌受体（基因缺陷的大肠杆菌受体（lon-）：）：大肠杆菌中的热休克蛋白可大肠杆菌中的热休克蛋白可胁迫异源蛋白形成一种对蛋白胁迫异源蛋白形成一种对蛋白酶酶降解较有利的构象，从而提高异源蛋白对蛋白降解较有利的构象，从而提高异源蛋白对蛋白酶的敏感性。酶的敏感性。lo

38、n-htpR-的双缺陷株非常适合高效表达不稳定的重组异源蛋白的双缺陷株非常适合高效表达不稳定的重组异源蛋白。htpR基因缺陷的大肠杆菌受体（基因缺陷的大肠杆菌受体（htpR-）：）：Asp离离C末端末端越近，蛋白质的稳定性就越大。在蛋白质越近，蛋白质的稳定性就越大。在蛋白质C末端末端引入引入Asp，能显著延长半衰期，能显著延长半衰期。抗蛋白酶的重组异源蛋白序列的设计抗蛋白酶的重组异源蛋白序列的设计多肽链多肽链C末端氨基酸序列对稳定性的影响：末端氨基酸序列对稳定性的影响：多肽链的多肽链的N末端序列中含有较高比例的末端序列中含有较高比例的Ala、Asn、Cys、Gln、His，稳定性显著改善。稳定

39、性显著改善。N末端含有末端含有Pro、Glu、Ser、Thr，半衰期通常很短，半衰期通常很短。尤其尤其Pro-Glu-Ser-Thr序列（序列（PEST序列），序列），是蛋白酶的超敏感区。是蛋白酶的超敏感区。多肽链多肽链N末端氨基酸序列对稳定性的影响：末端氨基酸序列对稳定性的影响：D 基因工程菌的遗传不稳定性及其对策基因工程菌的遗传不稳定性及其对策基因工程菌遗传不稳定性的表现与机制基因工程菌遗传不稳定性的表现与机制改善基因工程菌不稳定性的策略改善基因工程菌不稳定性的策略基因工程菌遗传不稳定性的表现与机制基因工程菌遗传不稳定性的表现与机制工程菌遗传不稳定性的表现形式工程菌遗传不稳定性的表现形式

40、基因工程菌的遗传不稳定性主要表现在重组质粒的不稳定性，基因工程菌的遗传不稳定性主要表现在重组质粒的不稳定性，这种不稳定性具有下列两种表现形式：这种不稳定性具有下列两种表现形式：结构不稳定性结构不稳定性重组重组DNA分子上某一区域发生缺失、重排、修饰，导致其表观生分子上某一区域发生缺失、重排、修饰，导致其表观生物学功能的丧失物学功能的丧失分配不稳定性分配不稳定性整个重组整个重组DNA分子从受体细胞中逃逸（分子从受体细胞中逃逸（curing）改善基因工程菌不稳定性的策略改善基因工程菌不稳定性的策略改进载体受体系统改进载体受体系统 以增大质粒稳定性为目的的构建方法包括：以增大质粒稳定性为目的的构建方

41、法包括：将将parB基因引入表达型载体中，基因引入表达型载体中，其产物可选择性地杀死由于其产物可选择性地杀死由于分配不均匀所产生的无质粒细胞分配不均匀所产生的无质粒细胞正确设置载体上的多克隆位点，正确设置载体上的多克隆位点，禁止禁止DNA片段插在稳定区内片段插在稳定区内将致死性基因将致死性基因如如sacB安装在载体上安装在载体上施加选择压力施加选择压力根据载体上的抗药性标记，向培养系统中添加相应的抗生素根据载体上的抗药性标记，向培养系统中添加相应的抗生素药物和食品生产时禁止使用抗生素药物和食品生产时禁止使用抗生素根据载体上的营养缺陷型标记，向培养系统中添加相应的营根据载体上的营养缺陷型标记，向

42、培养系统中添加相应的营养组份养组份 培养基复杂，成本较高培养基复杂，成本较高控制目的基因的过量表达控制目的基因的过量表达使用可控型启动子使用可控型启动子使用可控型复制子使用可控型复制子培养基组成：培养基组成：限制培养基比丰富培养基更有利于稳定限制培养基比丰富培养基更有利于稳定培养温度：培养温度：较低的培养温度有利于重组质粒的稳定较低的培养温度有利于重组质粒的稳定E 利用重组大肠杆菌生产人胰岛素利用重组大肠杆菌生产人胰岛素胰岛素的结构及其生物合成胰岛素的结构及其生物合成人胰岛素的生产方法人胰岛素的生产方法重组人胰岛素的大肠杆菌工程菌的构建重组人胰岛素的大肠杆菌工程菌的构建胰岛素的结构及其生物合成

43、胰岛素的结构及其生物合成SSSSCNSSB 肽（肽（30）C 肽（肽（31）A 肽（肽（21）RRRKSSSSCNSSNC高尔基体内的特异性肽酶高尔基体内的特异性肽酶NC信号肽信号肽B 肽肽C 肽肽A 肽肽信号肽酶信号肽酶人胰岛素的生产方法人胰岛素的生产方法直接提取法制人胰岛素直接提取法制人胰岛素迄今为止，有四种大规模生产人胰岛素的方法：迄今为止，有四种大规模生产人胰岛素的方法：早期人的胰岛素是从人的胰脏中直接分离纯化的，产量远远不能早期人的胰岛素是从人的胰脏中直接分离纯化的，产量远远不能满足日益增多的糖尿病人的临床需求。满足日益增多的糖尿病人的临床需求。人胰岛素的生产方法人胰岛素的生产方法化

