医科大学精品课件：第3章 多聚核苷酸与核酸 2版.ppt

1、目目 录录 第第 三三 章章 多聚多聚核苷酸和核酸核苷酸和核酸 Polynucleotides and Nucleic Acids 目目 录录 1953年：年：Watson和和Crick提出提出DNA双螺旋结构模型双螺旋结构模型 目目 录录 核酸的分类及分布核酸的分类及分布 存在存在于细胞核和于细胞核和线粒体线粒体 分布于细胞核、细胞质、分布于细胞核、细胞质、线粒体线粒体 (deoxyribonucleic acid, DNA) (ribonucleic acid, RNA) 脱氧核糖核酸脱氧核糖核酸 核糖核酸核糖核酸 携带遗传信息，并通过复制传递携带遗传信息，并通过复制传递 给下一代。给下一

2、代。 是是DNADNA转录的产物，参与遗传信转录的产物，参与遗传信 息的复制与表达。某些病毒息的复制与表达。某些病毒RNARNA 也可作为遗传信息的载体也可作为遗传信息的载体 目目 录录 多聚核苷酸多聚核苷酸（Polynucleotides） 多聚核苷酸多聚核苷酸是是核苷酸核苷酸通过通过3 ，5 -磷酸二酯磷酸二酯 键键连接的聚合物连接的聚合物，是是核酸核酸分子中的基本形式分子中的基本形式。 目目 录录 核酸分子结构与功能核酸分子结构与功能 一、一、核酸核酸的分子结构与功能的分子结构与功能 核苷酸分子结构核苷酸分子结构 DNA分子结构分子结构 RNA分子结构分子结构 二、二、核酸的核酸的理化性

3、质与研究技术理化性质与研究技术 目目 录录 第一节第一节 多聚核苷酸多聚核苷酸 Polynucleotides 目目 录录 5 端端 3 端端 C G A 3 , 5 -磷酸二酯键磷酸二酯键 多聚核苷酸链方向性多聚核苷酸链方向性 一、多聚核苷酸的结构一、多聚核苷酸的结构 5 末端：磷酸末端：磷酸 3 末端：羟基末端：羟基 链延长：链延长：5 3 目目 录录 核酸的一级结构：核酸的一级结构： 核酸中核苷酸的排核酸中核苷酸的排 列顺序。列顺序。 碱基排列顺序，碱基排列顺序， 即即碱基序列碱基序列。 目目 录录 A G P 5 P T P G P C P T P OH 3 书写方法书写方法 5 pA

4、pCpTpGpCpT-OH 3 5 A C T G C T 3 目目 录录 目目 录录 核酸分子大小表示法核酸分子大小表示法: 单链单链DNA或或RNA: 碱基数目碱基数目, base, kilobase. 双链双链DNA或或RNA: 碱基对数目碱基对数目, base pair (bp) kilobase pair (kb) 小的核酸片段小的核酸片段( RNA、 dsDNA ssDNA 粘度大，易断裂。粘度大，易断裂。 沉降系数沉降系数： 不同空间结构，沉降速率不同；不同空间结构，沉降速率不同； 线性线性 dsDNA 目目 录录 碱基的紫外吸收光谱碱基的紫外吸收光谱 目目 录录 1. DNA或

5、或RNA的定量的定量 OD260=1.0相当于相当于 50g/ml双链双链DNA 40g/ml单链单链DNA（或（或RNA） 20g/ml寡核苷酸寡核苷酸 2. 判断核酸样品的纯度判断核酸样品的纯度 DNA纯品纯品: OD260/OD280 = 1.8 RNA纯品纯品: OD260/OD280 = 2.0 OD260的应用的应用 目目 录录 二、核酸二、核酸变性、复性和杂交变性、复性和杂交 定义定义：在理化因素作用下，在理化因素作用下，DNA双链解开成两双链解开成两 条单链的过程。条单链的过程。 本质：本质：破坏氢键，改变空间结构。破坏氢键，改变空间结构。 方法：方法：强酸、碱，加热，变性试剂

