第9章-酶免疫试验-课件.ppt

1、第九章第九章 酶免疫试验酶免疫试验大家好1放射免疫技放射免疫技术术荧光免疫技术荧光免疫技术酶免疫技术酶免疫技术三大经典标记技术三大经典标记技术大家好2掌握：掌握：酶联免疫吸附试验；酶联免疫吸附试验；熟悉：熟悉：酶和酶作用底物、固相载体、酶酶和酶作用底物、固相载体、酶免疫测定的应用；免疫测定的应用；了解：了解：酶标记抗体或抗原、酶免疫技术酶标记抗体或抗原、酶免疫技术的分类；的分类；大家好3第一节第一节 酶免疫试验的组成要素酶免疫试验的组成要素第二节第二节 酶免疫试验的分类酶免疫试验的分类第三节第三节 酶联免疫吸附试验酶联免疫吸附试验第四节第四节 酶联免疫斑点试验酶联免疫斑点试验第五节第五节 发光

2、酶免疫试验发光酶免疫试验 第六节第六节 酶免疫试验的临床应用及常用商品试剂的方法酶免疫试验的临床应用及常用商品试剂的方法 特点特点第七节第七节 影响酶免疫试验的主要因素影响酶免疫试验的主要因素大家好4enzyme immunoassay,EIA 以酶标记抗体（抗原）作为主要以酶标记抗体（抗原）作为主要试剂，将酶高效催化反应的试剂，将酶高效催化反应的专一性专一性和和抗原抗体反应的抗原抗体反应的特异性特异性相结合的免疫相结合的免疫检测技术。检测技术。酶免疫测定技术酶免疫测定技术 酶免疫组织化学技术酶免疫组织化学技术大家好5抗原抗体反应的特异性抗原抗体反应的特异性+酶高效催化反应的专一性酶高效催化反

3、应的专一性原理及特点原理及特点大家好6原理：原理：酶标抗体（抗原）与抗原（抗体）酶标抗体（抗原）与抗原（抗体）的特异性反应的特异性反应酶对底物的显色反应酶对底物的显色反应对抗原或抗体进行定位、定性或对抗原或抗体进行定位、定性或定量的测定分析定量的测定分析 原原 理理 及及 特特 点点大家好7灵敏度高、特异性强、准确性好灵敏度高、特异性强、准确性好酶标记试剂能够较长时间保持稳定酶标记试剂能够较长时间保持稳定操作简便、对环境没有污染。操作简便、对环境没有污染。易与其它技术偶联易与其它技术偶联衍生出适用范围更广的新方法衍生出适用范围更广的新方法。大家好8第一节第一节 酶免疫试验的组成要素酶免疫试验的

4、组成要素大家好9固相抗体或抗原是固相抗体或抗原是非均相酶非均相酶免疫免疫技术中将游离和结合的酶标记物技术中将游离和结合的酶标记物迅速分离的最常用方法迅速分离的最常用方法 固相抗体或抗原固相抗体或抗原就是把抗体或抗原就是把抗体或抗原结合到固相载体的表面结合到固相载体的表面 一、固一、固 相相 载载 体体大家好10要求要求 结合抗体或抗原的容量大结合抗体或抗原的容量大 抗体或抗原牢固地固定在其表面抗体或抗原牢固地固定在其表面 不影响免疫反应性不影响免疫反应性 利于反应充分进行利于反应充分进行 固相方法简便易行，快速经济固相方法简便易行，快速经济种类种类微孔板微孔板磁微粒磁微粒膜载体膜载体 固相载体

5、固相载体大家好11将抗原或抗体结合于固相载体将抗原或抗体结合于固相载体（直接包被直接包被、间接包被）、间接包被）用用1%1%5%5%的牛血清白蛋白或的牛血清白蛋白或5%5%20%20%小牛血清消除固相载体表面未小牛血清消除固相载体表面未结合的位点，消除非特异性吸附结合的位点，消除非特异性吸附包被包被coatingcoating封闭封闭blockblockinging二、包被抗原或抗体二、包被抗原或抗体大家好12直接包被l稀释抗原或抗体（用0.05mol/LPH9.6的碳酸盐缓冲液稀释抗原或抗体到3-10g/mL）l4c过夜l封闭（牛血清白蛋白或小牛血清）大家好13间接包被l亲和素-生物素化抗体

