转基因应用课件.ppt

1、ZCH2017-12-25ATCG?64个密码子，20种氨基酸？物质元素种类100+？118 or 11118一一、转基因动物、转基因动物二、二、基因导入的方法基因导入的方法三、三、基因转移后的存在方式及表达基因转移后的存在方式及表达四、应用四、应用研究及安全评价研究及安全评价五五、具体、具体事例事例世界首只转基因灵长类动物 -安迪世界第一只转基因动物转基因动物是指用转基因动物是指用实验导入实验导入的方法将外源基的方法将外源基因在染色体基因内因在染色体基因内稳定整合稳定整合并能并能稳定表达稳定表达的的一类动物。（包括基因敲除的动物）一类动物。（包括基因敲除的动物）显微显微注射法注射法逆转录病毒

2、逆转录病毒感染感染胚胎法胚胎法胚胎胚胎干细胞干细胞法法精子载体法精子载体法细胞核移植法细胞核移植法生殖细胞生殖细胞转染法转染法 显微注射法是通过显微注射法是通过显微操作仪显微操作仪将外源基将外源基因直接注射到受精卵的原核中因直接注射到受精卵的原核中，该法是产生最，该法是产生最早且又最为有效的转基因方法早且又最为有效的转基因方法。但原核显微注射法技术难度比较大，不仅需要但原核显微注射法技术难度比较大，不仅需要昂贵的仪器昂贵的仪器，而且需要一定的，而且需要一定的操作技巧操作技巧。基因原核注入基因原核注入 显微图像显微图像 将外源基因重组到将外源基因重组到DNADNA病毒或病毒或RNARNA病毒上，

3、病毒上，再用重组的再用重组的DNADNA病毒或病毒或RNARNA病毒去感染着床前后病毒去感染着床前后的胚胎，随后病毒基因插入到宿主胚胎基因组的胚胎，随后病毒基因插入到宿主胚胎基因组中，外源基因也自然整合到胚胎基因组中。中，外源基因也自然整合到胚胎基因组中。逆转录病毒感染胚胎法是近年来兴起的基逆转录病毒感染胚胎法是近年来兴起的基因转移方法，操作相对简单而且感染后基因的因转移方法，操作相对简单而且感染后基因的整合效率高。整合效率高。慢病毒表达系统：慢病毒表达系统：一种很常用的哺乳动物病毒表达系统；慢病毒感染宿主细胞时，可将携带的外源基因随机、稳定地整合入宿主细胞基因组中，实现目的基因稳定、长期的表

4、达，非常适合于基因过表达稳定细胞株的建立和RNAi研究 腺病毒腺病毒表达系统：表达系统：一种很常用的哺乳动物病毒表达系统；但与慢病毒不同的是，腺病毒基因组及其携带的外源基因不会整合入宿主细胞的基因组中，而是游离于宿主基因组外独立表达，因此可实现目的基因瞬时、高丰度的表达，同时还避免了因整合而引发的潜在的基因突变和随机效应，安全性和可控性高。逆转录病毒表达系统：逆转录病毒表达系统：逆转录病毒将自身基因组及其携带的外源基因随机、稳定地整合入宿主细胞基因组中，可实现目的基因稳定、长期的表达。逆转录病毒表达系统根据不同的包装细胞系可分为单嗜性、双嗜性和泛嗜性，不同包装细胞产生的逆转录病毒能够特异性地感

5、染某一个或某一类宿主细胞。辉骏生物采用的病毒包装细胞系为plat E细胞系，该细胞系包含gag、pol和env基因，因此转染单一表达质粒就可以包装出逆转录病毒，但是该病毒具有很强的针对性，只适用于大鼠、小鼠细胞稳定株的建立。胚胎发育卵泡阶段的细胞能在培养基中体外增殖，胚胎发育卵泡阶段的细胞能在培养基中体外增殖，当把他们重新输回胚胎胚泡后，仍保留着分化成其他细当把他们重新输回胚胎胚泡后，仍保留着分化成其他细胞（包括生殖细胞）的能力，这些细胞称为胞（包括生殖细胞）的能力，这些细胞称为多效性胚胎多效性胚胎干细胞（干细胞（ES）。）。ES在体外培养时可承受转基因操作而不影响其分化在体外培养时可承受转基

