转基因教学讲解课件.ppt

1、2021/7/261(最新整理)转基因2021/7/262转基因生物和基因打靶转基因生物和基因打靶Transgenic animal and gene targeting2021/7/263第一节第一节 转基因动物转基因动物 transgenic animal2021/7/264 用人工方法将外源基因导入或整合到基因用人工方法将外源基因导入或整合到基因组内，并能稳定传代的一类动物。组内，并能稳定传代的一类动物。转入的目的基因称为转基因转入的目的基因称为转基因(transgene)(transgene)，这种转移目的基因的过程称为转基因作用这种转移目的基因的过程称为转基因作用(transgene

2、sis)(transgenesis)。关于关于“转基因转基因”的概念，通常只限于动、的概念，通常只限于动、植物中经基因工程技术进行的基因转移，因此植物中经基因工程技术进行的基因转移，因此品种间不论有性或无性杂交获得新基因的途径品种间不论有性或无性杂交获得新基因的途径都不属此范畴。都不属此范畴。2021/7/265 特点：特点：分子及细胞水平的操作分子及细胞水平的操作 组织和整体水平的表达组织和整体水平的表达2021/7/266分子及细胞水平的操作分子及细胞水平的操作2021/7/267组织和整体水平的表达组织和整体水平的表达2021/7/268目的：目的：从1982年转基因鼠问世以来，转基因动

3、物转基因动物研究在许多领域都取得了令人瞩目的成就。根据不同的目的的目的，转基因动物转基因动物操作可以简单地划分为四种类型：（l）疾病型转基因动物转基因动物（2）利用转基因动物转基因动物制药（3）动物改良型（4）基础生物学研究 2021/7/269转基因研究大事记转基因研究大事记2021/7/26101974年，美国学者年，美国学者Jaenisch应用显应用显微镜注射法把基因导入真核细胞微镜注射法把基因导入真核细胞2021/7/26111981年，美国科学家将外源基因导入动年，美国科学家将外源基因导入动物胚胎，创立了转基因动物技术物胚胎，创立了转基因动物技术2021/7/26121982年获得转

4、基因小鼠年获得转基因小鼠2021/7/26131987年，世界上第一只商业化转基因绵羊在英国年，世界上第一只商业化转基因绵羊在英国著名的罗斯林研究所诞生。这只转基因母羊的乳著名的罗斯林研究所诞生。这只转基因母羊的乳汁中可以分泌汁中可以分泌抗胰蛋白酶。抗胰蛋白酶。2021/7/26141989年，意大利学者用精子作为载体，成年，意大利学者用精子作为载体，成功地获得了纯系转基因小鼠。功地获得了纯系转基因小鼠。2021/7/26151997年年2月，英国罗斯林研究所维尔穆特博月，英国罗斯林研究所维尔穆特博士科研组公布体细胞克隆羊士科研组公布体细胞克隆羊“多利多利”培育成培育成功。功。2021/7/2

5、6161997年年10月，英国罗斯林研究所宣布已克月，英国罗斯林研究所宣布已克隆出隆出3只携带有人凝血因子只携带有人凝血因子基因转染绵羊。基因转染绵羊。2021/7/26171999年年2月，上海遗传研究所宣布转基因试管牛月，上海遗传研究所宣布转基因试管牛“滔滔滔滔”诞生，其体内被检测到带有人的血清白诞生，其体内被检测到带有人的血清白蛋白基因，这项成果被评为当年蛋白基因，这项成果被评为当年“中国十大科技中国十大科技进展进展”之一。之一。2021/7/26182000年年6月月22日晚日晚8时整，生物胚胎工程专家时整，生物胚胎工程专家张涌教授在西北农林科技大学种羊场顺利接生张涌教授在西北农林科技

6、大学种羊场顺利接生了一只雌性体细胞克隆山羊阳阳。了一只雌性体细胞克隆山羊阳阳。2021/7/26192021/7/2620 由于转基因动物体系打破了自然繁殖中由于转基因动物体系打破了自然繁殖中的种间隔离，使基因能在种系关系很远的的种间隔离，使基因能在种系关系很远的机体间流动，它将对整个生命科学产生全机体间流动，它将对整个生命科学产生全局性影响。局性影响。因此转基因动物技术在因此转基因动物技术在19911991年第一次年第一次国际基因定位会议上被公认是遗传学中继国际基因定位会议上被公认是遗传学中继连锁分析、体细胞遗传和基因克隆之后的连锁分析、体细胞遗传和基因克隆之后的第四代技术，被列为生物学发展