6、（抗原）lSPA-抗体（抗原）l间接吸附于固相载体上大家好141.1.辣根过氧化物酶（辣根过氧化物酶（HRPHRP）2.2.碱性磷酸酶碱性磷酸酶 （ALP)ALP)3.3.-半乳糖苷酶半乳糖苷酶 (-Gal)三、酶结合物三、酶结合物大家好15邻苯二胺邻苯二胺 (OPD)(OPD)四甲基联苯胺四甲基联苯胺 TMBTMB5-5-氨基水杨酸氨基水杨酸(5-ASA)(5-ASA)2,2-2,2-氨基氨基-二二(3-(3-乙基乙基-苯并噻唑啉磺酸苯并噻唑啉磺酸-6)-6)铵盐铵盐 (ABTS)(ABTS)常用底物常用底物四、酶的显色底物与酶促发光底物四、酶的显色底物与酶促发光底物大家好16OPDOPD反

7、应后显反应后显橙黄橙黄色色，加酸终止反，加酸终止反应后呈应后呈棕黄色棕黄色，测定波长测定波长492nm492nm。不稳定，致癌性。不稳定，致癌性。TMBTMB反应后显反应后显蓝色蓝色 ，加酸终止反应后变加酸终止反应后变为为黄色黄色,测定波长测定波长450nm 450nm，稳定，无，稳定，无致癌性，致癌性，ELISAELISA中应中应用最广泛的底物。用最广泛的底物。HRPHRP的常见底物的常见底物 酶和酶作用底物酶和酶作用底物大家好17ALPALP底物底物-Gal-Gal的底物的底物 对对-硝基苯硝基苯磷酸酯磷酸酯（pNPP pNPP）4-4-甲基伞酮基甲基伞酮基-D-D半半-乳糖乳糖苷（苷（4

8、MUG 4MUG）经经APAP作用后的产物作用后的产物为为黄色黄色对硝基酚，对硝基酚，最大吸收峰波长为最大吸收峰波长为405 nm405 nm。酶作用后，生成酶作用后，生成高强度荧光物高强度荧光物 ，用荧光计用荧光计 测量。测量。常用底物常用底物酶和酶作用底物酶和酶作用底物大家好18 第二节第二节酶免疫试验的分类酶免疫试验的分类大家好19酶酶免免疫疫试试验验酶免疫组化酶免疫组化酶免疫测定技术酶免疫测定技术均相：不需要分离均相：不需要分离异相异相固相酶免疫试验固相酶免疫试验液相酶免疫试验液相酶免疫试验组织切片或其它标组织切片或其它标本中抗原的定位本中抗原的定位 液体标本中抗原或液体标本中抗原或抗

9、体的定性和定量抗体的定性和定量大家好20用于小分子激素和半抗原（如药用于小分子激素和半抗原（如药物）的测定物）的测定 酶标记物与相应的抗原或抗体结酶标记物与相应的抗原或抗体结合后，标记酶的活性会发生改变，合后，标记酶的活性会发生改变，不用分离结合和游离酶标记物，通不用分离结合和游离酶标记物，通过测定标记酶的活性的改变，而确过测定标记酶的活性的改变，而确定抗原或抗体的含量。定抗原或抗体的含量。原原理理一、均相酶免疫试验一、均相酶免疫试验大家好21最具代表性的两种技术：最具代表性的两种技术：酶放大免疫分析技术酶放大免疫分析技术EMITEMITenzyme-mutiplied immunoassay

10、 technique克隆酶供体免疫分析克隆酶供体免疫分析 CEDIACEDIAcloned enzyme donor immunoassay 均相酶免疫测定均相酶免疫测定大家好22酶放大免疫分析技术酶放大免疫分析技术EMITEMIT示意图示意图常用酶：葡萄糖常用酶：葡萄糖-6-6-磷酸脱氢酶和溶菌酶磷酸脱氢酶和溶菌酶大家好23酶放大免疫分析技术酶放大免疫分析技术EMITEMIT示意图示意图大家好24克隆酶供体免疫分析克隆酶供体免疫分析 （CEDIACEDIA）示意图）示意图大家好25与均相与均相不同之处不同之处需分离游离与结合的酶标记物需分离游离与结合的酶标记物二、异相酶免疫试验二、异相酶免疫

