医科大学精品课件：电泳.ppt

1、电电 泳泳 Electrophoresis 一、定义一、定义 电泳电泳带电粒子在直流电场中向着电性带电粒子在直流电场中向着电性 相反电极移动的现象。相反电极移动的现象。 电泳分析技术电泳分析技术利用电泳现象进行物质利用电泳现象进行物质 分离的技术分离的技术。 二、电泳分析技术发展概况二、电泳分析技术发展概况 1809年年 发现电泳现象发现电泳现象 1937年年 Tiselius 自由界面电泳自由界面电泳 1948年年 Wieland 滤纸电泳滤纸电泳 1980s 毛细管电泳毛细管电泳 (capiliary electrophoresis) 三、电泳分析技术的分类三、电泳分析技术的分类 1.根据

2、被分离样品的量多少根据被分离样品的量多少 分析电泳分析电泳 制备电泳制备电泳 2.根据电泳电压的高低根据电泳电压的高低 常压电泳常压电泳 0500 V 高压电泳高压电泳 5003000V 3. .根据电泳中是否使用支持物根据电泳中是否使用支持物 自由电泳自由电泳不使用支持物不使用支持物，在溶液中进行在溶液中进行。 区带电泳区带电泳使用支持物使用支持物 (1) 按支持物的物理性状不同按支持物的物理性状不同 滤纸及其他纤维薄膜电泳滤纸及其他纤维薄膜电泳，如醋酸纤维素如醋酸纤维素、 玻璃纤维玻璃纤维、聚氯乙烯纤维聚氯乙烯纤维 凝胶电泳凝胶电泳，如琼脂如琼脂、琼脂糖琼脂糖、硅胶硅胶、淀粉淀粉 胶胶、聚

3、丙烯酰胺凝胶电泳聚丙烯酰胺凝胶电泳 粉末电泳粉末电泳，纤维素粉纤维素粉、淀粉淀粉、玻璃粉电泳玻璃粉电泳 丝状电泳丝状电泳，如尼龙丝如尼龙丝、人造丝电泳人造丝电泳 (2)按支持物的装置形式不同按支持物的装置形式不同 平板式电泳平板式电泳 垂直板式电泳垂直板式电泳 垂直柱式电泳垂直柱式电泳 4.根据电泳系统根据电泳系统pH是否连续是否连续 连续连续pH电泳电泳指电泳过程中指电泳过程中pH保持不变保持不变 不连续不连续pH电泳电泳指电极缓冲液和电泳支持指电极缓冲液和电泳支持 物的不同区段也有不同的物的不同区段也有不同的pH 电泳技术的特点电泳技术的特点: 凡是带电物质均可应用某一电泳技术进凡是带电物

4、质均可应用某一电泳技术进 行分离行分离,并可进行定性或定量分析并可进行定性或定量分析; 样品用量极少样品用量极少; 设备简单设备简单; 可在常温进行可在常温进行; 操作简便省时操作简便省时; 分辨率高分辨率高. 四、电泳的基本原理四、电泳的基本原理 一个质点，如能解离或能吸一个质点，如能解离或能吸 附带电质点，在电场中便会附带电质点，在电场中便会 向正极或负极移动。向正极或负极移动。 F= EQ （Q：有效电荷有效电荷，E：电位梯度电位梯度） F=6 r v （F：摩擦阻力摩擦阻力，v：在介质粘度在介质粘度中半径为中半径为r的颗的颗 粒的移动速度粒的移动速度） F=F EQ=6 r v E Q

5、 v= 6 r 以蛋白质分子为例以蛋白质分子为例: 迁移率迁移率（Mobility)带电颗粒在单位电场带电颗粒在单位电场 强度下的泳动速度强度下的泳动速度。 V Q M=-= - E 6 r 五、影响电泳速度的因素五、影响电泳速度的因素 1.电场强度电场强度（E） E电流电流热效应热效应支持介质上的水支持介质上的水 分蒸发分蒸发样品的热变性样品的热变性 E电泳速度慢电泳速度慢延长电泳时间延长电泳时间样样 品扩散品扩散区带模糊不清区带模糊不清分辨率下降分辨率下降 2 带点颗粒的半径与电荷带点颗粒的半径与电荷 3 支持物介质支持物介质 吸附作用 电渗作用：电渗作用： 分子筛作用 4 缓冲液缓冲液

6、离子强度离子强度（I） I缓冲能力越大缓冲能力越大缓冲液所载的分电缓冲液所载的分电 流增加流增加，而样品所载的电流相应减少而样品所载的电流相应减少 电泳速度减慢电泳速度减慢。 pH pH值决定了化合物解离的程度值决定了化合物解离的程度，也决也决 定了质点所带的净电荷定了质点所带的净电荷。 聚丙烯酰胺凝胶电泳聚丙烯酰胺凝胶电泳 Polyacrylamide Gel Electrophoresis ，PAGE 一、一、PAGE PAGE 的的 组成组成 PAGE是由是由丙烯酰胺丙烯酰胺（Acr）单单 体和体和N，N-亚甲双丙烯酰胺亚甲双丙烯酰胺（Bis） 交联剂通过自由基聚合而成的一种交联剂通过自