7、史上第四代技术，被列为生物学发展史上126126年年中第中第1414个转折点。个转折点。2021/7/2621 待转移的目的基因的获得与设计待转移的目的基因的获得与设计 动物遗传背景及种系的选择动物遗传背景及种系的选择 在进行转基因动物研究时要考虑遗传背景在进行转基因动物研究时要考虑遗传背景及种系的问题。及种系的问题。转基因动物建立流程转基因动物建立流程2021/7/2622 转基因动物生产主要步骤包括：转基因动物生产主要步骤包括：目的基因的选择，这应视生产目的而定；目的基因的选择，这应视生产目的而定；将重组基因转入受精卵，常使用的方法有显微将重组基因转入受精卵，常使用的方法有显微注射法、反转

8、录病毒感染法、胚胎干细胞法、精注射法、反转录病毒感染法、胚胎干细胞法、精子载体法、脂质体法等子载体法、脂质体法等 将转入了外源基因的受精卵植入同期发情的受将转入了外源基因的受精卵植入同期发情的受体动物，在植入前完成整合胚胎的检测、筛选、体动物，在植入前完成整合胚胎的检测、筛选、建立建立ESES细胞系；细胞系；对出生后基因整合、表达情况进行检测，对整对出生后基因整合、表达情况进行检测，对整合、表达的转基因动物进行育种试验，建立由成合、表达的转基因动物进行育种试验，建立由成功转基因个体或群体组建的转基因系。功转基因个体或群体组建的转基因系。2021/7/2623 转基因的方法主要有转基因的方法主要

9、有4 4类：类：1 1）融合法）融合法 包括细胞融合，微细胞介导融合等；包括细胞融合，微细胞介导融合等；2 2）化学法）化学法 包括包括DNA-DNA-磷酸钙沉淀法、磷酸钙沉淀法、DEAE-DEAE-葡聚糖法、染葡聚糖法、染 色体介导法等；色体介导法等；3 3）物理法）物理法 包括显微注射法、电脉冲法、细胞冻存法等；包括显微注射法、电脉冲法、细胞冻存法等；4 4）病毒感染法）病毒感染法 包括重组包括重组DNADNA病毒感染、重组病毒感染、重组RNARNA病毒感染等。病毒感染等。2021/7/2624主要有3种途径可以产生转基因动物:显微注射法反转录病毒法胚胎干细胞法转基因动物技术转基因动物技术

10、2021/7/2625显微注射法显微注射法2021/7/2626常用的细胞常用的细胞 1）受精卵：受精卵）受精卵：受精卵基因操作基因操作注射注射假孕动物子宫假孕动物子宫胚胎胚胎个体。个体。2）胚胎干细胞胚胎干细胞：从着床前的动物胚：从着床前的动物胚胎中分离多功能胚胎干细胞胎中分离多功能胚胎干细胞 基因操作基因操作注射入动物囊胚注射入动物囊胚形成嵌合体胚胎形成嵌合体胚胎嵌合个体。嵌合个体。2021/7/2627 用显微注射仪将外源基因直接注射入实验动用显微注射仪将外源基因直接注射入实验动物受精卵中，利用外源基因整合到物受精卵中，利用外源基因整合到DNA中，中，从而得到转基因动物。从而得到转基因动

11、物。特点：导入速度快，操作简单，对特点：导入速度快，操作简单，对DNA大小大小无限制，不需要载体，整合效率较高，它可无限制，不需要载体，整合效率较高，它可以直接获得纯系。以直接获得纯系。缺点：需要贵重精密仪器，技术操作较难，缺点：需要贵重精密仪器，技术操作较难，并且外源基因的整合位点和整合的拷贝数都并且外源基因的整合位点和整合的拷贝数都无法控制，易造成宿主动物基因组的插入突无法控制，易造成宿主动物基因组的插入突变，引起相应的性状改变，重则致死变，引起相应的性状改变，重则致死 2021/7/2628胚胎干细胞介导法胚胎干细胞介导法2021/7/2629胚胎干细胞胚胎干细胞(embryonic s

