生物化学课件-第18章：生物药物.ppt

1、第十八章第十八章 生物药物生物药物第一节第一节 生物药物概述生物药物概述一、生物药物的概念：一、生物药物的概念：biopharmaceutics 利用生物体、生物组织或其成分，综合应用生利用生物体、生物组织或其成分，综合应用生物学、生物化学、微生物与免疫学、药学等的原物学、生物化学、微生物与免疫学、药学等的原理与方法理与方法制造制造的一类用于预防、诊断、治疗的的一类用于预防、诊断、治疗的药药物物。包括各种天然生物活性物质及其人工合成或半合包括各种天然生物活性物质及其人工合成或半合成的天然物质类似物。成的天然物质类似物。现代生物药物四大类型：现代生物药物四大类型：基因重组多肽、蛋白质类治疗药物；

2、基因重组多肽、蛋白质类治疗药物；基因药物：即基因疫苗、反义药物基因药物：即基因疫苗、反义药物 和核酶等；和核酶等；天然生物药物，来自动物、植物、微生天然生物药物，来自动物、植物、微生物、海洋生物的天然产品；物、海洋生物的天然产品；合成和部分合成生物药物。合成和部分合成生物药物。二、生物药物的发展二、生物药物的发展1.1.传统生物制药传统生物制药（Traditional biopharma-ceutics）技术阶段技术阶段 是指从生物材料粗加工制成粗制剂阶段。是指从生物材料粗加工制成粗制剂阶段。上古时期4世纪7世纪 炎帝,传说上古时期姜姓部落的首领，又称赤帝、烈山氏，即神农氏(或神农氏的子孙)，

3、相传用蟾酥治疗创伤。葛洪(284364),东晋教理论家、医学家、炼丹术家。字稚川，自号抱朴子，丹阳句容（今属江苏）人。肘后良方中记载用海藻治瘿病。孙思邈（581682），京兆华原（即今陕西省耀县）人，唐代著名道士，医药学家，被世人尊称为“药王”。公元631682，孙思邈用羊肝治“雀目”。1 1、早期生物药物阶段、早期生物药物阶段2.近代生物制药发展阶段近代生物制药发展阶段（Recent Biopharmaceutics）（1 1）脏器制药与微生物制药时期）脏器制药与微生物制药时期（2 2）生化制药工业时代）生化制药工业时代 00502575Recent Biopharmaceutics20th

4、 Century20世纪20年代：胰岛素、甲状腺素、EAA、EFA、Vit C20世纪40年代：青霉素20世纪50年代：皮质激素、垂体激素20世纪60年代：酶制剂、维生素60年代后，进入第二个发展时代:生化制药工业时代。生物分离工程技术与设备广泛应用。生化产品达600多种。3).重组人工重组人工DNA分子分子1972年H.W.Boyer和P.Berg把SV40的DNA和噬菌体分别切割又将两者连接在一起成功构建第一个重组人工DNA分子1972年，Boyer实验室首先发现EcoRI核酸限制性内切酶2).限制性内切酶限制性内切酶4).基因克隆基因克隆1973年，Cohen等人首次在体外将重组DNA分

5、子导入大肠杆菌1953年首次提出了DNA双螺旋结构提出了DNA复制假说1).DNA双螺旋模型双螺旋模型3.现代生物制药阶段现代生物制药阶段（Modern Biopharmaceutics）1982.10重组胰岛素上市，迄今已有166多种生物技术药物投放市场，369种进入三期临床，760多种进入I-II期，2600多种处于临床前研究。生物药物的特点1.药理学特性 （1）治疗的针对性强治疗的针对性强：治疗的生理生化机制合理，疗效可靠。如：细胞色素c治疗组织缺氧。（2）药理活性高药理活性高：精制的高活性物质，具高效的药理活性。（3）毒副作用小，营养价值高：主要是蛋白、核酸、糖、脂类等 （4）生理副作

6、用常有发生：不同生物、不同个体的活性物质的结构有差异。表现在免疫反应和过敏反应。2、生产、制备中的特殊性、生产、制备中的特殊性 （1）原料中的有效物质含量低有效物质含量低：杂质种类多且含量高，提取纯化工艺复杂。如，胰腺中胰岛素的含量仅0.002%。（2）稳定性差稳定性差：生物大分子药物是以严格的空间构象来维持其生物活性功能，一旦受到破坏，即失去其药理功能。如被体内酶水解，理化因素等。（3）易腐败易腐败：原料和产品均为高营养物质，易染菌、腐败，失去活性，并产生热源和致敏物质（4）注射用药有特殊要求：生物药物易被胃肠道中的酶所分解，所以多为注射用药。因此对制剂的均一性、安全性、均一性、安全性、稳定

