高效液相色谱法-教学课件.ppt

1、高效液相色谱法 主要特点:高压:一般在150-350105 Pa 高速:一般在1 h之内完成分析 高效:GC 2000塔板/米;LC 30000塔板/米 高灵敏:10-9 g ng10-9 g ng 10-11g pg 10-11g pg HPLC的原理及特点 HPLC的主要类型及其分离原理 HPLC的固定相选择 HPLC的流动相选择 HPLC仪器及评价 HPLC的应用 to MSPressure gauge FilterPrecolumn High pressure pumpMixing vesselInjection portTo wasteDetectorAuto samplerAnal

2、ytical columnSignal collectionPulse damperSolvent1Solvent2ReservoirsDegasser1Vacuum pumpDegasser2色谱原理Concentration in Phase AConcentration in Phase BKD=色谱原理高效液相色谱是溶质在固定相和流动相之间进行的一种连续多次的交换过程，它借助溶质在两相之间的分配系数、亲和力、吸附能力、离子交换、分子大小引起的排阻作用等差别使不同溶质进行分离（分离条件）。分离过程受溶质在两相的扩散系数、固定相填料的颗粒大小、填充密度、流动相组成及流速等因素影响。流动相固

3、定相色谱原理-分离过程ISDC色谱参数-保留值保留时间 t R 保留体积VR=tR F,死时间 tM 调整保留时间tR=tR-tM 调整保留体积VR=tR F 色谱参数-容量因子、选择性、相对保留值容量因子k=K =物质在固定相上的量qs物质在流动相上的量qmVsVmtR-tR tM相对保留值 a=tR(2)tR(1)选择性a=tR(2)tR(1)1+k(2)1+k(1)(a-1)=(a-1)k(1)1+k(1)色谱参数-柱效h=h0 exp-(t tR)2 22理论塔板数 N=()2 tRN 有效=N()2k1+kH 有效=H()2 1+kk色谱参数分离度和分离效能总指标R=2 t R(2)

4、-t R(1)W1+W2K1=2 t R(2)-t R(1)W1/2(1)+W1/2(2)R=0.59 K1其它参数：谱带扩张和渗透性提高柱效改变色谱峰的宽窄提高选择性改变色谱峰的间距 高效液相色谱法的原理及参数 HPLC 分类 HPLC 仪器及评价 HPLC 的应用 常见问题及注意事项体积排阻色谱(Size Exclusion Chrom.)反相色谱(Reversed Phase Chrom.)离子交换色谱(Ion Exchange Chrom.)疏水作用色谱(Hydrophobic Interaction)亲和色谱(Affinity Chrom.)金属鏊和色谱(Chelating Chro

5、m.)Size Exclusion Chromatography常用填料：硅胶、甘油基丙基键合、交联葡聚糖或琼脂糖、甲基丙烯酸酯等。主要公司：Merk,Pharmacia,Tosoh,Waters,Synchrom(SEC,GFC,GPC)signal which is sent to the analog outputs for collection,a light trap is化学键合固定相UV/Vis-Fixed Wavelength DetectorComparison between RPC and HICAuto samplerUV/Vis-PhotoDiode Array De

6、tector影响因素：流动相的组成，溶液的pH以及温度。生物物质的分离主要用水,缓冲盐溶液,乙醇及丙酮等.机理-被分离物的与固定相的疏水相互作用力的差别；反相色谱-流动相的极性小于固定相的分离体系；选择性a=Mixing vesselSignal collection2）无固定液流失，增加了色谱柱的稳操作方式 高压 常压-Suppressed异构体多官能团吸附色谱PBS,pH48UV absorbance影响因素：流动相的组成，溶液的pH以及温度。Size Exclusion Chromatography 01000000200000030000004000000500000060000001

7、015202530Buffer:PBS+NaCl Tris-HCl+NaClGradient:No主要用于：测定分子量；目标蛋白的纯化，脱盐等.柱的选择：能够分离相对分子量的上下限为:100-800000，孔径等30KD50KDIon Exchange Chromprotein BProtein Bprotein BProtein BProtein AProteinANa+SO3+-CM常用填料：磺化聚苯乙烯、聚甲基丙烯酸酯、表面改性硅胶等分类：阳离子交换、阴离子交换Ion Exchange ChromBuffer:PBS+NaCl Tris-HCl+NaClGradient:Yes柱的选择：