12、tem cell，ES)是指从哺乳动物胚是指从哺乳动物胚胎囊胚期内的细胞团中分离出来的尚未分化的胚胎细胞，胎囊胚期内的细胞团中分离出来的尚未分化的胚胎细胞，这种细胞具有发育的多能性，能够分化出各种组织。这种细胞具有发育的多能性，能够分化出各种组织。2021/7/2630 这个途径是将外源基因直接导人这个途径是将外源基因直接导人ES细胞，经细胞，经体外培养筛选后再注入到受体囊胚腔中，与其中体外培养筛选后再注入到受体囊胚腔中，与其中的囊胚细胞聚集在一起，成为受体胚胎的一部分，的囊胚细胞聚集在一起，成为受体胚胎的一部分，参与其分化。参与其分化。由这种胚胎发育而成嵌合体的转基因动物，由这种胚胎发育而成

13、嵌合体的转基因动物，即其中有一部分组织来源于整合有外源基因的供即其中有一部分组织来源于整合有外源基因的供体体ES细胞。细胞。在嵌合过程中，被转化的在嵌合过程中，被转化的ES细胞分化而成的细胞分化而成的生殖细胞可通过杂交将引人的外源基因传递下去。生殖细胞可通过杂交将引人的外源基因传递下去。2021/7/2631 将目的基因重组到逆转录病毒载体上，制成将目的基因重组到逆转录病毒载体上，制成高浓度的病毒颗粒，人为感染着床前或着床高浓度的病毒颗粒，人为感染着床前或着床后的胚胎，也可以直接将胚胎与能释放逆转后的胚胎，也可以直接将胚胎与能释放逆转录病毒的单层培养细胞共孵育以达到感染的录病毒的单层培养细胞共

14、孵育以达到感染的目的，通过病毒将外源目的基因插入整合到目的，通过病毒将外源目的基因插入整合到宿主基因组宿主基因组DNA中去。中去。特点：用于分裂后的早期胚胎，特别适于禽特点：用于分裂后的早期胚胎，特别适于禽类的转基因研究。单点单拷贝插入，外源基类的转基因研究。单点单拷贝插入，外源基因的完整性不易被破坏。因的完整性不易被破坏。逆转录病毒感染法逆转录病毒感染法2021/7/2632经电穿孔等方法把外源基因导入经电穿孔等方法把外源基因导入精子，令其与卵子结合，受精。精子，令其与卵子结合，受精。精子载体法精子载体法2021/7/26332021/7/2634建立鼠系建立鼠系2021/7/2635转基因

15、动物中外源转基因动物中外源DNA的检测的检测 染色体和基因水平：分离基因组染色体和基因水平：分离基因组DNA，进行斑点杂交，进行斑点杂交，Southern杂交和杂交和PCR分分析，原位杂交等以评估外源基因的整合析，原位杂交等以评估外源基因的整合情况。情况。转录水平：转录水平：Northern杂交，杂交，RT-PCR。蛋白质水平：蛋白质水平：Western印渍分析。印渍分析。2021/7/2636动物转基因技术面临着一些问题动物转基因技术面临着一些问题 生产效率低生产效率低 基因整合效率不高基因整合效率不高 生产周期长，成本高生产周期长，成本高 转基因动物死亡率高转基因动物死亡率高 常出现不育导

16、致转基因难以传代常出现不育导致转基因难以传代 无法大规模生产无法大规模生产2021/7/2637转基因克隆动物转基因克隆动物2021/7/2638 动物克隆技术属于无性繁殖范畴，能实动物克隆技术属于无性繁殖范畴，能实现基因型复制，使少数优秀个体迅速扩大现基因型复制，使少数优秀个体迅速扩大成群。成群。转基因克隆技术是转基因技术和动物转基因克隆技术是转基因技术和动物克隆技术的有机结合，其研究意义和实用克隆技术的有机结合，其研究意义和实用价值又超过了两种技术。价值又超过了两种技术。它以转基因细胞为核供体，采用体细它以转基因细胞为核供体，采用体细胞核移植技术产生转基因克隆动物，实现胞核移植技术产生转基