7、性、有效性稳定性、有效性等都有严格要求。同时对其理化性质、检理化性质、检验方法、剂型、剂量、处方、贮存方式验方法、剂型、剂量、处方、贮存方式等也有明确要求。（5）相对分子质量较大.（6）生产工艺可能影响活性3、检验上的特殊性、检验上的特殊性 （1）理化检验指标 （2）生物活性检验指标生物活性检验指标第二节第二节 生物药物的分类与临床用途生物药物的分类与临床用途一、生物药物的分类一、生物药物的分类（一）按其来源和制造方法对生物药物分类（一）按其来源和制造方法对生物药物分类1.1.动物来源：来源于动物脏器动物来源：来源于动物脏器2.2.微生物来源：发酵微生物来源：发酵 微生物药物微生物药物 (mi

8、crobial medicine)微生物药物是一类特异的天然有机化合物，包括微微生物药物是一类特异的天然有机化合物，包括微生物的次级代谢产物，初级代谢产物和微生物结构物生物的次级代谢产物，初级代谢产物和微生物结构物质，还包括借助微生物转化（质，还包括借助微生物转化（microbial microbial transformationtransformation）产生的用化学方法难以全合成的药）产生的用化学方法难以全合成的药物或中间体。物或中间体。细菌放线菌真菌（1）抗生素（2）维生素（3）氨基酸（4）酶抑制剂（5）免疫抑制剂3.3.植物来源植物来源4.4.现代生物技术产品：基因工程，单克隆抗体

9、，现代生物技术产品：基因工程，单克隆抗体，转基因动物。转基因动物。5.5.化学合成：多肽，核酸片段化学合成：多肽，核酸片段（二）按药物的化学本质和化学特性来分（二）按药物的化学本质和化学特性来分 1.AA1.AA及其衍生物类药物及其衍生物类药物 2.2.多肽和蛋白质类药物多肽和蛋白质类药物 3.3.酶与辅酶类药物酶与辅酶类药物 4.4.核酸及其降解物和衍生物类药物核酸及其降解物和衍生物类药物 5.5.糖类药物糖类药物 6.6.脂类药物脂类药物 7.7.细胞生长因子类细胞生长因子类 8.8.生物制品类生物制品类（三）按生理功能和用途分类（三）按生理功能和用途分类 1.1.治疗用药治疗用药 2.2

10、.预防用药预防用药 3.3.诊断用药诊断用药 4.4.其他生物医药用药：生化试剂、保健品、化其他生物医药用药：生化试剂、保健品、化妆品、食品、药用材料。妆品、食品、药用材料。二、生物药物的临床用途二、生物药物的临床用途（一）作为治疗药物（一）作为治疗药物 1 1、内分泌障碍治疗剂、内分泌障碍治疗剂 7 7、抗病毒药物、抗病毒药物 2 2、维生素类药物、维生素类药物 8 8、抗辐射药物、抗辐射药物 3 3、中枢神经系统药物、中枢神经系统药物 9 9、抗肿瘤药物、抗肿瘤药物 4 4、血液与造血系统药物、血液与造血系统药物 1010、计划生育药物、计划生育药物 5 5、呼吸系统药物、呼吸系统药物 1

11、111、生物制品类治疗剂、生物制品类治疗剂 6 6、心血管系统药物、心血管系统药物 （二）作为预防药物（二）作为预防药物 传统性疫苗：传统性疫苗：灭活疫苗是经过处理后，去除致病力，保留其免疫原性而成的疫苗。减毒疫苗是指保留一定的剩余毒力和免疫性制成疫苗，接种人体后，使机体产生一定的感染而获得免疫力。新型疫苗：新型疫苗：重组疫苗应用基因工程技术制成的疫苗，如基因重组乙肝疫苗。基因重组方法还可制成更多种类、更价廉、更安全有效的疫苗或多价疫苗。核酸疫苗是将编码某种抗原蛋白的外源基因(DNA 或RNA)直接导入动物体细胞内,并通过宿主细胞的表达系统合成抗原蛋白,诱导宿主产生对该抗原蛋白的免疫应答,以达

12、到预防和治疗疾病的目的。（三）作为诊断药物（三）作为诊断药物 1 1、免疫诊断试剂、免疫诊断试剂 2 2、酶诊断试剂、酶诊断试剂 3 3、器官功能诊断试剂、器官功能诊断试剂 4 4、放射性核素诊断药物、放射性核素诊断药物 5 5、诊断用单克隆抗体、诊断用单克隆抗体 6 6、基因诊断芯片、基因诊断芯片（四）用作其他生物医药用品（四）用作其他生物医药用品 1 1、生化试剂系列、生化试剂系列 2 2、生物医学材料、生物医学材料 3 3、营养保健品及美容化妆品、营养保健品及美容化妆品 第三节第三节 生物药物的研究进展生物药物的研究进展一、天然生物药物的研究发展前景一、天然生物药物的研究发展前景 1 1

