荧光共振能量转移(FERT)课件.ppt

1、陈陈 同同 生生华南师范大学信息光电子科技学院华南师范大学信息光电子科技学院荧光共振能量转移荧光共振能量转移Fluorescence Resonance Energy Transfer (FRET)分子能级与荧光S0S1T1hn0hn1hn22.荧光（荧光（Fluorescence)：当处于基态的分子吸收光能后进入激发态，并且立即返回基态并以光的形式释放能量，这种光称为荧光。4.激发(Excitation,Ex)和发射(Emission,Em)光谱（Spectra):1.能级（能级（Energy Level）：）：原子的可能状态是不连续的，因此各状态对应能量也是不连续的。包含电子能级、振动能级

2、和转动。3.磷光（磷光（Phosphorescence）:分子从激发三线态返回基态以光的形式释放能量。CFPEx.440nmEx.470nmEm.470nmYFPEm.535nm荧光共振能量转移(FRET)现象3.FRET现象的特征现象的特征:选择性激发供体,却能检测到受体发射的荧光1.供体供体(Donor,D)Donor2.受体受体(Acceptor,A)AcceptorFRET 原理(Principle)FRET的条件66060RRRE发生发生FRETFRET需要需要三三个条件：个条件：1 1、供体分子的发射光谱和受体分子的吸收、供体分子的发射光谱和受体分子的吸收光谱必须有显著的重迭，一般

3、大于光谱必须有显著的重迭，一般大于 3030；2 2、供体分子和受体分子间的距离必须在、供体分子和受体分子间的距离必须在 1 10 nm 1 10 nm 之间之间.D.D和和A A间的间的FRET FRET 效率：效率：3 3、供体分子的发射态偶极矩与受体分、供体分子的发射态偶极矩与受体分子的吸收态偶极矩、以及它们的向量子的吸收态偶极矩、以及它们的向量必须满足一定的条件必须满足一定的条件R0:E=50%时供体和受体分子间的距离.对于特定的供体受体对是常数;R:供体和受体分子间的距离.E:FRET效率.对于R特别灵敏.举例:假设 R0=5nm,1）R=10nm,E=1.5%2）R=5nm,E=5

4、0%3）R=6nm,E=25%450 500 550 600l(nm)D EmA Ex1)蛋白分子的共定位;2)蛋白分子聚合体;3)转录机制;4)转换途径;5)分子运动;6)蛋白折叠等生物学问题.FRET的应用的应用通过 FRET 技术可以获得有关两个蛋白分子之间相互作用的空间信息。常用于解决如下问题:LaserLaserDAFRET技术应用一:检测两个发光分子间的重合与共定位荧光标记利用FRET技术检测不发光分子间相互作用的策略FRET技术应用二:检测分子间的相互作用LaserLaserFRET技术应用三:检测分子的折叠与构象变化FRET技术应用举例：细胞内钙离子浓度的实时测量Miyawak

5、i A,et al.,Nature 1997,388:882-887(b)BFP-GFP BFP-YFP CFP-YFP CFP-dsRED GFP-dsRED在FRET实验中经常使用的供体-受体荧光分子对2.绿色荧光蛋白类(Green Fluorescent Proteins,GFPs)1.染料类(Dye)FITC-Rhodamine Alexa488-Cy3 Cy3-Cy5参考阅读文献参考阅读文献1.Jonathan D.Violin,et al.,A genetically encoded fluorescent reporter reveals oscillatory phosphor

6、ylation by protein kinase C.J Cell Biology,2003,161:8999092.Elizabeth A J et l.,FRET Imaging.Nature Biotechnology,2003,21:13887-13953.Rajesh B S.Fluorescence resonance energy transfer(FRET)microscopy imaging of live cell protein localizations.J Cell Biology,2003,160:6296334.Jin Zhang,et al.,.Genetic

7、ally encoded reporters of protein kinase A activity reveal impact of substrate tethering.PNAS,2001,98:14997150025.Michael G.Erickson,et al.,DsRed as a Potential FRET Partner with CFP and GFP.Biophysical Journal,2003,85:5996116.Alexander Sorkin,et al.,Interaction of EGF receptor and Grb2 in living cells visualized by fluorescence resonance energy transfer(FRET)microscopy.Current Biology 2000,10:13951398 思思 考考 题题2.你认为FRET技术特别适合什么领域?举例说明。1.为什么FRET效率对供体受体分子间的空间距离非常灵敏?3.A和B分子都不能发射荧光,要求采用FRET技术检测二者之间的相互作用特征,请问应该如何处理?论文题目：供体受体对之间R0定量分析与计算