17、因克隆动物，实现种质创新。种质创新。2021/7/2639转基因克隆动物技术显示出现的优势转基因克隆动物技术显示出现的优势 1 1、生产效率高、生产效率高 2 2、周期短，成本低、周期短，成本低 3 3、可以决定后代性别、可以决定后代性别2021/7/2640 生产效率高生产效率高 显微注射法等传统的转基因技术具有随机显微注射法等传统的转基因技术具有随机性和不可见性，外源基因的拷贝数和整合性和不可见性，外源基因的拷贝数和整合位点都是随机的，还可能出现嵌合体，整位点都是随机的，还可能出现嵌合体，整合率极低，得到的转基因动物数量更少，合率极低，得到的转基因动物数量更少，据统计有的医疗公司从据统计有

18、的医疗公司从19891989年至年至19971997年用年用显微注射技术生产转基因动物平均显微注射技术生产转基因动物平均51.451.4个个动物才得到一个转基因后代，而得到一个动物才得到一个转基因后代，而得到一个转基因克隆后代只需转基因克隆后代只需20.820.8个母体。个母体。2021/7/2641 周期短，成本低周期短，成本低 通过核移植克隆迅速产生大量同质的转基通过核移植克隆迅速产生大量同质的转基因克隆动物，转基因克隆技术在理论上，因克隆动物，转基因克隆技术在理论上，只需一代时间，就可以产生一个完整的转只需一代时间，就可以产生一个完整的转基因克隆动物系，从而节约了时间和成本，基因克隆动物

19、系，从而节约了时间和成本，由于植入代孕母畜的全是转基因胚胎，因由于植入代孕母畜的全是转基因胚胎，因而提高生产效率，降低费用。而提高生产效率，降低费用。2021/7/2642 可以决定后代性别可以决定后代性别 以生物制药为目的的转基因克隆动物，生以生物制药为目的的转基因克隆动物，生产中，性别是相当重要的，例如需要用雌产中，性别是相当重要的，例如需要用雌性生产乳汁。第一代若为雄性，则要等到性生产乳汁。第一代若为雄性，则要等到女儿成熟后才能生产，至少两代。由于选女儿成熟后才能生产，至少两代。由于选择体细胞作为供体，可以预先决定性别，择体细胞作为供体，可以预先决定性别，还可以用还可以用PCRPCR对性

20、别检测，只挑选性别合适对性别检测，只挑选性别合适的细胞作为核供体。的细胞作为核供体。2021/7/2643转基因动物的应用前景转基因动物的应用前景2021/7/2644 转基因动物是对多种生命现象本质深入了解的工具，如研究基因的结构与功能的关系，细胞发育的潜能性，细胞核与细胞质的相互关系，胚胎发育调控，肿瘤，神经与发育等。2021/7/2645 可以用来建立多种疾病的动物模型，进而研究这些疾病的发病机理及治疗方法。2021/7/2646 能提高动物育种效率。能提高动物育种效率。转基因动物技术可由于改造动物的基因组，转基因动物技术可由于改造动物的基因组，使家畜、家禽的经济性状改良更加有效，如使生

21、使家畜、家禽的经济性状改良更加有效，如使生长速度加快、瘦肉率提高，肉质改善，饲料利用长速度加快、瘦肉率提高，肉质改善，饲料利用率提高，抗病力加强等。加上体细胞克隆技术能率提高，抗病力加强等。加上体细胞克隆技术能使优良种畜迅速扩群，在短时间培育出新品种。使优良种畜迅速扩群，在短时间培育出新品种。对于动物遗传资源保护的意义更加深远，对濒危对于动物遗传资源保护的意义更加深远，对濒危物种挽救是必不可少的。物种挽救是必不可少的。2021/7/2647转基因动物可作为医用或食用蛋白的生物反应器转基因动物可作为医用或食用蛋白的生物反应器 通过家畜乳腺分泌大量安全、高效、廉价的人体通过家畜乳腺分泌大量安全、高

22、效、廉价的人体药用蛋白，一直是转基因动物研究的热点。从药用蛋白，一直是转基因动物研究的热点。从1987年年Gordon等人在转基因小鼠乳汁中得到人等人在转基因小鼠乳汁中得到人组织型纤维蛋白溶酶原激活因子（组织型纤维蛋白溶酶原激活因子（tPA），到现），到现在已有数十种人体蛋白在家畜乳腺中表达，这些在已有数十种人体蛋白在家畜乳腺中表达，这些蛋白可以用于治疗人类相关疾病。到蛋白可以用于治疗人类相关疾病。到1998年至少年至少已有已有3种转基因技术生产的重组蛋白用于临床试种转基因技术生产的重组蛋白用于临床试验，如从转基因山羊获得的抗凝血酶验，如从转基因山羊获得的抗凝血酶III，从转基，从转基因绵羊得