13、深入研究开发深入研究开发人体人体来源的新型生物药物来源的新型生物药物 2 2扩大和深入研究开发扩大和深入研究开发动物动物来源的天然活性物质来源的天然活性物质 3 3努力促进海洋药物和努力促进海洋药物和海洋海洋活性物质的开发研究活性物质的开发研究 4 4综合应用现代生物技术综合应用现代生物技术,加速天然生物药物的加速天然生物药物的 创新和产业化创新和产业化 5 5中西结合创制新型生物药物。中西结合创制新型生物药物。二、生物技术药物研究发展前景二、生物技术药物研究发展前景生物技术药物（也称基因工程药物，生物技术药物（也称基因工程药物，Biotech drugsBiotech drugs）,指以指以

14、DNADNA重组技术生产的蛋白重组技术生产的蛋白质、多肽、酶、激素、疫苗、单克隆抗体和细胞质、多肽、酶、激素、疫苗、单克隆抗体和细胞生长因子等药物。生长因子等药物。20082008年生物技术药物的市场销售将达到年生物技术药物的市场销售将达到600600亿美元。亿美元。1 生物技术药物的发展已进入蛋白质工程药生物技术药物的发展已进入蛋白质工程药物新时期物新时期第一代重组生物技术药物逐渐被第二代蛋白质工程第一代重组生物技术药物逐渐被第二代蛋白质工程药物所取代药物所取代,蛋白质工程技术日新月异蛋白质工程技术日新月异,点突变技术点突变技术（site-directed mutagenesissite-d

15、irected mutagenesis）、DNADNA改组技术改组技术（DNA shufflingDNA shuffling）、融合蛋白技术、定向进化技、融合蛋白技术、定向进化技术（术（direction evolutiondirection evolution）、基因插入及基因打、基因插入及基因打靶等技术使蛋白质工程药物新品种迅速增加。靶等技术使蛋白质工程药物新品种迅速增加。2发展新型生物技术药物与疫苗和治疗性发展新型生物技术药物与疫苗和治疗性抗体。抗体。FDA已批准17种治疗性抗体，在抗肿瘤、治疗风湿性关节炎，防止感染、抗血小板凝集等方面疗效突出。在369种进入临床试验的生物技术药物中有7

16、5种是抗体类产品，如抗TNF嵌合抗体，TNF-R-Fc融合蛋白。3新的高效表达系统的研究与应用。新的高效表达系统的研究与应用。4生物技术药物新剂型研究迅速发展。生物技术药物新剂型研究迅速发展。5 生物芯片在药物研究中的应用生物芯片在药物研究中的应用生物芯片（生物芯片（biochipbiochip）是指通过微加工和微电子技）是指通过微加工和微电子技术在固体载体的表面上构建的可准确、大信息量检术在固体载体的表面上构建的可准确、大信息量检测生物组分的微型分析系统测生物组分的微型分析系统,它包含基因芯片它包含基因芯片（gene chipgene chip）、蛋白质芯片（、蛋白质芯片（protein p

17、rotein chip chip）、细胞芯片（、细胞芯片（cell chipcell chip）、组织芯片、组织芯片（tissue chiptissue chip）和小分子芯片（和小分子芯片（small-small-molecule microarraymolecule microarray）及芯片实验室（及芯片实验室（lab-on-lab-on-a-chipa-chip）或微流芯片（或微流芯片（microfuidicsmicrofuidics）等种类。）等种类。6、反义核酸药物和、反义核酸药物和RNA干扰干扰 使用互补的核酸与特定的使用互补的核酸与特定的mRNAmRNA相结合，抑制其作相结合

18、，抑制其作用，这种核酸药物的先驱就是反义药物。用，这种核酸药物的先驱就是反义药物。7 7、将基因组学和蛋白质组学的研究成果转化、将基因组学和蛋白质组学的研究成果转化为生物药物技术新药的研究与开发。为生物药物技术新药的研究与开发。第四节第四节 生物技术药物生物技术药物一、美国，欧盟和中国生物技术药物的比较一、美国，欧盟和中国生物技术药物的比较（一）美国批准的生物技术药物（一）美国批准的生物技术药物（二）欧盟批准的生物技术药物（二）欧盟批准的生物技术药物（三）中国批准的生物技术药物（三）中国批准的生物技术药物v从生物药物品种看，北美制药企业占据了63%，欧洲为25%，日本为7%，包括中国在内的其他

19、地区比较少，加一起只有5%；v从市场份额看，也是北美和欧洲占了绝大多数，两者之外的其他地区合计为37%。v近年来发展较快的生物技术药物包括：1）抗体药物，2007年全球市场达到258亿美元，约占生物药物的三分之一，2010年达480亿美元；2)疫苗，虽然销售额并不太高，2009年380亿，因此销售额不会太高，但其产量及品种也占生物技术药物的三分之一；3)其他生物治疗药物，包括基因工程药物、核酸药物、细胞治疗、基因治疗等，市场规模合计约400亿美元。在国际上生物技术已取得的研究成果中，60%以上是医药领域上世纪世纪 90年代以来，全球医药行业年均不到10的增长速度，而全球生物药品销售额以年均 3