11、试验大家好261 1 关于均相酶免疫测定，下列哪项正确（关于均相酶免疫测定，下列哪项正确（）A A 多用于大分子物质的测定多用于大分子物质的测定 B B 酶标抗原和抗体在固相载体表面形成复合物，作用酶标抗原和抗体在固相载体表面形成复合物，作用于底物显色于底物显色C C 需要分离结合和游离酶标记物需要分离结合和游离酶标记物 D D 常利用酶标记抗原与抗体结合后的空间位阻降低酶常利用酶标记抗原与抗体结合后的空间位阻降低酶活性活性 E E 酶标抗原与待测抗原竞争结合抗体，故最终酶活力酶标抗原与待测抗原竞争结合抗体，故最终酶活力的大小与标本中抗原量负相关的大小与标本中抗原量负相关第二节第二节 习习 题

12、题大家好272 2 酶免疫技术是根据何种特性分为均相和异相的（酶免疫技术是根据何种特性分为均相和异相的（）A A 抗原特性抗原特性 B B 抗体特性抗体特性C C 抗原抗体反应后是否需要分离结合和游离酶标记物抗原抗体反应后是否需要分离结合和游离酶标记物 D D 酶的稳定性酶的稳定性E E 载体特性载体特性大家好28第三节第三节酶联免疫吸附试验酶联免疫吸附试验大家好29底物显色底物显色定性或定量定性或定量的分析的分析原理原理包被包被反应加入待测抗反应加入待测抗体或抗原和酶标体或抗原和酶标抗原或抗体抗原或抗体1 12 2洗涤使结合在洗涤使结合在固相上的抗原固相上的抗原抗体复合物与抗体复合物与未结合

13、的分离未结合的分离3 34 4一、基本原理一、基本原理大家好30二、二、ELISA方法建立的基本步骤方法建立的基本步骤（一）（一）ELISAELISA方法类型的建立方法类型的建立1 1 初步确定方法类型初步确定方法类型2.2.工作条件的优化工作条件的优化3.ELISA3.ELISA检测结果测定检测结果测定（二）对建立的方法进行评价（二）对建立的方法进行评价大家好31固相的抗原或抗体固相的抗原或抗体 酶标记物（酶结合物酶标记物（酶结合物）酶反应的底物酶反应的底物 三个必要试剂三个必要试剂 三、方法类型及反应原理三、方法类型及反应原理大家好32 双抗体夹心法双抗体夹心法方法：方法：用已知抗体包被，

14、加入待检血用已知抗体包被，加入待检血清，再加酶标抗体，加底物显色清，再加酶标抗体，加底物显色应用：应用：二价或二价以上的较大分子抗二价或二价以上的较大分子抗原原测定乙型肝炎表面抗原、甲胎蛋白、测定乙型肝炎表面抗原、甲胎蛋白、HCGHCG等等ELISAELISA检测抗原的方法检测抗原的方法大家好33大家好341、已知抗体包 被于载体表面3、加酶标抗体 与抗原结合4、加酶作用的底物产生颜色2、加待检物抗原与抗体结合4、加酶作用的底物 不产生颜色双抗体夹心法测抗原双抗体夹心法测抗原1、已知抗体包 被于载体表面2、加待检物无抗 原与抗体结合3、加酶标抗体 无抗原结合E EE EE EE EE EE E

15、E EE EE E+-大家好35竞争法竞争法方法：方法：用已知抗体包被，同时加入待测血清用已知抗体包被，同时加入待测血清和酶标抗原，酶标抗原与待检物竞争与包被和酶标抗原，酶标抗原与待检物竞争与包被物结合。加底物显色。物结合。加底物显色。应用：应用：用于只有一个抗原决定簇的小分子半用于只有一个抗原决定簇的小分子半抗原（药物、激素等）抗原（药物、激素等）ELISAELISA检测抗原的方法检测抗原的方法大家好36大家好37竞争法测抗原竞争法测抗原+-E EE EE E2 2、加待检物、加待检物抗原与酶标抗抗原与酶标抗原竞争与抗体原竞争与抗体结合结合3 3、加酶作用、加酶作用的底物不显色的底物不显色或