23、到的因绵羊得到的1-抗胰蛋白酶，还有来自转基因兔抗胰蛋白酶，还有来自转基因兔的的-葡萄糖苷酶。但目前转基因动物研究面临的葡萄糖苷酶。但目前转基因动物研究面临的一个重要问题是传代难。一个重要问题是传代难。2021/7/2648 通过转基因动物可以生产人体或动物进行器官或组织移植时所需的器官和组织。如人们发现人的胎儿神经细胞可用于帕金森症治疗，但由于伦理道德的原因，这种移植组织难以得到。研究表明，家畜胎儿神经细胞可以替代人类神经细胞用于帕金森症的治疗。2021/7/2649 人体移植器官短缺是一个世界性难题，不得人体移植器官短缺是一个世界性难题，不得不把目光移向动物以寻求可替代移植器官。不把目光移

24、向动物以寻求可替代移植器官。猪器官的体积和形状以及猪器官的体积和形状以及DNADNA基本与人类相似，基本与人类相似，是理想的肾、心、肝等器官供应者，但这种组织是理想的肾、心、肝等器官供应者，但这种组织器官移植面临的主要问题是免疫排斥。器官移植面临的主要问题是免疫排斥。有两种解决办法：一是在移植前去除受体器有两种解决办法：一是在移植前去除受体器官的抗体，但它能迅速再生成；另一种较长久的官的抗体，但它能迅速再生成；另一种较长久的措施是通过转基因技术，特别是基因打靶技术，措施是通过转基因技术，特别是基因打靶技术，向器官供体基因组敲入某种调节因子，抑制向器官供体基因组敲入某种调节因子，抑制-半半乳糖抗

25、原决定基因的表达，或敲除乳糖抗原决定基因的表达，或敲除-半乳糖抗原半乳糖抗原决定基因，再结合克隆技术，培育大量不含免疫决定基因，再结合克隆技术，培育大量不含免疫排斥的转基因克隆猪的器官。排斥的转基因克隆猪的器官。2021/7/2650 转基因动物的研究发展很快，但仍有许多难题有待解决，除了技术问题以外还涉及伦理、法律、安全性及产品如何被消费者接受的问题。可以预见，以上问题将会得到解决，该领域的研究开发将成为国际生物工程领域实用化方向的竞争热点。2021/7/2651思考题思考题 转基因动物的制备应包括那些环节？转基因动物的制备应包括那些环节？制备转基因动物可能会遇到哪些问题？制备转基因动物可能

26、会遇到哪些问题？你认为可采用哪些方法去解决？你认为可采用哪些方法去解决？2021/7/2652第二节第二节2021/7/2653一、概述：基因打靶是利用一、概述：基因打靶是利用DNA同源重组同源重组原理，在基因组中的某一特定部位进行原理，在基因组中的某一特定部位进行定点的基因重组，是研究基因的功能的定点的基因重组，是研究基因的功能的有效手段。包括基因敲除（有效手段。包括基因敲除（gene knock out）和基因敲入（）和基因敲入（gene knock in）。）。2021/7/2654l同源重组的分子过程同源重组的分子过程1、两段较长的同源、两段较长的同源DNA或同源染色体彼此靠或同源染色

27、体彼此靠拢，在二条相同极性上断裂拢，在二条相同极性上断裂2、产生交叉结构、产生交叉结构3、在交叉处横断内切，产生、在交叉处横断内切，产生4种含有异源双链种含有异源双链的重组产物的重组产物2021/7/26552021/7/2656二、基因敲除的基本程序二、基因敲除的基本程序1、构建打靶载体、构建打靶载体 1）同源序列）同源序列 2）打靶载体常含两种筛选标志打靶载体常含两种筛选标志 neor：新霉素抗性基因，阳性筛选标志，：新霉素抗性基因，阳性筛选标志，neor基因插入用于打靶的外源基因插入用于打靶的外源DNA中，中，当重组后，细胞能在含新霉素的培养基当重组后，细胞能在含新霉素的培养基中生长。中