20、0以上的速度增长。全球生物技术产业销售总额已由1996年的150亿美元，到2007 年 828亿美元2009年生物技术药物共1300亿美元。(全球医药8150亿）。到 2006年初，美国已有生物技术公司2000 家以上，其中有300 多家公司上市，市场资本总额近 3400亿美元，生物制药企业已呈规模。二、建立我国生物技术药物研究创新体系二、建立我国生物技术药物研究创新体系 1.1.研究开发具有自主知识产权的基因工程药物。研究开发具有自主知识产权的基因工程药物。2 2加强基因工程抗体的研究开发。加强基因工程抗体的研究开发。3 3加速基因治疗技术平台体系的建设。加速基因治疗技术平台体系的建设。4

21、4大力开展干细胞与组织工程研究。大力开展干细胞与组织工程研究。5 5突出新型基因工程疫苗的研究与开发采用基因突出新型基因工程疫苗的研究与开发采用基因 工程技术工程技术,克隆和表达保护性抗原基因克隆和表达保护性抗原基因,利用表利用表 达的抗原产物或重组体自身制成的疫苗称为重达的抗原产物或重组体自身制成的疫苗称为重 组疫苗组疫苗,是新一代疫苗的研制方向。是新一代疫苗的研制方向。制造技术的特点：制造技术的特点：1.目的物存在于组成非常复杂的生物材料中目的物存在于组成非常复杂的生物材料中 一种生物材料含有成千上万种成分，各种化合物一种生物材料含有成千上万种成分，各种化合物的形状、大小、分子形式和理化性

22、质各不相同，其中的形状、大小、分子形式和理化性质各不相同，其中不少还是未知物，而且有效物质在制备过程尚处于代不少还是未知物，而且有效物质在制备过程尚处于代谢动态中，故常常无固定工艺可循。谢动态中，故常常无固定工艺可循。2.有些目的物在生物材料中含量极微有些目的物在生物材料中含量极微 只达万分之一、十万分之一、甚至百万分之一，因只达万分之一、十万分之一、甚至百万分之一，因此分离纯化步骤多，难于获得高收率。此分离纯化步骤多，难于获得高收率。3.生物活性成分易变性、破坏生物活性成分易变性、破坏4.生物药物制造受理化因素和生物学因素影响生物药物制造受理化因素和生物学因素影响 生物活性成分离开生物体后，

23、易变性破坏，分离生物活性成分离开生物体后，易变性破坏，分离过程必须十分小心，以保护有效物质的生物活性。过程必须十分小心，以保护有效物质的生物活性。以致许多工艺设计理论性不强以致许多工艺设计理论性不强 制造工艺几乎都在溶液中进行制造工艺几乎都在溶液中进行 温度、温度、pH、离子强度、离子强度 对溶液中各种组分的综合影响常常难于固定对溶液中各种组分的综合影响常常难于固定5.生物药物常采用生物药物常采用“多阶式多阶式”法法纯化一种有效物质常常要联用几个，甚至十几个步纯化一种有效物质常常要联用几个，甚至十几个步骤并变换不同类型的分离方法交互进行才能达到目骤并变换不同类型的分离方法交互进行才能达到目的。

24、的。为了保护目的物的活性及结构完整性为了保护目的物的活性及结构完整性即即“逐级分离逐级分离”法。法。6.生物药物的均一性检测与化学上的纯度概念生物药物的均一性检测与化学上的纯度概念 不完全相同不完全相同生物大分子类药物的分离纯化主要原理是：生物大分子类药物的分离纯化主要原理是：1）根据分子形状和分子大小不同的分离方法）根据分子形状和分子大小不同的分离方法如，差速离心，超速离心，膜分离透析。电如，差速离心，超速离心，膜分离透析。电透析、超滤和凝胶过滤等。透析、超滤和凝胶过滤等。2）根据分子电离性质（带电性）不同的分离方法）根据分子电离性质（带电性）不同的分离方法如，离子交换法、电泳法和电聚焦法等

25、。如，离子交换法、电泳法和电聚焦法等。3）根据分子极性大小与溶解度不同的分离方法）根据分子极性大小与溶解度不同的分离方法如，溶剂提取法、逆流分配法、分配层析法、如，溶剂提取法、逆流分配法、分配层析法、盐析法、等电点沉淀法和有机溶剂分级沉淀盐析法、等电点沉淀法和有机溶剂分级沉淀法。法。4）根据配基特异性不同的分离方法）根据配基特异性不同的分离方法 亲和层析亲和层析 是指利用是指利用生物细胞的代谢反应生物细胞的代谢反应（更多的是利用微生（更多的是利用微生物转化反应）来合成化学方法难于合成的药物或药物物转化反应）来合成化学方法难于合成的药物或药物中间体。中间体。生物合成：生物合成：微生物转化反应：微