6、因操作而不影响其分化多效性，外源基因通过同源重组方式特异性整合在多效性，外源基因通过同源重组方式特异性整合在ES基基因组内的一个非必需位点上，构成因组内的一个非必需位点上，构成工程化胚胎干细胞工程化胚胎干细胞，工程化胚胎干细胞经筛选鉴定和体外扩增，再输回小鼠工程化胚胎干细胞经筛选鉴定和体外扩增，再输回小鼠胚胎胚泡中，最终形成转基因动物。胚胎胚泡中，最终形成转基因动物。胚胎干细胞法生产转基因动物的流程图胚胎干细胞法生产转基因动物的流程图 精子载体法是精子和外源DNA混合培养时，外源DNA可直接进入精子的头部，通过受精将外源基因引入动物细胞中。外源DNA导入精细胞的方法有DNA与精子共育法、点穿孔

7、导入法、脂质体转染法。精子载体法生产转基因的基本流程精子载体法生产转基因的基本流程 细胞核移植技术，就是将供体细胞核移入除去核的卵母细胞中，使后者不经过精子穿透等有性过程即无性繁殖即可被激活、分裂并发育成新个体，使得核供体的基因得到完全复制。以供体核的来源不同可分为胚细胞核移植与体细胞核移植两种。核移植也称克隆或无性繁殖，是将分离的胚胎卵裂核移植也称克隆或无性繁殖，是将分离的胚胎卵裂球球(核供体核供体)或体细胞核与成熟并去核的卵母细胞或或体细胞核与成熟并去核的卵母细胞或去核的原核期受精卵的去核胚胎去核的原核期受精卵的去核胚胎(核受体核受体)融合，不融合，不经过有性繁殖过程，连续不断地复制遗传上

8、相同的经过有性繁殖过程，连续不断地复制遗传上相同的胚胎，并通过克隆胚胎的移植生产大量同基因型的胚胎，并通过克隆胚胎的移植生产大量同基因型的克隆动物系或动物群的一项动物繁殖新技术。克隆动物系或动物群的一项动物繁殖新技术。国产的克隆狗终于出现了，以后你会克隆一个自己死去的狗狗纪念他吗？国产的克隆狗终于出现了，以后你会克隆一个自己死去的狗狗纪念他吗？转基因动物转基因动物的技术的技术路线路线v经典的技术路线经典的技术路线 目的基因目的基因 显微注射显微注射已交配的已交配的 取出取出 移植移植 受体动物受体动物 妊娠妊娠供体动物供体动物 受精卵受精卵 输卵管输卵管 转基因动转基因动物物 缺点：注入目的基

9、因的命中率低，目的基因的整缺点：注入目的基因的命中率低，目的基因的整合率低，受精卵移植的受孕率低。合率低，受精卵移植的受孕率低。v整合胚胎移植的技术路线整合胚胎移植的技术路线 转基因动物转基因动物 受体动物子宫受体动物子宫 目的基因目的基因 非手术非手术 胚胎移植胚胎移植 体外受精体外受精 体外培养体外培养 多细胞胚胎多细胞胚胎 检测检测 整合外源基因整合外源基因卵子卵子 受精卵受精卵 或囊胚或囊胚 的胚胎的胚胎精子精子优点：受精卵的成活率高达优点：受精卵的成活率高达90以上，外源基因整合以上，外源基因整合率高，提高受孕率。率高，提高受孕率。v核移植（克隆）的技术路线核移植（克隆）的技术路线