6、（尿素、酰强酸、碱，加热，变性试剂（尿素、酰 胺）、有机溶剂（乙醇、丙酮）等。胺）、有机溶剂（乙醇、丙酮）等。 理化性质变化理化性质变化：OD260增增高高. . （一）核酸变性（一）核酸变性 目目 录录 DNA变性的本质是双链间氢键的断裂变性的本质是双链间氢键的断裂 目目 录录 变性引起紫外吸收值的改变变性引起紫外吸收值的改变 DNA的紫外吸收光谱的紫外吸收光谱 增色效应：增色效应：DNA变性时其溶液变性时其溶液OD260增高的现象增高的现象。 （二）（二）DNADNA变性与变性与紫外吸收紫外吸收 目目 录录 DNA的解的解链链曲线曲线 连续加热连续加热DNA的过程中的过程中 以温度相对于以

7、温度相对于A260值作图值作图， 所得的曲线称为所得的曲线称为解链曲线解链曲线。 解链过程中解链过程中，紫外吸紫外吸 光度的变化达到最大变化光度的变化达到最大变化 值的一半时所对应的温度值的一半时所对应的温度。 解链温度解链温度 (melting temperature，Tm) 热变性热变性 变性是在一个相当窄的温度范围内完成变性是在一个相当窄的温度范围内完成。 融解温度 Tm 76100 C9692888480 0.50 0.70 0.65 0.60 0.55 光密度（260nm） 50% 50% 目目 录录 Tm值的影响因素：值的影响因素： 1. G-C碱基对含量决定熔解温度高低：碱基对含

8、量决定熔解温度高低： G-C与与Tm值呈正比。值呈正比。 2. DNA均一性决定熔解温度范围大小：均一性决定熔解温度范围大小： 均质均质DNA Tm范围小、异质范围小、异质DNA Tm范围大范围大 3. 介质中的离子强度影响变性：介质中的离子强度影响变性： 离子强度低、易变性，离子强度低、易变性，Tm低；低； DNA高盐保存。高盐保存。 Tm值的经验公式值的经验公式：Tm = 69.3+0.41（%G+C） 20pb : Tm = 4（G+C）+2（A+T） 目目 录录 解链解链曲线曲线的变化的变化 G+C 含量越高含量越高，解链温度就越高解链温度就越高。 目目 录录 DNA复性复性(rena

9、turation)： 在适当条件下，变性在适当条件下，变性DNA的两条互补链可恢的两条互补链可恢 复天然的双螺旋构象，这一现象称为复天然的双螺旋构象，这一现象称为复性复性。 退火退火(annealing)： 热变性的热变性的DNA经缓慢冷却后复性，这一过经缓慢冷却后复性，这一过 程称为程称为退火退火。 （三）变性（三）变性DNA的复性的复性 减色效应：减色效应：DNA复性时，其溶液复性时，其溶液OD260降低降低。 目目 录录 （四）核酸分子杂交（四）核酸分子杂交 核酸分子杂交核酸分子杂交（hybridyzation）： 不同来源不同来源，但具互补序列的核酸但具互补序列的核酸，按碱按碱 基配对

10、原则形成基配对原则形成杂化双链杂化双链的过程的过程。 杂化双链：杂化双链：DNA与与DNA分子，分子， DNA与与RNA分子，分子， RNA与与RNA分子间形成。分子间形成。 目目 录录 DNA-DNA 杂交双链分子杂交双链分子 变性变性 复性复性 不同来源的不同来源的 DNA分子分子 目目 录录 目目 录录 目目 录录 核酸分子杂交的应用核酸分子杂交的应用 （1）Southern印迹印迹可检测可检测DNA （2）Northern印迹印迹用于检测用于检测RNA Western印迹印迹用于检测蛋白质用于检测蛋白质 （3）斑点印迹杂交）斑点印迹杂交(Dot blot) （4）DNA芯片芯片(DNA