16、显色弱或显色弱3 3、加酶作用、加酶作用的底物显色的底物显色1 1、已知抗体包、已知抗体包被于载体表面被于载体表面1 1、已知抗体包、已知抗体包被于载体表面被于载体表面2 2、加待测物、加待测物和酶标抗原，和酶标抗原，酶标抗原与抗酶标抗原与抗体结合体结合E EE EE EE EE E大家好38 间接法间接法方法方法用已知抗原包被，加入待测血清，再加酶标的用已知抗原包被，加入待测血清，再加酶标的抗人抗人IgGIgG（抗抗体或二抗）加底物显色。（抗抗体或二抗）加底物显色。优点优点一种酶标抗抗体检测各种与抗原相应的抗体一种酶标抗抗体检测各种与抗原相应的抗体应用应用常测定常测定HCVHCV抗体、抗体、

17、HIVHIV抗体和梅毒螺旋体抗体等抗体和梅毒螺旋体抗体等ELISAELISA检测抗体的方法检测抗体的方法大家好39大家好401、已知抗原吸附于载体表面2、加待检物无抗体与抗原结合3、加酶标抗Ig与抗体结合4、加酶作用的底物产生颜色1、已知抗体吸附于载体表面2、加待检物有抗体与抗原结合3、加酶标的抗Ig抗体4、加酶作用的底物不产生颜色间接法测抗体间接法测抗体-E EE EE EE EE EE EE EE EE E大家好41 双抗原夹心法双抗原夹心法原理：类似双抗体夹心法原理：类似双抗体夹心法操作步骤：类似操作步骤：类似 应用：乙型肝炎表面抗体应用：乙型肝炎表面抗体ELISAELISA检测抗体的方

18、法检测抗体的方法大家好42ELISAELISA检测抗体的方法检测抗体的方法大家好43竞争法竞争法大家好44非经典竞争法非经典竞争法大家好45非经典竞争法非经典竞争法大家好46捕获法捕获法 应用：应用：病原体急性感染诊断中的病原体急性感染诊断中的IgMIgM型抗型抗体体 甲型肝炎甲型肝炎HAV-IgMHAV-IgM抗体抗体 乙型肝炎病毒核心乙型肝炎病毒核心HBc-IgMHBc-IgM抗体抗体ELISAELISA检测抗体的方法检测抗体的方法大家好47捕获法捕获法 原理：原理：抗人抗人IgMIgM链抗体包被链抗体包被捕获待测标本中捕获待测标本中IgMIgM类类抗体抗体加入特异性抗原和酶加入特异性抗原

19、和酶标记特异性抗原的抗标记特异性抗原的抗体体 底物显色底物显色 大家好48捕获法原理捕获法原理+-E EE EE EE EE E 1 1、固相化抗人、固相化抗人IgMIgM1 1、固相化抗人、固相化抗人IgMIgM2 2、加待测物、加待测物特异性特异性IgMIgM与与非特异性非特异性IgMIgM和抗人和抗人IgMIgM结合结合3 3、加特异性、加特异性抗原，与特异抗原，与特异性抗体结合性抗体结合4 4、加酶标抗体、加酶标抗体与特异性抗原结与特异性抗原结合，加底物显色合，加底物显色2 2、加待测物、加待测物只有非特异性只有非特异性IgMIgM和抗人和抗人IgMIgM结合结合3 3、加特异性抗、加

20、特异性抗原，不能与非原，不能与非特异性特异性IgMIgM结合结合4 4、加酶标抗体、加酶标抗体无抗原结合，无抗原结合，加底物不显色加底物不显色大家好491 1 下列哪一种下列哪一种ELISAELISA最常用于抗原的测定（最常用于抗原的测定（）A A 双抗体夹心法双抗体夹心法ELISA B ELISA B 间接法间接法ELISA C C 竞争法竞争法ELISA D D 捕获法捕获法ELISA E E 补体结合法补体结合法2 2 捕获法主要用于何种物质的测定（捕获法主要用于何种物质的测定（）A IgG B IgA C IgM A IgG B IgA C IgM D IgD E IgED IgD E