10、目的基因目的基因 转基因动物转基因动物 导入导入.动物胎儿成纤维细胞动物胎儿成纤维细胞 妊娠妊娠 取核取核动物动物 去核去核 重组的重组的 体外培养体外培养 囊胚期囊胚期 胚胎移植胚胎移植 卵细胞卵细胞 受精卵受精卵 胚胎胚胎 受体动物子宫受体动物子宫方法显微注射核移植胚胎干细胞逆转录病毒基因敲除精子介导优点外源基因整合效率较高，不需要载体，目的基因的长度可达100Kb转基因效率高；预测基因表达水平；可以使用定点整合技术外源DNA的整合率高；整合在生殖细胞中的比例也很高。可在整合点整合转移基因的单个拷贝；该方法简单、方便 缺点精密仪器，技术操作较难，易造成宿主动物基因组的插入突变供体细胞易衰老

11、ES细胞株不易建立，长期培养后出现分化现象；生产的转基因动物都是嵌合体 插入的基因有大小限度；嵌合性很高；外源DNA 在动物各种组织中的分布不均 应用具有一定局限性有些结果不能重复 从转基因的策略来看，动物转基因技术的发展经历了两个阶段：第从转基因的策略来看，动物转基因技术的发展经历了两个阶段：第一阶段为传统转基因动物阶段，第二阶段为条件性转基因动物阶段。一阶段为传统转基因动物阶段，第二阶段为条件性转基因动物阶段。借助转基因技术可将单一的功能基因和基因簇引入高等动物的基因组，借助转基因技术可将单一的功能基因和基因簇引入高等动物的基因组，或将目的基因从动物基因组中敲除，实现了种系内和种系间基因转

12、移或修或将目的基因从动物基因组中敲除，实现了种系内和种系间基因转移或修饰，产生新的基因型和表型。饰，产生新的基因型和表型。目前转基因动物主要应用在生物学基础研究、医学疾病模型、动物生目前转基因动物主要应用在生物学基础研究、医学疾病模型、动物生物反应器、异种器官移植、动物遗传改良等个方面。物反应器、异种器官移植、动物遗传改良等个方面。v基因敲除是向正常生物个体内引入某个突变基基因敲除是向正常生物个体内引入某个突变基因位点而选择性地使某特定基因功能失活的技因位点而选择性地使某特定基因功能失活的技术术.v可培养出靶向性剔除某基因的小鼠，而导致行可培养出靶向性剔除某基因的小鼠，而导致行为特性改变。为特

13、性改变。培育基因靶向性敲除小鼠的实施步骤为：1.1.首先将某基因突变位点经同源重组引入小鼠首先将某基因突变位点经同源重组引入小鼠ESES细胞。细胞。2.2.将含有靶向敲除的突变基因位点的将含有靶向敲除的突变基因位点的ESES细胞注入小鼠早期细胞注入小鼠早期胚胎中胚胎中,孕育出嵌合小鼠孕育出嵌合小鼠,此嵌合小鼠体内胚系细胞群和此嵌合小鼠体内胚系细胞群和体细胞群都会有来自体细胞群都会有来自ESES细胞和受者胚胎鼠细胞的细胞和受者胚胎鼠细胞的DNADNA。3.3.检测嵌合小鼠交配后的生殖细胞内是否整合检测嵌合小鼠交配后的生殖细胞内是否整合有突变的基因位点有突变的基因位点。4.4.在各只敲除的突变基因

14、位点杂合性小鼠之间在各只敲除的突变基因位点杂合性小鼠之间交配交配,以产生纯合性基因敲除小鼠。以产生纯合性基因敲除小鼠。v培养成功率低，技术难度大，尽管对研究遗传培养成功率低，技术难度大，尽管对研究遗传与疾病的相关性十分有用，但若敲除致命的功与疾病的相关性十分有用，但若敲除致命的功能基因，可使胚胎早期发生死亡。若所敲除基能基因，可使胚胎早期发生死亡。若所敲除基因可被其他功能基因代偿，则使表型改变模糊因可被其他功能基因代偿，则使表型改变模糊不明，有局限性。不明，有局限性。基因转移基因转移后的存在方式及表达后的存在方式及表达(一一)外源基因导入后的存在方式：外源基因被导入受体细胞后，外源基因导入后的