11、 microarray)技术也技术也 是是利用核酸杂交原理设计的。利用核酸杂交原理设计的。 目目 录录 三、核酸与其他分子的相互作用三、核酸与其他分子的相互作用 核酸与蛋白质的相互作用核酸与蛋白质的相互作用: : DNA双双螺旋结构是结构基础螺旋结构是结构基础 参与基因表达调控参与基因表达调控 核酸与核酸的相互作用：核酸与核酸的相互作用： 核酶，核酸剪切核酶，核酸剪切 目目 录录 四、核酸的化学修饰四、核酸的化学修饰 核酸化学修饰核酸化学修饰（chemicalchemical modificationmodification）可发可发 生在碱基生在碱基、戊糖戊糖，甚至磷酸基甚至磷酸基。 甲基化

12、：甲基化： 碱基或戊糖的甲基化：形成稀有碱基碱基或戊糖的甲基化：形成稀有碱基。 CpGCpG岛甲基化：参与基因表达调控岛甲基化：参与基因表达调控。 磷酸骨架磷硫酰化修饰：磷酸骨架磷硫酰化修饰：DNADNA降解降解 目目 录录 第第 五五 节节 核核 酸酸 酶酶 Nucleases 目目 录录 一、核酸酶的分类一、核酸酶的分类 （一）按底物专一性分类（一）按底物专一性分类 DNADNA酶酶(deoxyribonuclease, DNase)(deoxyribonuclease, DNase)： 专一降解专一降解DNADNA。 RNARNA酶酶 (ribonuclease, RNase)(ribo

13、nuclease, RNase)： 专一降解专一降解RNARNA。 目目 录录 （二）按对底物作用方式不同分类（二）按对底物作用方式不同分类 核酸内切酶：核酸内切酶：限制性核酸内切酶限制性核酸内切酶 非特异性限制性核酸内切酶。非特异性限制性核酸内切酶。 产物：产物：3OH核酸与核酸与5磷酸核酸磷酸核酸 3磷酸核酸与磷酸核酸与5 核酸核酸 核酸外切酶：核酸外切酶：5 3 或或3 5 核酸外切酶。核酸外切酶。 （三）按对底物二级结构的专一性分类（三）按对底物二级结构的专一性分类 双链酶：双链酶：作用于双链核酸作用于双链核酸 单链酶：单链酶：作用于单链核酸作用于单链核酸 目目 录录 二、核糖核酸酶：

14、二、核糖核酸酶：RNARNA内切酶内切酶 （一）胰核糖核酸酶（一）胰核糖核酸酶(RNase1): 作用点：嘧啶核苷酸，产物：作用点：嘧啶核苷酸，产物：3嘧啶核苷酸嘧啶核苷酸 RNase1保护实验：转录调控的研究。保护实验：转录调控的研究。 （二）（二）RNaseT1: 识别识别鸟嘌呤核苷酸，产物鸟嘌呤核苷酸，产物3鸟苷酸鸟苷酸 （三）（三）RNaseT2: 识别腺嘌呤核苷酸，产物识别腺嘌呤核苷酸，产物3腺苷酸腺苷酸 目目 录录 三、脱氧核糖核酸酶：三、脱氧核糖核酸酶：DNADNA消化酶消化酶 （一）胰（一）胰DNaseDNase：切割单链切割单链/ /双链，产物双链，产物DNADNA是是5 5

15、 - -磷磷 酸末端的寡聚核苷酸酸末端的寡聚核苷酸 （二）脾（二）脾DNase DNase ：产物是产物是3 3 - -磷酸末端的寡聚核苷酸磷酸末端的寡聚核苷酸 （三）（三）BAL 31 BAL 31 核酸酶：核酸酶：DNA3DNA3外切酶活性为主。外切酶活性为主。 （四）限制性内切核酸酶：（四）限制性内切核酸酶：具有位点特异性。具有位点特异性。 目目 录录 目的和要求目的和要求 掌握：掌握：核酸的组成与一级结构；核酸的组成与一级结构； DNA双螺旋结构模型特点；双螺旋结构模型特点； mRNA和和tRNA结构与功能；结构与功能； 核酸理化性质及其应用核酸理化性质及其应用。 熟悉：熟悉：DNA超螺旋结构与超螺旋结构与DNA的功能；的功能； rRNA的结构与功能；的结构与功能； 核酸酶。核酸酶。