8、当溶质在pH一定的流动相中带正电荷，选用阳离子交换柱，否则用阴离子交换柱影响因素：盐的类型，离子强度，pH影响选择性 和分离度resin-O-(CH2)2-NH+-NCH3+CH2CH3CH2CH3resin-O-CH2-COO-resin-O-(CH2)3-SO3-Ion Exchange ChromAffinity Chromatography 基质配基目标产物填料：基质-纤维素、凝集素、交联琼脂糖或葡萄糖、聚丙烯酰胺、多孔玻璃配基-抗体、凝集素、酶、抑制剂、抗生素、配位体Affinity Chromatography UV absorbanceFree ligand concentrat

9、ion柱的选择：根据被分离目标产物的特点选择合适的色谱柱，重要是配基。影响因素：配基容易被杂质污染，柱子的寿命短，样品须前处理。主要用于纯化较为昂贵的蛋白，抗体等。Buffer:含有可以与基质上的配基结合物的溶液Gradient:YesHydrophobic interaction Chromatography proteinsurface-+-nonpolarnonpolar填料：基质：有机聚合物（交联琼脂糖、乙烯聚合物、TSK-PW）和大孔硅胶键合相配基：苯基、戊基、丁基、羟丙基、乙基、聚乙二醇、苄基等H3C-C-N-C-O-H3C-C-N-C-O-NHOH3C-C-N-C-O-NHOON

10、Hdecreasing salt concentrationUV absorbanceHydrophobic Interaction Chromatography柱的选择：根据被分离目标产物的疏水性选择合适的色谱柱，基质和配基的类型是关键。影响因素：盐的种类，离子强度，溶液的pH以及温度对疏水作用都影响较大。Buffer:常用：(NH4)2SO4,PBS,pH48Gradient:YesReversed Phase Chromatography反相色谱是指流动相的极性大于固定相的分离体系，其分离机理主要基于溶质与固定相疏水作用的差别 填料：基质：硅胶 配基：C18,C8,C4,Phenyl 硅

11、胶硅胶Reversed Phase Chromatography柱的选择：根据被分离目标产物的疏水性及分子大小选择合适的色谱柱。C18稳定性高，有效孔径小，对分离蛋白容易产生不可逆吸附。影响因素：流动相的组成，溶液的pH以及温度。Comparison between RPC and HIC RPC HIC分离机理 强疏水性 弱疏水性配 基 C18,C8,C4,Phenyl 复杂流动相 有机相，水相，梯度蛋白的分离 容易失活 失活 10%常用于分析 可用于制备可分离物 范围较大 相对较小操作方式 高压 常压Comparison between RPC and NPC正相色谱-流动相的极性小于固定

12、相的分离体系；机理-被分离化合物的极性基团与固定相的极性基团相互作用；流动相-非极性的有机溶剂加入极性的有机溶剂；分离-异构体，易水解，在极性溶剂中溶解度小的物质。反相色谱-流动相的极性小于固定相的分离体系；机理-被分离物的与固定相的疏水相互作用力的差别；流动相-极性的有机溶剂或水；分离-范围最广。RPCNPC 液相色谱固定相1、液液色谱法及离子色谱法固定相 全多孔型担体 表面多孔型担体 化学键合固定相 Si-O-C Si-O-Si-C Si-C Si-N Si-O-Si-C化学键稳定，耐水、耐热、耐有机溶剂，传质快。影响因素：流动相的组成，溶液的pH以及温度。保留时间 t R 保留体积VR=

13、tR F,死时间 tMIon Exchange Chrom配 基 C18,C8,C4,Phenyl 复杂应用HPLC对样品进行分离分析应考虑各种因素,包括样品的性质(相对分子量,化学结构,极性,溶解度参数等化学性质和物理性质),液相色谱分离的类型的特点及应用范围,实验室条件(仪器,色谱柱,检测器等)等因素.angle from the laser,the photodiode produces aChoice of wavelength(s)Ions,organic acids,surfactantsIon Exchange Chrom影响因素：配基容易被杂质污染，柱子的寿命短，样品须前处理。

14、柱的选择：根据被分离目标产物的特点选择合适的色谱柱，重要是配基。Auto samplersugars,derivatized amino acids and carbamate pesticides反相色谱中底剂采用强极性溶剂(水),洗脱剂选择极性较弱的溶剂(有机溶剂).Pulse damper配基：C18,C8,C4,Phenyl色谱参数分离度和分离效能总指标UV/Vis-variable wavelength detectorGradient:No1)流动相纯度 AR2 液固吸附色谱法固定相液固吸附色谱法固定相 硅胶、氧化铝、分子筛、聚酰胺等硅胶、氧化铝、分子筛、聚酰胺等3 离子交换色谱法

