花青素提取方法总结课件.ppt

1、1/28/20231玉米籽粒花青素提取和分析方法1/28/20232 花青素是植物中的主要呈色物质，属于类黄酮化合物 自然状态下很少以游离态存在，常与一个或多个多糖通过糖苷键形成糖苷 已知有20多种花青素，植物中常见的有六种：天竺葵色素、矢车菊色素、飞燕草色素、芍药色素、牵牛花色素、锦葵色素（其最大可见光吸收波长分别为494、506、508、506、508和510 nm）1/28/20233花青素的生理功能 消除自由基、抗氧化 紫玉米花色苷具有很高的抗氧化活性和抗 菌活性，甚至高于蓝莓的抗氧化活性。抗诱变、肿瘤、过敏 抑制食品诱变剂，对结肠癌细胞有抑制作用 降血脂1/28/20234花青素的结

2、构特点现已查明,天然花色苷糖苷配基的基本结构为3,5,7-三羟基-2-苯基苯并吡喃,结构式为:1/28/20235花青素的稳定性影响因素 结构C3羟基可使分子变得不稳定，C5上有羟基或C4发生取代都可使颜色趋于稳定糖苷的形成也影响花色苷的稳定性花色苷的酰基化显著增加其在微酸性至中性介质中的稳定性1/28/20236 温度 PH醌型碱黄烊盐阳离子假碱查尔酮1/28/20237 温度 当花色苷溶液加热时,平衡向着无色的查耳酮(C)的方向进行,同时引起有色型化合物(AH+A)的降低。当冷却和酸化时,醌型碱(A)和假碱(B)迅速变成阳离子(AH+)。花色苷在温度小于 60的条件下较为稳定，当温度大于

3、80时，温度对花色苷有较明显的降解作用；光对花色 苷的稳定性影响 很大1/28/20238辅色剂的影响花色苷同辅色剂联合形成一种垂直层叠的复合物(Goto 等1979),这种层叠过程产生一种疏水力,从而防止亲水核的加合作用和失色。1/28/20239提取方法：一、萃取 溶剂法 常用的溶剂主要分为3类:水、亲水性有机溶剂和亲脂性有机溶剂。为防止花色苷的降解和提高花色苷的溶出率,常在溶剂中加少量的无机酸或有机酸，使提取液的p H 控制在3.15 以下。1/28/202310l这是目前国内外广泛使用的提取方法，多数选择甲醇、乙醇、丙酮或它们的混合溶剂对材料中的花青素进行溶解过滤，通过酸或碱调节溶液酸

4、碱度萃取滤液中的花青素。l该方法原理简单，对设备要求较低，不足之处是大多数有机溶剂毒副作用大且产物提取率低。有机溶剂萃取法1/28/202311水溶液提取法 该方法一般在常压或高压下用热水浸泡含花青素的原材料，然后用非极性大孔树脂进行吸附；或直接使用脱氧热水提取，再采用超滤或反渗透经浓缩得到粗提物 陆国权等 研究表明，提取脚板薯花青素的最佳方法是：以05 硫酸溶液作浸提剂，并使其pH440，在6O下加热60 min。设备简单，无污染，产品无毒但纯度低。1/28/202312超临界流体萃取法 利用压力和温度对超临界流体溶解能力的影响进行提取。最大的优点是产品提取率高，可以低温操作，避免了不饱和脂

5、肪酸的氧化分解，溶剂无残留，且作为超临界流体的CO2易得，萃取能耗低。时海香等人研究了超临界CO2 萃取常山胡柚天然色素的工艺，色素提取率可达96.187%1/28/202313提取方法：二、破除细胞壁 发酵提取法 原理是:通过微生物的作用使紫甘薯中的淀粉转化为乙醇,将乙醇分离后,可得到紫甘薯花色苷,原料的利用率大大提高。其利用微生物破坏细胞壁和细胞膜,促进花色苷的溶出,提高提取率。通过发酵分解色素液中的糖、有机酸和其他杂质,大大降低了色素的纯化难度。1/28/202314酶法提取 用于花色苷提取的酶主要有纤维素酶和果胶酶,通过酶解使植物细胞壁软化、膨胀及崩溃,从而促进了花色苷的溶出。王萍等人