15、存在方式：外源基因被导入受体细胞后，在受体细胞内的存在方式有三种：在受体细胞内的存在方式有三种：1.1.非同源重组。大多数外源基因导入受体细胞后非同源重组。大多数外源基因导入受体细胞后,与受体细胞与受体细胞染色体的某一位点随机整合，这样可带来正常基因的插入、缺染色体的某一位点随机整合，这样可带来正常基因的插入、缺失、易位等突变。失、易位等突变。2.2.同源重组。导入的外源同源重组。导入的外源DNADNA与受体细胞染色体的与受体细胞染色体的DNA DNA 通过顺通过顺序取代或顺序插入实现同源重组。通过同源重组有可能导致受序取代或顺序插入实现同源重组。通过同源重组有可能导致受体细胞正常的基因发生突

16、变，当然，也有可能代替原来的有遗体细胞正常的基因发生突变，当然，也有可能代替原来的有遗传缺陷的遗传基因，从而纠正遗传缺陷。传缺陷的遗传基因，从而纠正遗传缺陷。3.3.游离存在。外源基因没有整合到受体细游离存在。外源基因没有整合到受体细胞中胞中,而是以附加体的形式游离在受体细胞而是以附加体的形式游离在受体细胞内，能自我复制，并能内，能自我复制，并能100100的传给下一代。的传给下一代。(二二)外源基因导入后的表达：外源基因导入受外源基因导入后的表达：外源基因导入受体细胞后能否表达，是受许多因素影响的。体细胞后能否表达，是受许多因素影响的。1.1.外源基因本身的结构和性质。外源基因本身的结构和性

17、质。2.2.附带的原核载体顺序。研究发现，原核载体附带的原核载体顺序。研究发现，原核载体的存在对的存在对-甲胎蛋白、甲胎蛋白、-珠蛋白等基因的表珠蛋白等基因的表达具有明显的抑制作用，而对免疫球蛋白和胶达具有明显的抑制作用，而对免疫球蛋白和胶原蛋白基因的抑制不明显。原蛋白基因的抑制不明显。3.3.染色体位置。染色体位置。外源基因在受体动物细胞染色外源基因在受体动物细胞染色体上整合部位的基因环境对外源基因表达的影响体上整合部位的基因环境对外源基因表达的影响很大。很大。4.4.甲基化。被转移的基因容易甲基化而失活。甲基化。被转移的基因容易甲基化而失活。外源基因在受体细胞中的表达方式表现为组织特外源基

18、因在受体细胞中的表达方式表现为组织特异性和发育阶段特异性。组织特异性表达是由于异性和发育阶段特异性。组织特异性表达是由于某些调节元件如启动子和增强子的作用造成的。某些调节元件如启动子和增强子的作用造成的。一、具体内容：一、具体内容：1 1、与受体动物比较，转基因动物的如下特性是否、与受体动物比较，转基因动物的如下特性是否改变：改变：在自然界中的存活能力；在自然界中的存活能力；经济性能；经济性能；繁殖、遗传和其它生物学特性。繁殖、遗传和其它生物学特性。2 2、插入序列的遗传稳定性、插入序列的遗传稳定性。3 3、基因表达产物、产物的浓度及其在可食用组织中的分布、基因表达产物、产物的浓度及其在可食用

19、组织中的分布。4 4、转基因动物遗传物质转移到其它生物体的能力和可能后果、转基因动物遗传物质转移到其它生物体的能力和可能后果。5 5、由基因操作产生的对人体健康和环境的毒性或有害作用的资料。、由基因操作产生的对人体健康和环境的毒性或有害作用的资料。6 6、是否存在不可预见的对人类健康或生态环境的危害、是否存在不可预见的对人类健康或生态环境的危害。7 7、转基因动物的转基因性状检测和鉴定技术。、转基因动物的转基因性状检测和鉴定技术。自20世纪80年代第一只转基因小鼠诞生起，人类就开始了对转基因动物的研究。随着研究的不断深入和实验技术的不断完善，有些转基因动物的成果已进入实用化和商业化的开发阶段。

