1、课题2 多聚酶链式反应扩增DNA片段PCR技术简史 1971年，Khorana提出：经过DNA变性，与合适引物杂交，用DNA聚合酶延伸引物，并不断重复该过程便可克隆基因。但由于测序和引物合成的困难，以及70年代基因工程技术的发明使克隆基因成为可能，所以，Khorana的设想被人们遗忘了 19851985年，美国年，美国PE-CetusPE-Cetus公司的公司的MullisMullis等人等人发明了聚合酶链反应（发明了聚合酶链反应（PCRPCR）基本原理是在试管中模拟细胞内的基本原理是在试管中模拟细胞内的DNADNA复复制制 最初采用最初采用E-coli DNAE-coli DNA聚合酶进行聚
2、合酶进行PCRPCR，由由于该酶不耐热，使这一过程耗时，费力，于该酶不耐热，使这一过程耗时，费力，且易出错且易出错 耐热耐热DNADNA聚合酶的应用使得聚合酶的应用使得PCRPCR能高效率的能高效率的进行，随后进行，随后PE-CetusPE-Cetus公司推出了第一台公司推出了第一台PCRPCR自动化热循环仪自动化热循环仪 19931993年，年，MullisMullis等因此项技术获诺贝尔化等因此项技术获诺贝尔化学奖学奖PCR原理细胞内参与细胞内参与DNA复制的各种组成成分复制的各种组成成分与反应条件与反应条件DNA复制的知识解旋酶解旋酶DNA母链母链4种脱氧核苷酸种脱氧核苷酸DNA聚合酶聚
3、合酶引物（引物（RNA）打开打开DNA双链双链模板模板合成子链原料合成子链原料催化子链合成催化子链合成使使DNA聚合酶能从聚合酶能从引物引物3端开始连接端开始连接脱氧核苷酸脱氧核苷酸 思考：思考：是什么是什么？DNA的合成方向DNA双链的方向，区分 DNA的3端和5端DNA复制方向示意图DNA变性和复性示意图Taq DNA聚合酶的应用聚合酶的应用vDNA聚合酶的特性，只能从聚合酶的特性，只能从DNA的的3端开始延伸端开始延伸DNA链、而不能从链、而不能从头合成头合成DNAv高温导致高温导致DNA聚合酶失活聚合酶失活v课题课题2“土壤中分解尿素的细菌的分土壤中分解尿素的细菌的分离与计数离与计数”
4、Taq细菌的发现过程细菌的发现过程PCRPCR技术与体内技术与体内DNADNA复制的区别复制的区别：1.PCR1.PCR不需要解旋酶；体内不需要解旋酶；体内DNADNA复制复制需要；需要；2.PCR2.PCR需要耐热的需要耐热的DNADNA聚合酶（常用聚合酶（常用TaqDNATaqDNA聚合酶），而生物体内的聚合聚合酶），而生物体内的聚合酶在高温时会变性；酶在高温时会变性；3.PCR3.PCR一般要经历三十多次循环，而一般要经历三十多次循环，而生物体内生物体内DNADNA复制需要生物体自身的复复制需要生物体自身的复制。制。PCR的反应过程的反应过程v一般采用变性一般采用变性-复性复性-延伸三步
5、循环。延伸三步循环。v变性：将模板DNA或延伸后的双链DNA加热到95，使双螺旋DNA解开成为单链。v复性：通过降低反应温度至55，使两种引物能与两条解开的DNA互补链的3端粘合。v延伸：将反应温度提高到约72，在耐热DNA聚合酶的催化下，合成两条互补链，从而使模板DNA扩增一倍。按照上述步骤重复操作约30次，即可将模板DNA扩增数百万倍。三、实验步骤：三、实验步骤：准备准备好好PCR反应体系的配方反应体系的配方用微量用微量移液移液器按配方在往微量器按配方在往微量离心管中加入各组分离心管中加入各组分盖严盖子，用手指轻轻弹击盖严盖子，用手指轻轻弹击管壁管壁混合混合反应液反应液离心离心10分钟分钟
6、将离心管放入将离心管放入PCR仪上，设置好仪上，设置好循环程序进行循环程序进行反应反应注意事项：详见操作提示注意事项：详见操作提示 四、结果分析与评价四、结果分析与评价DNA 含量的测定：稀释含量的测定：稀释对照调零对照调零测定测定计算（公式见计算（公式见P63）波长波长260nm处读数处读数蒸馏水蒸馏水做对照做对照50倍倍练习巩固练习巩固2、DNA的合成方向总是从子链的哪一端向的合成方向总是从子链的哪一端向哪一端延伸？哪一端延伸？3、PCR技术最突出的优点是技术最突出的优点是A 原理简单原理简单 B 原料易找原料易找C TaqDNA聚合酶有耐热性聚合酶有耐热性D 快速、高效、灵活、易于操作快速、高效、灵活、易于操作4、做、做PCR使用的微量离心管、枪头、缓使用的微量离心管、枪头、缓冲液及蒸馏水使用前必须进行的关键步骤冲液及蒸馏水使用前必须进行的关键步骤是是A 反复洗涤反复洗涤 B 不怕外源不怕外源DNA污染污染C 高压灭菌高压灭菌 D 在在20 储存储存2019POWERPOINTSUCCESS2023-1-262019THANK YOUSUCCESS2023-1-26