6、通过单因素和正交试验,确定了黑加仑果渣花色苷酶法提取的的最佳工艺，黑加仑花色苷提取率的91.109%,此法可以大大缩短花色苷提取时间,提高得率。1/28/202315辅助方法 超声波辅助提取 在超声波声场中,振动负压区由于周围的液体来不及补充,形成无数的微小真空泡,而当正压来到时,微小气泡在压力下突然闭合,液体间猛烈碰撞产生极大的冲击波,压力可高达3 000 MPa,从而使植物细胞破裂,利于花色苷的溶出。此法具有提取时间短,设备简单,操作方便等优点,并可有效防止热敏性成分的高温分解。1/28/202316微波辅助提取 当微波加热时,细胞内极性物质尤其是水分子吸收微波能,产生大量的热量使细胞内温

7、度迅速上升,液态水汽化产生的巨大压力将细胞膜和细胞壁冲破,形成微小的孔洞,使胞外溶剂容易进入细胞内,溶解并释放出胞内物质。与传统方法相比,微波法具有提取率高、时间短、能耗小等优点,因此微波用于天然素的提取工艺具有广阔的应用前景。1/28/202317其他辅助方法 高压脉冲电场辅助提取 高压脉冲电场辅助提取法是一种新型非热技术,它具有提取温度低、速率快、时间短、提取率高、产品品质好的特点。液态静高压法辅助提取 Corrales 等人用液态静高压辅助提取的方法从葡萄皮中提取花色苷,研究所得的最优工艺参数是:100%乙醇,温度50,压力600 MPa。此法与未使用HHP 法相比,产率提高23%。H

8、HP 具有提取温度低,时间短,不破坏色素结构等优点,但应用于花色苷等活性成分提取的报道还不多见。1/28/202318提取条件比较1/28/2023191/28/202320纯化 经过提取的花色苷粗品中往往含有很多有机酸、糖等杂质,产品质量稳定性差、纯度不高。为了提高产品的色价和稳定性,需要对提取物进一步纯化。1/28/202321柱层析法 凝胶柱层析 聚酰胺层析 硅胶层析 离子交换层析1/28/202322大孔树脂层析 大孔树脂是近代发展起来的一类有机高聚物吸附剂。分离工艺得到的提取物不吸潮，工艺简单，成本相对较低，树脂可反复使用适合工业化生产 杨迎花等 采用大孔树脂吸附纯化葡萄籽原花青素，

9、结果表明大孔树脂吸附纯化工艺简单、成本低、产率高、安全适用。1/28/202323膜分离法 花色苷提取中常用的膜分离技术有超滤(UF)、反渗透(RO)、电渗析(ED)等。Patil 用酸化的乙醇提取红萝卜花色苷,随后用膜分离的方法有效的脱醇并浓缩了花色苷提取液,使花色苷含量从37216 mg/L 提高到62518 mg/L 膜分离纯化的花色苷色价和透明度高,稳定性好,容易实现连续化生产,生产过程劳动强度低,流程简单,但对设备要求高,纯化成本高,提取效率低。1/28/202324鉴定 经过加工或储藏的材料会产生褐色降解物经过加工或储藏的材料会产生褐色降解物,这些降解物和花色苷具有相同的能量吸收这

10、些降解物和花色苷具有相同的能量吸收范围范围.这类花色苷总量的测定这类花色苷总量的测定,通常有两种方通常有两种方法法 pH示差法示差法 差减法差减法1/28/202325鉴定方法 柱层析 薄层层析 光谱分析法 HPLC、MS、HPLCMS 核磁共振法 毛细管区带电泳法1/28/202326紫外可见光谱法 色素的紫外吸收光谱是色素的重要特征。吸收光谱是鉴定和测量混合物中主要色素的最简单方法。其主要原理是依据花色苷的不同基团的在不同的波长下有不同的吸收峰,进而推断出其结构。B环有邻位羟基的确定。糖基位置的确定。酰基是否存在的确定。甲基化与羟基化1/28/202327HPLC 高效液相色谱法(HPLC