21、 IgE 第三节第三节 习习 题题大家好503 3 下列关于双抗体夹心法原理，不正确的是（下列关于双抗体夹心法原理，不正确的是（）A A 使用分别针对抗原不同决定簇的两种单克隆抗体作使用分别针对抗原不同决定簇的两种单克隆抗体作为酶标记物为酶标记物 B B 一种单克隆抗体作为固相抗体，另一种作为酶标抗一种单克隆抗体作为固相抗体，另一种作为酶标抗体体 C C 可使标本和酶标抗体同时加入成为一步法可使标本和酶标抗体同时加入成为一步法 D D 用于检测二价或二价以上的抗原用于检测二价或二价以上的抗原 E E 采用高亲和力的单克隆抗体可提高检测的灵敏度和采用高亲和力的单克隆抗体可提高检测的灵敏度和特异性

22、特异性大家好514 4 下列何种方法用一种标记物可检测多种被测物（下列何种方法用一种标记物可检测多种被测物（）A ELISAA ELISA双抗体夹心法双抗体夹心法 B ELISAB ELISA竞争法竞争法C C 放射免疫法放射免疫法 D ELISAD ELISA捕获法捕获法 E ELISAE ELISA间接法间接法5 5 关于关于ELISAELISA竞争法，下列叙述正确的是（竞争法，下列叙述正确的是（）A A 用于检测抗原用于检测抗原 B B 被测物与酶标记物的免疫活性各不相同被测物与酶标记物的免疫活性各不相同C C 被测物多则标记物被结合的机会少被测物多则标记物被结合的机会少D D 待测管的

23、颜色比对照管的浅则表示被测物量少待测管的颜色比对照管的浅则表示被测物量少E E 结合于固相的酶标记抗原量与被测抗原量成正比结合于固相的酶标记抗原量与被测抗原量成正比大家好52第第四节四节 酶联免疫斑点试验酶联免疫斑点试验大家好53酶联免疫斑点试验酶联免疫斑点试验(ELISPOT(ELISPOT或或ElisaSpot)ElisaSpot)包被有待测细胞因子抗体的微孔板包被有待测细胞因子抗体的微孔板 分泌相应细胞因子的待测细胞分泌相应细胞因子的待测细胞 有或无刺激物培养有或无刺激物培养细胞因子被板上的特异性抗体捕获细胞因子被板上的特异性抗体捕获后续的反应如同后续的反应如同ELISAELISA 一个

24、斑点代表一个细胞因子分泌细胞，斑点的颜一个斑点代表一个细胞因子分泌细胞，斑点的颜色深浅程度与细胞分泌的细胞因子量相关色深浅程度与细胞分泌的细胞因子量相关 基本原理+大家好54酶联免疫斑点试验酶联免疫斑点试验(ELISPOT)(ELISPOT)大家好55第第五节五节 发光酶免疫试验（发光酶免疫试验（LEIALEIA）原理：原理：参与催化某一发光反应的酶来标记抗体（或抗原），在抗原-抗体反应后加入发光物，酶催化和分解底物发光，由光检测仪检测发光强度，最后通过标准曲线计算出被测物的含量。化学发光酶免疫试验化学发光酶免疫试验荧光酶免疫试验荧光酶免疫试验大家好56 荧光酶免疫试验荧光酶免疫试验大家好57

25、 第六节第六节 酶免疫试验的临床应用酶免疫试验的临床应用 及常用商品试剂的方法特点及常用商品试剂的方法特点大家好58（一）（一）均相酶免疫均相酶免疫测定主要用于药物和小分子物质测定主要用于药物和小分子物质的检测。的检测。（二）（二）异相酶免疫异相酶免疫ELISAELISA用于临床血液及其他体液标志物用于临床血液及其他体液标志物ELISPOTELISPOT监测监测HIVHIV等疫苗研究免疫应答反应、移植研等疫苗研究免疫应答反应、移植研究、究、Th0/Th1/Th2Th0/Th1/Th2细胞转换分析、自身免疫研究、细胞转换分析、自身免疫研究、过敏机制探讨、传染性疾病研究。过敏机制探讨、传染性疾病研