26、生物转化反应：是指利用微生物的代谢作用来进行某些化学反应，是指利用微生物的代谢作用来进行某些化学反应，确切地说就是利用微生物代谢过程中某种酶对底物进确切地说就是利用微生物代谢过程中某种酶对底物进行催化反应，以生成所需要的活性物质。行催化反应，以生成所需要的活性物质。微生物转化产物特点：微生物转化产物特点：转化条件温和转化条件温和 具有立体构型单一具有立体构型单一 公害少公害少 后处理简便后处理简便 能进行某些化学反应难于进行能进行某些化学反应难于进行或不能合成的反应或不能合成的反应 为此，在制药工业中得到愈来愈广泛的应用，现已形为此，在制药工业中得到愈来愈广泛的应用，现已形成一个以遗传工程为指

27、导，以发酵工程为基础，包括细胞成一个以遗传工程为指导，以发酵工程为基础，包括细胞工程和酶工程有机结合的生物合成技术体系，工程和酶工程有机结合的生物合成技术体系，半合成技术：半合成技术：1）药物其部分结构由天然资源得到）药物其部分结构由天然资源得到化学合成法制得最终产品化学合成法制得最终产品2）化学合成的中间产物）化学合成的中间产物微生物转化法获得最终有效化合物微生物转化法获得最终有效化合物 生物技术（生物技术（biotechnology）又称为生物工程（又称为生物工程（bioengineering），是利用），是利用生物有机体（动物、植物和微生物）或其组成部生物有机体（动物、植物和微生物）或其

28、组成部分（包括器官、组织、细胞或细胞器等）发展新分（包括器官、组织、细胞或细胞器等）发展新产品或新工艺的一种技术体系。产品或新工艺的一种技术体系。包括：包括：发酵工程发酵工程基因工程基因工程细胞工程细胞工程酶工程酶工程 基因工程技术的定义基因工程技术的定义 用人工方法，提取或制备某种细胞的某种用人工方法，提取或制备某种细胞的某种基因，在体外把它和一种载体连接构建重组基因，在体外把它和一种载体连接构建重组DNA分子，然后导入受体细胞，让其复制与表达，以分子，然后导入受体细胞，让其复制与表达，以改变受体细胞的某些性状或产生人们所需的产物改变受体细胞的某些性状或产生人们所需的产物的工程技术。的工程技

29、术。细胞工程的定义细胞工程的定义 应用细胞生物学和分子生物学的方法应用细胞生物学和分子生物学的方法,通过类通过类似于工程学的步骤似于工程学的步骤,在细胞整体水平或细胞器水平在细胞整体水平或细胞器水平上按照人们的意愿来改变细胞内的遗传物质以获上按照人们的意愿来改变细胞内的遗传物质以获得新型生物或一定细胞产品的一门综合性科学技得新型生物或一定细胞产品的一门综合性科学技术。其技术涉及细胞融合技术、细胞拆和技术、术。其技术涉及细胞融合技术、细胞拆和技术、染色体导入技术、基因转移技术、胚胎移植技术、染色体导入技术、基因转移技术、胚胎移植技术、细胞与组织培养技术等。细胞与组织培养技术等。酶工程的定义酶工程

30、的定义 在酶反应器中在酶反应器中,利用酶的生物催化作用利用酶的生物催化作用,生产出人类生产出人类所需要产品的一门科学技术。例如过去蔗糖几乎全部通所需要产品的一门科学技术。例如过去蔗糖几乎全部通过加工甘蔗或甜菜获得过加工甘蔗或甜菜获得,但现在科学家利用但现在科学家利用-淀粉酶等淀粉酶等多种酶的催化作用多种酶的催化作用,在酶反应器中将淀粉转化成和蔗糖在酶反应器中将淀粉转化成和蔗糖具有同样甜度的高果糖浆具有同样甜度的高果糖浆。发酵工程发酵工程 发酵工程也称为微生物工程，是在最适合条发酵工程也称为微生物工程，是在最适合条件下，对单一菌种进行培养，是生物特定产品件下，对单一菌种进行培养，是生物特定产品的

31、一种生物工艺。的一种生物工艺。单克隆抗体技术单克隆抗体技术 现代生物技术核心现代生物技术核心重组重组DNA技术技术生物工程药物生物工程药物 是指运用重组是指运用重组DNA技术和单克隆抗体技术技术和单克隆抗体技术生产的多肽、蛋白质、激素和酶类药物以及生产的多肽、蛋白质、激素和酶类药物以及疫苗、单抗和细胞生长因子类药物。疫苗、单抗和细胞生长因子类药物。工程菌（或细胞）的大量培养与目的蛋白的生产工程菌（或细胞）的大量培养与目的蛋白的生产基因工程是生物技术中最重要的一种。基因工程是生物技术中最重要的一种。目的基因制备目的基因制备载体的选择和制备载体的选择和制备DNA片段重组连接片段重组连接重组重组DN