11、)以经典的色谱法为基础,引入了气相色谱法的理论和实验方法,流动相改为高压输送,采用高效固定相及在线检测手段发展而成的一种高效快速分离分析技术。HPLC 可以在30min 一个流程内分离15种不同的花色苷,其分辨能力远远超过纸层析和薄层层析。但是,由于缺乏花色苷的标准对照品,使得仅靠HPLC 方法对花色苷进行定性和定量分析还不够充分。1/28/202328出峰顺序 9种花色素苷的出峰顺序：花翠素3O一葡萄糖苷、花青素3-0葡萄糖苷、3一甲花翠素3O葡萄糖苷、甲基花青素3O葡萄糖苷、二甲花翠素3O葡萄糖苷、甲基花青素3O一(6一O一乙酰)葡萄糖苷、二甲花翠素3O(6O乙酰)葡萄糖苷、甲基花青素3O

12、(6o-对香豆酰)葡萄糖苷、二甲花翠素3O(60对香豆酰)葡萄糖苷1/28/202329双标样高效液相色谱法测定紫玉米花青素的含量 设备Agilent 1 100高效液相色谱仪和Agilent Ion TrapXCT MS：美国安捷伦公司；Waters Xbridge C18(250 mmx46 mm，5 m)柱：美国Waters公司 色谱流动相：A(5甲酸)，B(甲酸：水：乙腈=5：45：50，体积比)；流速：0.8mUmin;DAD检测器；柱温30；梯度洗脱。1/28/202330 标样 C3G 和P3G（紫玉米花青素其主要以C3G 和P3G 及其衍生物为主要组成部分）结果C3G 的加标回

13、收率为93.7%（RSD 为0.804%），可以确定以C3G 为标样测定样品C3G 含量更加准确。同理，样品中P3G 及其衍生物以P3G 为标样获得的结果更可靠。因此，使用双标样高效液相色谱法获得的紫玉米花青素含量（93.77 mg/g）更加准确。P3G：芍药色素-3-葡萄糖 CG：矢车菊色素-3-葡萄糖苷1/28/2023311/28/202332紫玉米花青素种类 近年来,采用温和的提取分离方法和现代分析仪器手段如TLC、HPLC、MS、NMR 等,Aok i等研究发现紫玉米籽粒中含有8种花青苷:矢车菊素-3-葡萄糖苷、天竺葵素-3-葡萄糖苷、芍药素-3-葡萄糖苷、两个矢车菊素-3-丙二酸酰

14、基葡萄糖苷同分异构体、天竺葵素-3-丙二酸酰基葡萄糖苷、芍药素-3-丙二酸酰基葡萄糖苷、矢车菊素-3-二丙二酸酰基葡萄糖苷。Zhao等对中国紫玉米杂交品种的籽粒进行了质谱分析,初步发现9个花青苷单体物质,包括矢车菊素-3-葡萄糖苷、天竺葵素-3-葡萄糖苷、芍药素-3-葡萄糖苷、两个矢车菊素-3-丙二酸酰基葡萄糖苷同分异构体、天竺葵素-3-丙二酸酰基葡萄糖苷、两个芍药素-3-丙二酸酰基葡萄糖苷同分异构体、天竺葵素-3-二丙二酸酰基葡萄糖苷。1/28/202333含量 每100 g秘鲁紫玉米中含色素物质为1 640mg,远远高于鲜蓝莓花青苷的(73 430mg)。籽粒表皮含大部分的花青苷,通常为5