44、学合成法制人胰岛素化学合成法制人胰岛素根据人胰岛素根据人胰岛素A链和链和B链的序列，由单个氨基酸从头合成。这条链的序列，由单个氨基酸从头合成。这条化学全合成的路线从技术上来说是能够做到的，但生产成本奇高，化学全合成的路线从技术上来说是能够做到的，但生产成本奇高，限制了广泛应用。限制了广泛应用。人胰岛素的生产方法人胰岛素的生产方法化学转型法制人胰岛素化学转型法制人胰岛素 猪的胰岛素可从原料丰富的猪胰脏中提取获得，而且猪胰岛猪的胰岛素可从原料丰富的猪胰脏中提取获得，而且猪胰岛素与人胰岛素只在素与人胰岛素只在B链的链的C末端有一个氨基酸的差异，猪的为末端有一个氨基酸的差异，猪的为Ala，人的为人的为

45、Thr，因此将猪胰岛素在体外酶促转化为人胰岛素不失为因此将猪胰岛素在体外酶促转化为人胰岛素不失为一种选择。一种选择。技术路线是：在技术路线是：在pH为为6-7的有机相中使胰蛋白酶催化其逆反的有机相中使胰蛋白酶催化其逆反应，该酶在过量的苏氨酸叔丁酯的存在下，将猪胰岛素应，该酶在过量的苏氨酸叔丁酯的存在下，将猪胰岛素B链链C末末端的丙氨酸交换下来，所形成的胰岛素叔丁酯再用三氯乙酸脱去端的丙氨酸交换下来，所形成的胰岛素叔丁酯再用三氯乙酸脱去叔丁酯基团，最终获得人胰岛素。该过程的总转化率为叔丁酯基团，最终获得人胰岛素。该过程的总转化率为60%。但。但工艺路线耗时，分离纯化操作复杂，产品的价格不菲。工艺

46、路线耗时，分离纯化操作复杂，产品的价格不菲。基因工程法制人胰岛素基因工程法制人胰岛素 1982年，美国年，美国Ely LiLi公司首先使用重组大肠杆菌生产人胰公司首先使用重组大肠杆菌生产人胰岛素，成为世界上第一个上市的基因工程药物。岛素，成为世界上第一个上市的基因工程药物。1987年，年，Novo公司又推出了利用重组酵母菌生产人胰岛素的新工艺。公司又推出了利用重组酵母菌生产人胰岛素的新工艺。上述由基因工程菌合成的重组人胰岛素在体外胰岛素上述由基因工程菌合成的重组人胰岛素在体外胰岛素受体结受体结合性能、淋巴细胞和成纤维细胞的应答能力、降血糖作用、血浆合性能、淋巴细胞和成纤维细胞的应答能力、降血糖

47、作用、血浆药代动力学药代动力学等指标上均与天然胰岛素没有任何区别，而且还具有等指标上均与天然胰岛素没有任何区别，而且还具有无免疫原性、注射吸收迅速等无免疫原性、注射吸收迅速等优点，充分展示了基因工程在生物优点，充分展示了基因工程在生物医药领域中的巨大潜力。医药领域中的巨大潜力。重组人胰岛素的大肠杆菌工程菌的构建重组人胰岛素的大肠杆菌工程菌的构建A链和链和B链分别表达法链分别表达法基因工程菌的构建战略：基因工程菌的构建战略：tactacb b-Galb b-GalA peptideB peptideorioriAprAprMetMetMetMetMMNCMMNC化学合成化学合成A链链和和B链的编

48、码链的编码序列序列表达产物的后处理路线：表达产物的后处理路线：MMNCMMNCb b-Galb b-GalABCNBr 处理处理NCSSSSCNSSNCNCNCNCCys 体外氧化和重折叠体外氧化和重折叠分离纯化分离纯化A链和链和B链分别表达法链分别表达法生产技术的评价：生产技术的评价：由于由于A链和链和B链上共存在六个半胱氨酸残基，体外二硫键的正链上共存在六个半胱氨酸残基，体外二硫键的正确配对率较低，通常只有确配对率较低，通常只有10%-20%，因此采用这条工艺路线生，因此采用这条工艺路线生产的重组人胰岛素每克成本高达产的重组人胰岛素每克成本高达100美元美元以上。为了进一步降低以上。为了进

49、一步降低生产成本，美国生产成本，美国Ely LiLi公司随后又建立了第二条生产重组人胰公司随后又建立了第二条生产重组人胰岛素的工艺路线。岛素的工艺路线。第二种基因工程菌的构建战略：第二种基因工程菌的构建战略：tacb b-GalC peptideoriAprMetMetMMNCB peptideA peptide人胰岛素原人胰岛素原cDNA重组人胰岛素原重组人胰岛素原转化转化分离纯化分离纯化表达产物的后处理路线：表达产物的后处理路线：SSSSCN胰蛋白酶胰蛋白酶C peptideA peptideB peptideMRRKRCNBrRSSSSCNNCS SS SR羧肽酶羧肽酶BB链中第链中第2

50、2位上的位上的Arg和和第第29位上的位上的Lys由于良好由于良好折叠的原因，对胰蛋白酶折叠的原因，对胰蛋白酶不敏感不敏感生产技术的评价：生产技术的评价：在人胰岛素原表达工艺中，由于在人胰岛素原表达工艺中，由于C肽的存在，胰岛素原能形肽的存在，胰岛素原能形成良好的空间构象，三对二硫键的正确配对率也相应提高，折叠成良好的空间构象，三对二硫键的正确配对率也相应提高，折叠率高达率高达80%以上。虽然这条工艺路线并不比以上。虽然这条工艺路线并不比AB链分别表达法更链分别表达法更为简捷，而且还要使用两种高纯度的酶制剂，但理想的折叠率在为简捷，而且还要使用两种高纯度的酶制剂，但理想的折叠率在很大程度上弥补