32、A导入受体细胞导入受体细胞转化子的筛选转化子的筛选DNA重组体的筛选重组体的筛选DNA重组体的鉴定重组体的鉴定 (一一)基因载体基因载体（VectorVector）一个理想的载体应具备以下几个条件：一个理想的载体应具备以下几个条件：（a a）本身是一个复制子，能自我复制。载体在进入受体细胞后）本身是一个复制子，能自我复制。载体在进入受体细胞后，可自身复制或插入到基因组中，随受体细胞的基因组一起复制。可自身复制或插入到基因组中，随受体细胞的基因组一起复制。（b b）分子量小，小分子的）分子量小，小分子的DNADNA制备时不易损伤，小分子制备时不易损伤，小分子DNADNA限制酶限制酶的切点少。的切

33、点少。（c c）目的基因与载体连结后，可在受体细胞内转录，翻译成蛋白）目的基因与载体连结后，可在受体细胞内转录，翻译成蛋白质产物（表达载体）。质产物（表达载体）。（d d）能给寄主（受体）细胞提供可选择的标记：如抗药性，营养）能给寄主（受体）细胞提供可选择的标记：如抗药性，营养缺陷型或显色表型等，以利于筛选。缺陷型或显色表型等，以利于筛选。（E）具有多克隆位点，便于目的基因片段与载体连接。）具有多克隆位点，便于目的基因片段与载体连接。(F)拷贝数多，便于分离提纯。拷贝数多，便于分离提纯。2、载体的分类、载体的分类 克隆载体克隆载体 表达载体表达载体 转移载体转移载体 探针载体探针载体 质粒（质

34、粒（plasmidplasmid）载体）载体 噬菌体载体：如噬菌体载体：如噬菌体载体、噬菌体载体、M13M13噬菌体载体噬菌体载体 杂合载体杂合载体 (如粘粒如粘粒cosmidcosmid)病毒性载体：逆转录病毒载体、腺病毒载体等病毒性载体：逆转录病毒载体、腺病毒载体等 人工染色体载体人工染色体载体3 3、克隆载体（、克隆载体（cloning vectorcloning vector）（a a）必须是一个复制子，能在受体细胞中复制。）必须是一个复制子，能在受体细胞中复制。复制起点复制起点 OriOri 复制区复制区 复制终点复制终点 termterm （b b）带有抗药性基因）带有抗药性基因

35、TetTet r r：编码膜蛋白，阻止：编码膜蛋白，阻止TetTet进入细胞进入细胞 Amp Amp r r：-内酰胺环水解酶。内酰胺环水解酶。Kan Kan r r：KanKan P ,neoP ,neo p p Cam Cam r r：氯霉素乙酰基转移酶：氯霉素乙酰基转移酶 载体上含有的一个人工合成的载体上含有的一个人工合成的DNADNA片段，其上片段，其上含有数个单一酶切位点，是外源含有数个单一酶切位点，是外源DNADNA的插入部位的插入部位 是载体中的一段碱基序列，由数个酶切位点是载体中的一段碱基序列，由数个酶切位点组成。这些位点在载体上都是单一位点组成。这些位点在载体上都是单一位点p

36、BR322质粒质粒 有两个抗药性基因，每个抗性基因中均含有单有两个抗药性基因，每个抗性基因中均含有单克隆位点，外源克隆位点，外源DNA插入后使相应的抗性基因失活，插入后使相应的抗性基因失活，宿主细胞失去相应的抗药性，不能在含相应抗生素宿主细胞失去相应的抗药性，不能在含相应抗生素的培养基中生长，这一现象称为插入失活。的培养基中生长，这一现象称为插入失活。质粒质粒pBR322的抗性基因筛选示意图的抗性基因筛选示意图4、表达载体（、表达载体（expressing vector）结构：结构：克隆载体克隆载体 +表达构件表达构件 原核生物表达原核生物表达 真核生物表达真核生物表达 ori ampr 基础

37、上加转录和翻译相关基础上加转录和翻译相关element MCS 表达载体表达载体=克隆载体克隆载体+表达元件表达元件 “启动子启动子核糖体结合位点核糖体结合位点克隆位点克隆位点转录终止信号转录终止信号”原核表达载体结构示意图原核表达载体结构示意图(3)(3)哺乳动物表达载体哺乳动物表达载体（1）病毒载体）病毒载体 整合性载体：外源基因通过这种载体与宿主细胞整合性载体：外源基因通过这种载体与宿主细胞的染色体整合。如的染色体整合。如pSV系列载体系列载体 游离型载体：外源基因与这种载体重组后，以病游离型载体：外源基因与这种载体重组后，以病毒颗粒形式在宿主细胞内自行复制或在辅助病毒存毒颗粒形式在宿主