28、生长。neorHSV-tk2021/7/2657 HSV-tk：单纯疱疹病毒的胸腺嘧啶激酶单纯疱疹病毒的胸腺嘧啶激酶基因，阴性筛选标志，基因，阴性筛选标志，该基因产物可分该基因产物可分解单核苷酸类似物而生成毒性产物，产解单核苷酸类似物而生成毒性产物，产生自杀效果。生自杀效果。HSV-tk基因插入外源基因外侧的载基因插入外源基因外侧的载体序列中。同源重组时，体序列中。同源重组时，Tk-基因往往丢基因往往丢失；随机整合时，失；随机整合时，Tk-基因连同打靶载基因连同打靶载体整合到核基因组上，而同时获得体整合到核基因组上，而同时获得neo和和HSV-tk两个基因的打靶细胞。两个基因的打靶细胞。202

29、1/7/2658启动子启动子HSV-TK同源序列同源序列同源序列同源序列Neo2021/7/26592、将载体导入将载体导入ES细胞细胞 选取发育第选取发育第4-5天的胚胎干细胞天的胚胎干细胞(ES)。把外来基因转入胚胎肝细胞。把外来基因转入胚胎肝细胞。并筛选打靶成功的细胞。并筛选打靶成功的细胞。2021/7/2660随机整合随机整合同源重组同源重组2021/7/26613、将基因敲除、将基因敲除ES细胞注射入胚泡，形成嵌细胞注射入胚泡，形成嵌合胚胎。合胚胎。4、将、将10-20个胚泡植入假孕小鼠子宫。个胚泡植入假孕小鼠子宫。5、获得子代小鼠，筛选带有靶基因的小鼠。、获得子代小鼠，筛选带有靶基

30、因的小鼠。常有的方法有：常有的方法有：Southern印记、印记、Northern印记印记把胚胎注入把胚胎注入假孕小鼠假孕小鼠Southern印记印记把细胞注入胚泡把细胞注入胚泡2021/7/26626、杂和小鼠（、杂和小鼠（+/-）间杂交，获得子二代）间杂交，获得子二代小鼠（小鼠（+/+、-/-、+/-）。）。7、筛选的、筛选的-/-、+/-子二代小鼠。子二代小鼠。（+/-）（+/-）（+/-）（-/-）（+/+）（+/-）（+/-）（+/-）（+/-）（+/+）（-/-）2021/7/2663三三、基因打靶在医学中的应用、基因打靶在医学中的应用1、采用基因打靶技术可建立基因缺陷型的、采用基

31、因打靶技术可建立基因缺陷型的疾病模型，用于研究遗传疾病发生的分疾病模型，用于研究遗传疾病发生的分子机制。子机制。2、基因打靶与肿瘤的研究、基因打靶与肿瘤的研究 研究基因改研究基因改变与肿瘤发生及治疗的关系变与肿瘤发生及治疗的关系3、基因打靶可用于构建高效的动物反应器、基因打靶可用于构建高效的动物反应器或植物反应器，用于药物生产。或植物反应器，用于药物生产。2021/7/2664小结小结 转基因技术是在基因重组基础上建立新的多细胞转基因技术是在基因重组基础上建立新的多细胞真核生物的方法。这是一个具有重大意义的革命性真核生物的方法。这是一个具有重大意义的革命性的突破。它为我们培育新的物种提供了新的

32、思路，的突破。它为我们培育新的物种提供了新的思路，为我们研究基因的功能，研究疾病发生的机理提供为我们研究基因的功能，研究疾病发生的机理提供了有力的手段。了有力的手段。基因打靶是一种利用同源重组原理使基因定向重基因打靶是一种利用同源重组原理使基因定向重组的方法。它是我们可以更精确的研究一个基因的组的方法。它是我们可以更精确的研究一个基因的功能。也部分解决了构建转基因动物是基因随机重功能。也部分解决了构建转基因动物是基因随机重组给我们带来的一些困扰。组给我们带来的一些困扰。不论转基因动物还是基因打靶对于研究有什么意不论转基因动物还是基因打靶对于研究有什么意义，要想把它们在生活中推广还要通过艰苦的研究义，要想把它们在生活中推广还要通过艰苦的研究来对其进行更深入的认识。更要随时牢记：我们并来对其进行更深入的认识。更要随时牢记：我们并不真的是上帝。不真的是上帝。2021/7/2665