20、目前，转基因动物主要应用于医药、食品、生产等各个方面。另一种比较著名的转基因荧光动物是荧光猪，另一种比较著名的转基因荧光动物是荧光猪，这是把水母绿色荧光蛋白基因转入猪体内制这是把水母绿色荧光蛋白基因转入猪体内制造出来的。在造出来的。在紫外线紫外线的照射下，荧光猪的蹄的照射下，荧光猪的蹄子、鼻尖、舌头这些没有被毛发遮盖的部位子、鼻尖、舌头这些没有被毛发遮盖的部位发出了荧光。发出了荧光。乳腺生物反应器的研究乳腺生物反应器的研究19871987年，年，GordonGordon首次报道小鼠乳腺中表达首次报道小鼠乳腺中表达tPAtPA蛋蛋白。至今国际上转基因羊、转基因牛等的成功白。至今国际上转基因羊、转

21、基因牛等的成功报道实例已有报道实例已有1010多种，生产出抗胰蛋白酶、乳多种，生产出抗胰蛋白酶、乳铁蛋白、人凝血蛋白因子铁蛋白、人凝血蛋白因子、蛋白质、蛋白质C C等药用蛋等药用蛋白。国外经济学家预期，白。国外经济学家预期，1010年后，转基因动物年后，转基因动物生产的药物销售额超过生产的药物销售额超过250250亿美元。亿美元。1.人类疾病动物模型 建立用于药物研究的适合基因治疗的转基因动物模型是转基因动物的重要方向。此模型具有准确、经济、试验次数少、显著缩短试验时间等优点。2、异体器官移植 器官移植是目前治疗器官功能衰竭等疾病的首选技术，为患者带来希望，利用转基因动物可以在动物体上培育人体

22、器官，有效缓解器官供需日益突出的矛盾。1、促进动物生长，提高生产性能 利用动物转基因技术可以促进动物的生长发育，提高动物的生产性能。通过导入外源性生长激素基因，改造动物原有的基因组，从而达到加快动物生长速度，提高肉、蛋、奶等产品的产量，提高饲料利用率的目的。许多动物的生长速度取决于体内生长激素的含量。我们可以用转基因技术转基因技术往动物体转入生长激素基因生长激素基因，用此方法培育的转基因鲑鱼，在同一生长期内，平均重量是普通鲑鱼的11倍，成熟期也比普通鲑鱼快1倍。转基因鲑鱼(上)与同年龄的野生鲑鱼(下)2、提高抗病力和适应性 对牛、羊等家畜和家禽进行基因转移，还可以有效提高家畜的抗病耐寒能力，改

23、善其性状，促进了养殖业的发展。3、动物生物反应器 动物生物反应器（bioreactor）是利用转基因活体动物，高效表达某种外源蛋白的器官或组织，进行工业化生产功能蛋白质的技术。动物生物反应器的研究开发重点是动物乳腺反应器和动物血液反应器。即，把人体相关基因整合到动物胚胎里，使生出的转基因动物血液中，或长大产生的奶汁中，含有人类所需要的不同蛋白质。这是当前生物技术的尖端和前沿研究项目。由中国农业科学院北京畜牧兽医研究所、军事医学科学院生物工程研究所和河北省玉田种猪场玉田县牧富种猪繁育有限公司合作，顺利培养出一头转转脂肪酸去饱和酶脂肪酸去饱和酶基因的克隆猪。这种以往只在深海鱼体上大量存在的不饱和脂

24、肪酸，有助于预预防人类心血管疾病防人类心血管疾病。转基因技术给人类作出了巨大的贡献，是人类发展史上一次划时代的进步。然而，转基因技术的继续发展面临着一系列安全问题，已经在全球范围内引起了激烈的争论与普遍关注，主要集中在食品安全性和环境安全性两方面。对于转基因动物，有些外源基因及其启动子来自于病毒序列，有可能在受体动物体内发生同源重组或整合，形成新的病毒。外源基因在染色体内插入位点的不同也可能造成不同程度的基因改变，引起非预期效应。转基因动物还可能增加人畜共患病的风险，某些动物可能导致人类过敏性反应等。因此，对于转基因动物，我们必须提高警惕，要对转因食品进行严格的食用安全性评价。转基因动物的目的