38、细胞内自行复制或在辅助病毒存在下进行复制。如痘苗病毒、腺病毒、杆状病毒和在下进行复制。如痘苗病毒、腺病毒、杆状病毒和逆转录病毒等。逆转录病毒等。（2）质粒载体）质粒载体 常常是穿梭质粒载体。既含原核的复制位点和常常是穿梭质粒载体。既含原核的复制位点和 筛选标记，又含真核的复制位点筛选标记和表达构筛选标记，又含真核的复制位点筛选标记和表达构件。件。1.直接从染色体直接从染色体DNA分离分离 如果物理图谱已确定，可用限制酶直接从原核如果物理图谱已确定，可用限制酶直接从原核生物，噬菌体及动物病毒基因组切取目的基因。生物，噬菌体及动物病毒基因组切取目的基因。2.化学合成化学合成要求：要求：已知目的基因

39、的核苷酸序列或其产物的氨基已知目的基因的核苷酸序列或其产物的氨基酸序列酸序列 基因小基因小 将不同细胞类型或不同阶段细胞的将不同细胞类型或不同阶段细胞的mRNAmRNA逆转录成逆转录成cDNAcDNA后后,将所有将所有cDNAcDNA混合体混合体与载体进行连接后，将所有的重组体分子与载体进行连接后，将所有的重组体分子都引入宿主细胞并进行扩增，所得到的分都引入宿主细胞并进行扩增，所得到的分子克隆的混合体称为子克隆的混合体称为 cDNAcDNA文库。文库。mRNA cDNA 双链双链cDNA 重组重组DNA分子分子 cDNA文库文库 反转录酶反转录酶 载体载体 受体菌受体菌 复制复制*从从cDNA

40、文库获取目的基因文库获取目的基因 逆转录酶逆转录酶A A A A T T T T AAAASISI核酸酶核酸酶 DNA聚合酶聚合酶碱水解碱水解 T T T T 采用限制酶将基因组采用限制酶将基因组DNADNA切成片段，每一个切成片段，每一个DNADNA片段都片段都与一个载体分子拼接成重组与一个载体分子拼接成重组DNADNA，然后将所有的重组体都，然后将所有的重组体都引入宿主细胞并进行扩增，得到的分子克隆的混合体称为引入宿主细胞并进行扩增，得到的分子克隆的混合体称为“基因组文库基因组文库”。从基因组文库中通过杂交筛选得到目的。从基因组文库中通过杂交筛选得到目的基因片段。基因片段。从细胞中分离基因

41、组从细胞中分离基因组DNADNA、用、用SauSau3A3A或或MboMboI I部分消化、部分消化、回收大小在一定范围内的片段、构建重组体。回收大小在一定范围内的片段、构建重组体。组织或细胞染色体组织或细胞染色体DNA基因片断基因片断克隆载体克隆载体重组重组DNA分子分子含重组分子的转化菌含重组分子的转化菌限制性内切酶限制性内切酶受体菌受体菌基因组基因组DNA文库：文库：存在于转化细胞内存在于转化细胞内由克隆载体所携带的所由克隆载体所携带的所有基因组有基因组DNA的集合的集合*从基因组从基因组DNA文文库获取目的基因库获取目的基因 根据目的基因的核苷酸序列设计一对引物以根据目的基因的核苷酸序

42、列设计一对引物以基因组基因组DNADNA为模板经为模板经PCRPCR扩增目的基因。扩增目的基因。以以mRNAmRNA或或RNARNA为模板经为模板经RT-PCRRT-PCR扩增目的基因。扩增目的基因。（三）限制酶的应用限制酶的应用 限制酶限制酶(restriction enzyme):(restriction enzyme):一类专门切割一类专门切割DNADNA的酶。是一类能识别双链的酶。是一类能识别双链DNADNA分子中分子中 的某种特定核的某种特定核苷酸序列，并与其特异结合，并在识别位点或其周苷酸序列，并与其特异结合，并在识别位点或其周围切割双链围切割双链DNADNA的一类核酸内切酶。的一

43、类核酸内切酶。1.定义：定义：2.限制酶的识别和切割位点限制酶的识别和切割位点识别：识别：4 46 6 碱基对，多具有回文结构碱基对，多具有回文结构（palindrom），），少少数识别长序列为数识别长序列为8 8个或个或8 8个以上碱基对，有的存在简并序列个以上碱基对，有的存在简并序列（有的核苷酸位点可以不同有的核苷酸位点可以不同 ）。）。Sau3AI EcoRI Pst Sma5 GATC GAATTC CTGCAG CCCGGG 33 CTAG CTTAAG GACGTC GGGCCC 5 简并序列：简并序列：GTYRAC Y=C/T R=G/A YR=CG/CA/TG/TA Hind可

44、识别可识别4个特定序列个特定序列 3.限制酶的切割方式限制酶的切割方式(1)(1)识别序列内两条链上交错切割，产生单链突出识别序列内两条链上交错切割，产生单链突出的粘性末端的粘性末端(2)(2)对称处同时切断对称处同时切断DNADNA的两条链，产生平端的两条链，产生平端DNADNA片片段段4.限制酶的切割结果限制酶的切割结果切割的结果：切割的结果：产生三种不同的末端产生三种不同的末端 平末端平末端 blunt end 5突出突出 5-protruding（cohesive end）3突出突出 3-protruding（overhang tail）切割的化学本质：切割的化学本质：磷酸二酯键的断裂