7、由基聚合而成的一种 多孔三维网状结构多孔三维网状结构。 Acr + Bis- 多孔三维网状结构多孔三维网状结构 二、二、PAGE PAGE 的的 聚聚 合合 需要催化剂需要催化剂氧氧 化还原系统作用，使化还原系统作用，使 AcrAcr单体带有游离基，单体带有游离基， 从而与从而与BisBis进行聚合。进行聚合。 化学聚合：化学聚合：AP-TEMED系统系统 过硫酸胺（过硫酸胺（AP） 作为催化剂，四甲基作为催化剂，四甲基 乙二胺（乙二胺（TEMED） 为加速剂。为加速剂。 AP在水溶液中能产生游离基在水溶液中能产生游离基SO42-，使丙烯酰胺单使丙烯酰胺单 体的双键打开体的双键打开，活化形成自

8、由基丙烯酰胺活化形成自由基丙烯酰胺，然后然后 游离游离Acr和和Bis作用就能聚合形成凝胶作用就能聚合形成凝胶。 TEMED的游离碱基能促进的游离碱基能促进AP的形成的形成SO42- 。 注意：注意： TEMED会影响催化作用会影响催化作用，须在碱性条件下聚合须在碱性条件下聚合 氧存在氧存在，聚合不完全聚合不完全，须去除分子氧须去除分子氧，隔绝氧隔绝氧 升高温度能提高聚合升高温度能提高聚合，降低温度能延迟聚合降低温度能延迟聚合。 凝胶总浓度凝胶总浓度T100ml凝胶溶液中含有凝胶溶液中含有Acr和和 Bis的总克数。的总克数。 T=（a+b）/m100% T越大，凝胶孔径越小，适用于分离分子量

9、较越大，凝胶孔径越小，适用于分离分子量较 小的物质。小的物质。 T越小，凝胶孔径越大，适用于分离分子量较越小，凝胶孔径越大，适用于分离分子量较 大的物质。大的物质。 CBis占单体与交联剂总量的百分比。占单体与交联剂总量的百分比。 C=b/（a+b）100% 当当T固定时，固定时，Bis浓度在浓度在5%时孔径最小时孔径最小。 分分 离离 原原 理理 1.浓缩效应浓缩效应 1）凝胶层的不连续性）凝胶层的不连续性 两层凝胶两层凝胶T与与C不同不同孔径不同孔径不同 浓缩胶孔径大，分离胶孔径小，蛋白质在大孔浓缩胶孔径大，分离胶孔径小，蛋白质在大孔 径浓缩胶中移动，受阻力小，移动速度快径浓缩胶中移动，受

10、阻力小，移动速度快。 2）缓冲液离子成分的不连续性）缓冲液离子成分的不连续性 甘氨酸甘氨酸（pI=6.0）进入浓缩胶（进入浓缩胶（pH6.7），），甘甘 氨酸解离度（氨酸解离度（ ）很小，有效迁移率（）很小，有效迁移率（M ） 很低，移动速度较慢，称为很低，移动速度较慢，称为慢离子慢离子。 HCl 是强电解质，是强电解质， =1，Cl-有效迁移率大，有效迁移率大， 移动速度快，称移动速度快，称快离子快离子。 蛋白质蛋白质（pI6.0）带负电荷，带负电荷，有效迁移率介有效迁移率介 于两者之间。于两者之间。 pH8.3 TrispH8.3 Tris- -甘氨酸缓冲液甘氨酸缓冲液 甘氨酸甘氨酸 HC

11、lHCl 蛋白质蛋白质 浓缩胶浓缩胶 分离胶分离胶 样品样品 PH=6.7 T=3% PH=8.9 T=5% 3.分子筛效应与电荷效应分子筛效应与电荷效应 进入分离胶后，进入分离胶后，Gly-成为快离子成为快离子 分离胶只有电荷效应和分子筛效应，根分离胶只有电荷效应和分子筛效应，根 据各蛋白质所带电荷不同、分子大小不同据各蛋白质所带电荷不同、分子大小不同 而分离而分离 关于乳酸脱氢酶关于乳酸脱氢酶 乳酸脱氢酶同工酶活性染色乳酸脱氢酶同工酶活性染色 用活性染色对用活性染色对LDHLDH进行鉴定，将凝胶浸泡在活进行鉴定，将凝胶浸泡在活 性染色液中，性染色液中，LDHLDH与底物的反应，用甲硫吩嗪与

12、底物的反应，用甲硫吩嗪(PMS)(PMS) 作为电子的中间载体，氯化硝基四氮唑蓝作为电子的中间载体，氯化硝基四氮唑蓝(NBT)(NBT)作作 为最终电子受体，底物脱下的氢最后传递给为最终电子受体，底物脱下的氢最后传递给NBTNBT， NBTNBT被还原后，产生蓝紫色的不溶于水的物质以对被还原后，产生蓝紫色的不溶于水的物质以对 LDHLDH定位。反应式如下：定位。反应式如下： LDH4 LDH3 LDH5 LDH1 LDH2 1 2 3 4 电泳结果实例电泳结果实例 结果： LDH3 LDH2 LDH1 溴酚蓝 + 1 1 加样加样 2 2 电泳（电泳（2mA/2mA/管，管，3030分钟；分钟；5 mA/5 mA/管，管，1h1h） 3 3 凝胶溶液的配置凝胶溶液的配置 4 4 凝胶管的制备凝胶管的制备 5 5 剥胶剥胶 6 6 染色染色 实验报告：实验报告： 一、原理一、原理 二、操作二、操作 三、结果三、结果