1、质粒质粒DNA的提取及鉴定的提取及鉴定 生物化学与分子生物学系生物化学与分子生物学系 实验目的实验目的 掌握质粒掌握质粒DNA制备的原理和方法制备的原理和方法 了解质粒琼脂糖凝胶电泳分离了解质粒琼脂糖凝胶电泳分离 Bacterial DNA Plasmids 质粒质粒 实验原理实验原理 细菌悬浮液暴露于阴离子去污剂（细菌悬浮液暴露于阴离子去污剂（SDS） 细胞壁破裂，染色体细胞壁破裂，染色体DNA和蛋白质变性和蛋白质变性 相互缠绕成复合物被相互缠绕成复合物被SDS包裹，当用包裹，当用K+取代取代 Na+时，复合物从溶液中沉淀下来。时，复合物从溶液中沉淀下来。 离心后可从上清中回收质粒离心后可从
2、上清中回收质粒DNA 试试 剂剂 溶液溶液：50 mmol/L葡萄糖、葡萄糖、10mmol/L EDTA、 25mmol Tris-HCl pH8.0 溶液溶液II（新鲜配制）（新鲜配制）: 1mol/L NaOH 200 l、 10% SDS 100 l、H2O 700 l 溶液溶液 III : 29.4g KAc、11.5ml冰醋酸、加水至冰醋酸、加水至 100ml 实验流程实验流程 细菌于细菌于LB培养基中培养过夜，分装（培养基中培养过夜，分装（1ml/ 支），支），4000rpm离心离心2min，弃上清。，弃上清。 沉淀重悬于沉淀重悬于100 l溶液溶液中中, 震荡震荡混匀。混匀。 加
3、入加入200 l新鲜配制新鲜配制的溶液的溶液，颠倒颠倒混匀。混匀。 加入加入150 l溶液溶液，颠倒颠倒混匀，冰浴混匀，冰浴5min， 12000rpm离心离心10min。 上清移至另一干净上清移至另一干净EP管中，加入管中，加入等体积饱和等体积饱和 酚酚（约（约450 l），颠倒混匀，），颠倒混匀，12000rpm 离心离心 10min。 实验流程实验流程 上清移至另一干净上清移至另一干净EP管中，加入管中，加入等体积酚等体积酚/氯氯 仿仿，颠倒颠倒混匀，混匀，12000rpm离心离心10min。 上清移至另一干净上清移至另一干净EP管中，加入管中，加入2倍体积冷无倍体积冷无 水乙醇水乙醇混匀，静置混匀，静置5min，12000rpm离心离心10min。 弃上清，用弃上清，用0.5ml 70% 乙醇洗涤乙醇洗涤DNA，弃上清，弃上清， 倒置干燥。倒置干燥。 加入加入10 l TE，1%琼脂糖凝胶电泳观察。琼脂糖凝胶电泳观察。 核酸的定量核酸的定量 260 nm， 1OD值相当于：值相当于： 双链双链DNA浓度为浓度为50 g/ml 单链单链DNA浓度为浓度为40 g/ml A260/A280 = 1.8（DNA） A260/A280 = 2.0（RNA）