45、磷酸二酯键的断裂,形成含形成含5 P和和3OH 末端的两个末端的两个DNA片段。片段。对一特定的对一特定的DNA而言，识别序列碱基对少的，则切点数而言，识别序列碱基对少的，则切点数多，产生的片段小。多，产生的片段小。用同一种酶裂解后，产生相用同一种酶裂解后，产生相同的粘性末端，很容易按照碱基配对的原则以氢键同的粘性末端，很容易按照碱基配对的原则以氢键结合，在结合，在T T4 4DNADNA连接酶的作用下，共价闭合。连接酶的作用下，共价闭合。（双酶切）（双酶切）（单酶切）（单酶切）措施：措施：载体酶切后，用载体酶切后，用APAP（碱性磷酸酶）水解（碱性磷酸酶）水解55端的端的磷酸基团防止载体的自

46、身环化。磷酸基团防止载体的自身环化。G G A T C CC C T A G GBamH 的 识 别 序列 及 切 割 部 位G G A T C CC C T A G GBamH含 目 的 基 因 的 DNA片 段BamHGC C T A G535335535353G G A T C CC C T A G G G A T C C G目 的 基 因 片 段混 合、退 火G C C T A G G A T C C G G A T C C GG C C T A G质 粒 载 体含 目 的 基 因 的 重 组 质 粒G C C T A G G A T C C GDNA连 接 酶双酶切双酶切DNADNA

47、片段粘性末端的连接片段粘性末端的连接 G G A T C CC C T A G GBamHBamHBamHG C C T A G53535553533G A A T T CC T T A A G A A T T C G目 的 基 因 片 段混 合、退 火G C T T A A G A T C C G A A T T C GG C C T A G重 组 质 粒DNA连 接 酶EcoRIEco RI5 G A T C C G G C T T A A A A T T C G G C C T A G G A T C C G G C T T A AEcoRI GATCC G G CCTAG35载 体 以

48、噬菌体、粘粒和真核病毒为载体的重组以噬菌体、粘粒和真核病毒为载体的重组DNADNA分子，体外经包装成为具有感染能力的病毒或噬分子，体外经包装成为具有感染能力的病毒或噬菌体颗粒，才能感染相应的细胞，并在其中扩增。菌体颗粒，才能感染相应的细胞，并在其中扩增。此过程又叫转导（此过程又叫转导（transductiontransduction）。）。原位原位杂交杂交基因工程的基本过程基因工程的基本过程单克隆抗体的定义单克隆抗体的定义：指由指由B B细胞杂交瘤产生的抗体，只识别抗原分子上一细胞杂交瘤产生的抗体，只识别抗原分子上一种抗原决定簇。种抗原决定簇。杂交瘤技术的原理：杂交瘤技术的原理：致敏致敏B细胞

49、（产生抗体的能力）细胞（产生抗体的能力）骨髓瘤细胞（无限繁殖能力）骨髓瘤细胞（无限繁殖能力）融合（融合（B细胞杂交瘤）细胞杂交瘤）单克隆抗体技术骨髓瘤细胞应具有的条件：骨髓瘤细胞应具有的条件：与与B细胞的融合率较高细胞的融合率较高本身不合成本身不合成抗体。抗体。缺乏缺乏HGPRT和和TK。与与B细胞融合后能形成稳定的杂交瘤，能无限增殖细胞融合后能形成稳定的杂交瘤，能无限增殖传代，并分泌特异性抗体。传代，并分泌特异性抗体。融合的方法：融合的方法：PEG（聚乙二醇）（聚乙二醇）vHAT培养基：含培养基：含HAT培养基中的氨基碟呤为叶酸拮抗剂，抑制细胞培养基中的氨基碟呤为叶酸拮抗剂，抑制细胞DNA合

50、成途合成途径，只能由辅助途径合成径，只能由辅助途径合成DNA。骨髓瘤细胞缺乏骨髓瘤细胞缺乏HGPRT和和TK，不能合成，不能合成DNA，不能生存。，不能生存。未融合的未融合的B细胞不能在体外长期生存而自然死亡。细胞不能在体外长期生存而自然死亡。只有杂交瘤细胞从只有杂交瘤细胞从B细胞中获得细胞中获得HGPRT和和TK，又能在体外，又能在体外培养繁殖，因而存活。培养繁殖，因而存活。抗原注入小鼠体内用PEG促使细胞融合得到杂交瘤细胞收集骨髓瘤细胞分离受免淋巴细胞培养骨髓培养骨髓瘤细胞瘤细胞 单抗产品单抗产品 单抗产品单抗产品在HAT培养基中培养克隆杂交瘤细胞扩大组织培养或生成腹水瘤分离纯化筛选产生专