15、固定相离子交换色谱法固定相 薄膜型离子交换树脂薄膜型离子交换树脂 离子交换键合固定相离子交换键合固定相 阳离子交换树脂（强酸性、弱酸性树脂）阳离子交换树脂（强酸性、弱酸性树脂）阴离子交换树脂阴离子交换树脂（强碱性、弱碱性树脂）（强碱性、弱碱性树脂）4 空间排阻色谱固定相空间排阻色谱固定相 软质凝胶软质凝胶 葡聚糖凝胶葡聚糖凝胶 琼脂糖凝胶琼脂糖凝胶 水为流动相水为流动相 半硬质凝胶半硬质凝胶 苯乙烯苯乙烯-二乙烯基苯交联共聚凝胶二乙烯基苯交联共聚凝胶(交交联聚苯乙烯凝胶联聚苯乙烯凝胶)适用于非极性有机溶适用于非极性有机溶剂剂,丙酮丙酮 乙醇等极性溶剂不能用乙醇等极性溶剂不能用.硬质凝胶硬质凝胶

16、 多孔硅胶多孔硅胶 多孔玻璃珠等多孔玻璃珠等 液相色谱流动相 GC N2 H2 He LC 流动相的种类流动相的种类,流动相的配比能显著流动相的配比能显著 影响分离效果影响分离效果.流动相选择流动相选择:1)流动相纯度流动相纯度 AR 2)应避免使用会引起柱效损失或保留特性应避免使用会引起柱效损失或保留特性 变化的溶剂变化的溶剂 3)对样品要有适宜的溶解度对样品要有适宜的溶解度 4)溶剂的黏度小一些为好溶剂的黏度小一些为好 5)应与检测器相匹配应与检测器相匹配常用溶剂的极性顺序常用溶剂的极性顺序:水水(极性最大极性最大),甲酰胺甲酰胺,乙腈乙腈,甲醇甲醇,乙醇乙醇,丙醇丙醇,丙酮丙酮,四氢呋喃

17、四氢呋喃,甲乙甲乙酮酮,正丁醇正丁醇,乙酸乙酯乙酸乙酯,乙醚乙醚,二氯二氯甲烷甲烷,氯仿氯仿,溴乙烷溴乙烷,苯苯,甲苯甲苯,四氯四氯化碳化碳,二硫化碳二硫化碳,环己烷环己烷,己烷己烷,庚庚烷烷,煤油煤油,石油醚石油醚(极性最小极性最小).为了获得合适的溶剂强度为了获得合适的溶剂强度(极性极性),常采用二元或常采用二元或多元组合的溶剂体系作为流动相多元组合的溶剂体系作为流动相.采用的溶剂可分为底剂及洗脱剂两部分采用的溶剂可分为底剂及洗脱剂两部分 底剂决定基本的色谱分离底剂决定基本的色谱分离,洗脱剂具有对组分选择性分离洗脱剂具有对组分选择性分离 正相色谱中底剂采用低极性溶剂正相色谱中底剂采用低极性

18、溶剂,洗脱剂选择极洗脱剂选择极性较强的溶剂性较强的溶剂.反相色谱中底剂采用强极性溶剂反相色谱中底剂采用强极性溶剂(水水),洗脱剂选洗脱剂选择极性较弱的溶剂择极性较弱的溶剂(有机溶剂有机溶剂).离子交换色谱主要在含水介质中进行离子交换色谱主要在含水介质中进行,组分保组分保留值可以用流动相中盐的浓度和留值可以用流动相中盐的浓度和 pH来控制来控制,增加增加盐的浓度导致保留值降低盐的浓度导致保留值降低,由于流动相离子与交由于流动相离子与交换树脂相互作用力不同换树脂相互作用力不同,因此流动相中离子类型因此流动相中离子类型对样品组分的保留值有显著影响对样品组分的保留值有显著影响.一般阴离子的滞留次序为一

19、般阴离子的滞留次序为:柠檬酸离子柠檬酸离子SO4 草酸离子草酸离子I NO3 CrO4 Br SCN Cl HCOO CH3COO OH F一般阳离子的滞留次序为一般阳离子的滞留次序为:Ba Pb Ca Ni Cd Cu Co Zn Mg Rb K NH4 Na H Li HPLC分离类型的选择 试样相对分子量相对分子量大于2000小于2000不溶于水溶于水排阻色谱,水为流动相排阻色谱,非水流动相不溶于水同系物正相或反相色谱异构体多官能团吸附色谱分子量大小差异排阻色谱溶于水,不离解反相色谱排阻色谱,水为流动相溶于水,可离解碱-阳离交换色谱酸-阴离交换色谱溶于水,离子和非离子反相离子对色谱 to

20、 MSPressure gauge FilterPrecolumn High pressure pumpMixing vesselInjection portTo wasteDetectorAuto samplerAnalytical columnSignal collectionPulse damperSolvent1Solvent2ReservoirsDegasser1Vacuum pumpDegasser2阳离子交换树脂（强酸性、弱酸性树脂）Pressure gaugeInsensitivity to changes in type of solvent,flow rate,and te