26、究。（三）（三）发光酶免疫试验发光酶免疫试验用于微量物质的定量检测用于微量物质的定量检测.大家好59 第七节第七节 影响酶免疫试验的主要因素影响酶免疫试验的主要因素一、试剂盒原材料因素一、试剂盒原材料因素二、标本因素二、标本因素三、实验室环境因素三、实验室环境因素四、操作因素四、操作因素 大家好60抗原抗原要求纯度高，抗原性完整要求纯度高，抗原性完整 抗体抗体需要特异性好、效价高、亲合力需要特异性好、效价高、亲合力强以及比活性较高，能批量生产，易强以及比活性较高，能批量生产，易纯化。纯化。抗原抗体选择抗原抗体选择大家好611 1酶免疫技术的要点？酶免疫技术的要点？2 2酶联免疫吸附试验的原理酶

27、联免疫吸附试验的原理?3 3常用的底物有哪几类？特点？常用的底物有哪几类？特点？4 4常用的酶有哪几类？特点？常用的酶有哪几类？特点？思思 考考 题题大家好62l酶免疫技术是标记免疫技术的一种，它是以酶标酶免疫技术是标记免疫技术的一种，它是以酶标记的抗原或抗体作为主要试剂的免疫检测方法，记的抗原或抗体作为主要试剂的免疫检测方法，在抗原与抗体的特异性反应完成后，通过酶对底在抗原与抗体的特异性反应完成后，通过酶对底物的作用进一步提高敏感性。物的作用进一步提高敏感性。l均相酶免疫测定主要用于小分子激素和半抗原的均相酶免疫测定主要用于小分子激素和半抗原的测定，异相酶免疫测定根据是否使用固相支持物，测定

28、，异相酶免疫测定根据是否使用固相支持物，又可分为液相和固相酶免疫测定两种类型。又可分为液相和固相酶免疫测定两种类型。小小 结结大家好63标记酶的要求：标记酶的要求：1.1.纯度高纯度高,活性强活性强,催化反应效率高。催化反应效率高。2.2.易与抗体或抗原结合标记后酶活易与抗体或抗原结合标记后酶活性稳定，不影响抗原抗体反应性。性稳定，不影响抗原抗体反应性。3.3.作用专一，且酶活性不受样品其作用专一，且酶活性不受样品其他成分影响。他成分影响。大家好64标记酶的要求：标记酶的要求：4.4.酶催化底物后产生的产物易于判酶催化底物后产生的产物易于判断或测量，方法敏感，重复性好，简断或测量，方法敏感，重

29、复性好，简单易行。单易行。5.5.酶、辅助因子及其底物对人体和酶、辅助因子及其底物对人体和环境无害，易于配制、保存，价廉易环境无害，易于配制、保存，价廉易得。得。大家好65辣根过氧化物酶（辣根过氧化物酶（HRPHRP）糖蛋白（主酶）糖蛋白（主酶）亚铁血红素（辅基）亚铁血红素（辅基）主酶与酶活性无关主酶与酶活性无关 辅基是酶的活性中心辅基是酶的活性中心RZRZ值：值：403nm 403nm（辅基）（辅基）与与275nm275nm（主酶）（主酶）ODOD值之比值之比 RZRZ值与酶活性无关，值与酶活性无关，酶活性单位比酶活性单位比RZRZ值值更为重要更为重要 ELISAELISA中应用最为广中应用

30、最为广泛的标记用酶泛的标记用酶 常用酶常用酶酶和酶作用底物酶和酶作用底物大家好66碱性磷酸酶（碱性磷酸酶（APAP）菌源性菌源性AP AP 肠黏膜肠黏膜APAP 半乳糖苷酶半乳糖苷酶（-Gal-Gal）用于均相酶用于均相酶免疫测定免疫测定 常用酶常用酶酶和酶作用底物酶和酶作用底物大家好67HRPHRP的底物的底物 DHDH2 2+H+H2 2O O2 2 D+2H D+2H2 2O O HRPHRP供氢体供氢体DHDH2 2习惯上被称为底物，习惯上被称为底物，底物有多种底物有多种 H H2 2O O2 2为受氢体，为受氢体，HRPHRP对受氢体的专一性很高对受氢体的专一性很高 常用底物常用底物