25、基因在野生种中稳定下来也可能造成生态问题，可能使野生近缘种获得选择优势，影响生态系统中正常的物质循环和能量流动。另外，还可能会导致野生等位基因的丢失，从而造成遗传多样性的下降。随着技术的发展，转基因动物的规模会越来越大，如果没有一套很好的跟踪、评估管理系统，势必从目前的可控状态变成无序的、不可控状态。因此，建立一套全球范围的转基因动物的跟踪管理规范、检测和评估系统是非常迫切的。转基因动物的低效性转基因动物的低效性 转入基因引起完整基因突变转入基因引起完整基因突变 转入基因表达混乱转入基因表达混乱 病毒转基因对宿主的影响病毒转基因对宿主的影响 转基因动物模型与预期不符转基因动物模型与预期不符 乳

26、腺反应器的完善乳腺反应器的完善 转基因动物及产品的认可转基因动物及产品的认可 转基因动物的研究正逐渐走向经济领域，为经济社会的发展起到了极大的促进作用。尽管各种不确定因素依然存在，但随着科学技术的继续发展，人类将会不断揭开其中的疑虑。转基因动物必将在不久的将来得到更加广泛的应用，造福人类社会。基因敲入：全身TG，组织特异性TG，条件性TG基因敲除：基因重组KO，条件性KO，诱导性KOCre-loxp系统：重组酶Cre遇到loxp位点会将loxp之间的目的基因和一条loxp切掉，以此达到基因敲除目的。四环素或多西环素作为TetOn和TetOff系统的效应剂，与tTA或rtTA相互作用从而调节它们

27、与Ptet的亲和力。多西环素是四环素的衍生物，由于其具有毒性小、所用剂量小等优点，在实际应用中更为广泛。该系统发挥作用的机制如图所示。该系统可以对靶位点的剔除或修饰进行时间和空间二维调控。TetOff(tTA依赖)系统和TetOn(rtTA依赖)系统 1981 年Evans 等首次在体外分离和培养ES，成功建立了小鼠胚胎干细胞系1985 年Smithies最早在哺乳动物细胞中发现并实现了同源重组n同源重组是指发生在姐妹染色单体（sister chromatin)之间或同一染色体上含有同源序列的DNA分子之间或分子之内的重新组合。在基因敲除小鼠制作过程中，需要针对目的基因两端特异性片段设计带有相

28、同片段的重组载体，将重组载体导入到胚胎干细胞后外源的重组载体与胚胎干细胞中相同的片段会发生同源重组 同源重组示意图同源重组示意图nCre重组酶（37）位点特异性重组酶，介导loxp 位点间的序列同源重组70%重组率，无需辅助因子，多种 结构的DNA底物nLoxp site34bp反向重复序列nFlp/Frt重组系统P1噬菌体Offspring：50%heterozygous knockout after 1 generationOffspring:25%homozygous knockout after 2 generationF0代F1代ColdSub获取获取UCP1+cell(toamto

29、 红色荧光红色荧光)UCP1-promoterUCP1-promoterUCP1-tomato-工具鼠（UCP1-cre&tomato-flox）利用CRISPR/Cas9介导的非同源重组整合外源片段的方式，构建了UCP1基因定点（猪内源UCP1假基因位点）敲入猪，实现了UCP1基因在猪白色脂肪组织的特异表达。Sirt5 KO(Ucp1-cre)Ucp1-cre;Rosa26-temato miceWild type上下游功能验证OE/sh-sirt5The RIN-MCfusion of MADS-box transcription factors has transcriptional activity and modulates expressionof manyripeninggenesBlood：首例甲减猪模型Thyroid hormone regulates hematopoiesis via the TR-KLF9 axis北京希诺谷生物科技有限公司利用CRISPR/Cas9等现代基因编辑技术，北京希诺谷生物科技有限公司已建立犬基因编辑技术体系和平台该服务项目包括：1.动脉粥样硬化疾病模型犬2.自闭症疾病模型犬3.杜氏肌营养不良疾病模型犬Cell新文章：非切割DNA型CRISPR/Cas9疗法逆转了多种疾病