21、mperature.基质-纤维素、凝集素、交联琼脂糖或葡萄糖、聚丙烯酰胺、多孔玻璃H3C-C-N-C-O-正相色谱中底剂采用低极性溶剂,洗脱剂选择极性较强的溶剂.2 t R(2)-t R(1)Maintenance应用HPLC对样品进行分离分析应考虑各种因素,包括样品的性质(相对分子量,化学结构,极性,溶解度参数等化学性质和物理性质),液相色谱分离的类型的特点及应用范围,实验室条件(仪器,色谱柱,检测器等)等因素.Programmable DetectorsThe two halves are separated by a glass plate mounted at an angle suc

22、h that bending of the incident beam occurs if the two solutions differ in refractive index.2）无固定液流失，增加了色谱柱的稳物质在流动相上的量qmvariable wavelength detector保留时间 t R 保留体积VR=tR F,死时间 tM为了获得合适的溶剂强度(极性),常采用二元或多元组合的溶剂体系作为流动相.Vacuum pump离子交换键合固定相DegasserMembraneVacuum chamberPressure sensorControllerThree-way valv

23、e Vacuum pumpHPLC pumpEluent高效液相色谱仪单元介绍PumpPPttPumpto wastePurge valveABCDto mixing chamberAB四元梯度泵-低压混合二元梯度泵-高压混合比例伐DamperAuto samplerInjection portDetector Conductivity Detector UV/Vis Detector Fixed Wavelength Detector variable wavelength detector PhotoDiode Array Detector Refractive Index Detecto

24、r Fluorescence Detector Electrochemical Detector Mass Spectrometry Evaporative Light Scattering Detector UV/Vis-Fixed Wavelength DetectorUV/Vis-variable wavelength detectorn The UV/Vis source usually comes from a monochromator so the wavelength can be selected,or scanned.n Absorbance increases as el

25、uate passes through the cell.n If wavelength scanning is desired,the flow is stopped long enough for the scan to take place.UV/Vis-PhotoDiode Array DetectorConductivity DetectorSensitivities for compounds such as phenol,catecholamines,nitrosamines,and organic acids are in the picomole(nanogram)The m

26、obile phase must be made electrically conductive,usually by the addition of a suitable saltRefractive Index DetectorA valve is opened and pure solvent passes into one half of a cell.The eluate flows through the other half of the cell.The two halves are separated by a glass plate mounted at an angle

27、such that bending of the incident beam occurs if the two solutions differ in refractive index.Fluorescence Detector Short pass-transmits all wavelengths below a specified cutoff Long pass-transmits all wavelengths above a specified cutoff Band pass-blocks all wavelengths outside a specified bandElec

28、trochemical Detectorn Detectors that based on electroanalytical procedures are available.n They offer the advantages of high sensitivity and simplicityEvaporative Light Scattering DetectorThe scattered light is detected by a silicone photodiode located at 90oangle from the laser,the photodiode produ

29、ces asignal which is sent to the analog outputs for collection,a light trap is located 180o from the laser to collect any light not scattered by particles in the aerosol streamOther DetectorProgrammable DetectorsChemiluminescence detectionRadioactivity detectionPulsed-amperometric detectionFT-IRComp

30、arison between different detectorsDetector Compounds SensitivityUV UV/Vis chromophores such as aromatics,aldehydes,ketones1 ppb RIUniversal,all compounds-cannot use gradient mobile phases10 ppmFluorescencesugars,derivatized amino acids and carbamate pesticides10 pptConductivityIons,organic acids,sur

31、factants0.1-10 ppb-Suppressed0.1 ppb-Non-Suppressed10 ppbECDPharmaceuticals,neurochemicals priority pollutants,vitamins,BHT0.1 ppbChemilluminescencTransition metal ions6 pptELSD Universal,all non-volatiles10-100 ppbBasic Detector Requirements Low drift and noise level(trace analysis).High sensitivit

32、y.Fast response for high performance systems.Wide linear dynamic range(quantitation).Low dead volume(minimal peak broadening&remixing of the separated bands).Insensitivity to changes in type of solvent,flow rate,and temperature.Operational simplicity and reliability.Tuneable,so that detection can be

33、 optimized for different compounds.Preferably non-destructive.Detector Criteria Selectivity Sensitivity and detection limit Stability Linear range Dynamic Range Reproducibility Effect on peak shape MaintenanceFactors Increasing SignalIncrease sample concentrationIncrease injection volumeChoice of wavelength(s)Low volume flow cellFlow cell path length谢谢观看！