31、酶和酶作用底物酶和酶作用底物大家好68邻苯二邻苯二胺胺 (OPD)(OPD)四甲基联苯胺四甲基联苯胺 TMBTMB5-5-氨基水杨酸氨基水杨酸(5-ASA)(5-ASA)2,2-2,2-氨基氨基-二二(3-(3-乙基乙基-苯并噻唑啉磺酸苯并噻唑啉磺酸-6)-6)铵盐铵盐 (ABTS)(ABTS)常用底物常用底物酶和酶作用底物酶和酶作用底物大家好69OPDOPD反应后显反应后显橙黄橙黄色色，加酸终止反，加酸终止反应后呈应后呈棕黄色棕黄色，测定波长测定波长492nm492nm。不稳定，致癌性。不稳定，致癌性。TMBTMB反应后显反应后显蓝色蓝色 ，加酸终止反应后变加酸终止反应后变为为黄色黄色,测定

32、波长测定波长450nm 450nm，稳定，无，稳定，无致癌性，致癌性，ELISAELISA中应中应用最广泛的底物。用最广泛的底物。HRPHRP的常见底物的常见底物 酶和酶作用底物酶和酶作用底物大家好70ALPALP底物底物-Gal-Gal的底物的底物 对对-硝基苯硝基苯磷酸酯磷酸酯（pNPP pNPP）4-4-甲基伞酮基甲基伞酮基-D-D半半-乳糖乳糖苷（苷（4MUG 4MUG）经经APAP作用后的产物作用后的产物为黄色对硝基酚，为黄色对硝基酚，最大吸收峰波长为最大吸收峰波长为405 nm405 nm。酶作用后，生成酶作用后，生成高强度荧光物高强度荧光物 ，用荧光计用荧光计 测量。测量。常用底

33、物常用底物酶和酶作用底物酶和酶作用底物大家好71酶免疫技术的核心组成部分酶免疫技术的核心组成部分 酶结合物酶结合物（conjugateconjugate）酶标记物酶标记物 通过化学反应让酶通过化学反应让酶与与抗体或抗原形成的抗体或抗原形成的结合物结合物 二、酶标记抗体或抗原二、酶标记抗体或抗原大家好72抗原抗原要求纯度高，抗原性完整要求纯度高，抗原性完整 抗体抗体需要特异性好、效价高、亲合力需要特异性好、效价高、亲合力强以及比活性较高，能批量生产，易强以及比活性较高，能批量生产，易纯化。纯化。制备方法要求制备方法要求(一）酶标记抗体或抗原的制备一）酶标记抗体或抗原的制备大家好73制备方法要求制

34、备方法要求技术方法简单、产率高，重复性好技术方法简单、产率高，重复性好标记反应不影响酶和抗原或抗体的活标记反应不影响酶和抗原或抗体的活性性酶标记物酶标记物稳定稳定，不形成聚合物，不形成聚合物(一）酶标记抗体或抗原的制备一）酶标记抗体或抗原的制备大家好74标记方法标记方法1 1 改良过碘酸钠法（直接法）改良过碘酸钠法（直接法）常用于常用于HRPHRP标记抗体或抗原标记抗体或抗原 2 2 戊二醛交联法戊二醛交联法第一节第一节 酶标记抗体或抗原制备酶标记抗体或抗原制备大家好75戊二醛交联法戊二醛交联法戊二醛分子中有两个相同的戊二醛分子中有两个相同的醛基醛基，可分，可分别与别与HRPHRP和蛋白质分子中的和蛋白质分子中的氨基氨基结合。结合。该法有一步法和二步法。二步法标记效该法有一步法和二步法。二步法标记效率比一步法高，酶标记物质量较均一。率比一步法高，酶标记物质量较均一。第一节第一节 酶标记抗体或抗原制备酶标记抗体或抗原制备大家好76纯化纯化及及鉴定鉴定常用的纯化常用的纯化方法方法：1.1.葡聚糖凝胶葡聚糖凝胶G-200/G-150G-200/G-150过过柱层析纯化柱层析纯化2.50%2.50%饱和硫酸铵沉淀提纯饱和硫酸铵沉淀提纯（二）酶标记物的纯化及鉴定（二）酶标记物的纯化及鉴定大家好77结束结束大家好78