15、04 1473mg,而Moreno等 发现,在一些南美紫玉米品种(Arrocillo,Con ico,Peruano 和Purepecha)的脱胚芽玉米籽粒中,含54 115mg的花青苷。Zhao等发现中国紫玉米杂交品种的籽粒中,花青苷高达305mg(以100 g干质量计,下同)。敬璞等研究发现秘鲁紫玉米芯花青苷含量高达1333mg1/28/202334初步的提取方案 提取(1):酸醇提取液：体积分数95%乙醇与质量浓度0.1 mg/L HCl 的质量比为85 15。以酸醇为提取液：料液比1 20，时间60 min，提取温度55。提取两次（玉米叶，提取量27.6 mg/g）标样：矢车菊素-3-

16、葡萄糖苷1/28/202335 提取（2）：选用 1%HCl甲醇做浸提剂,在 50浸提2次，每次1.5h 采用离心法在常温下6000r/min,离心10min 1/28/202336问题 玉米中用到的方法 提取流程 C:色谱条件标样：2个或多个检测波长11醉翁亭记 1反复朗读并背诵课文，培养文言语感。2结合注释疏通文义，了解文本内容，掌握文本写作思路。3把握文章的艺术特色，理解虚词在文中的作用。4体会作者的思想感情，理解作者的政治理想。一、导入新课范仲淹因参与改革被贬，于庆历六年写下岳阳楼记，寄托自己“先天下之忧而忧，后天下之乐而乐”的政治理想。实际上，这次改革，受到贬谪的除了范仲淹和滕子京之

17、外，还有范仲淹改革的另一位支持者北宋大文学家、史学家欧阳修。他于庆历五年被贬谪到滁州，也就是今天的安徽省滁州市。也是在此期间，欧阳修在滁州留下了不逊于岳阳楼记的千古名篇醉翁亭记。接下来就让我们一起来学习这篇课文吧！【教学提示】结合前文教学，有利于学生把握本文写作背景，进而加深学生对作品含义的理解。二、教学新课目标导学一：认识作者，了解作品背景作者简介：欧阳修(10071072)，字永叔，自号醉翁，晚年又号“六一居士”。吉州永丰(今属江西)人，因吉州原属庐陵郡，因此他又以“庐陵欧阳修”自居。谥号文忠，世称欧阳文忠公。北宋政治家、文学家、史学家，与韩愈、柳宗元、王安石、苏洵、苏轼、苏辙、曾巩合称“

18、唐宋八大家”。后人又将其与韩愈、柳宗元和苏轼合称“千古文章四大家”。关于“醉翁”与“六一居士”：初谪滁山，自号醉翁。既老而衰且病，将退休于颍水之上，则又更号六一居士。客有问曰：“六一何谓也？”居士曰：“吾家藏书一万卷，集录三代以来金石遗文一千卷，有琴一张，有棋一局，而常置酒一壶。”客曰：“是为五一尔，奈何？”居士曰：“以吾一翁，老于此五物之间，岂不为六一乎？”写作背景：宋仁宗庆历五年(1045年)，参知政事范仲淹等人遭谗离职，欧阳修上书替他们分辩，被贬到滁州做了两年知州。到任以后，他内心抑郁，但还能发挥“宽简而不扰”的作风，取得了某些政绩。醉翁亭记就是在这个时期写就的。目标导学二：朗读文章，通

19、文顺字1初读文章，结合工具书梳理文章字词。2朗读文章，划分文章节奏，标出节奏划分有疑难的语句。节奏划分示例环滁/皆山也。其/西南诸峰，林壑/尤美，望之/蔚然而深秀者，琅琊也。山行/六七里，渐闻/水声潺潺，而泻出于/两峰之间者，酿泉也。峰回/路转，有亭/翼然临于泉上者，醉翁亭也。作亭者/谁？山之僧/曰/智仙也。名之者/谁？太守/自谓也。太守与客来饮/于此，饮少/辄醉，而/年又最高，故/自号曰/醉翁也。醉翁之意/不在酒，在乎/山水之间也。山水之乐，得之心/而寓之酒也。节奏划分思考“山行/六七里”为什么不能划分为“山/行六七里”？明确：“山行”意指“沿着山路走”，“山行”是个状中短语，不能将其割裂。

20、“望之/蔚然而深秀者”为什么不能划分为“望之蔚然/而深秀者”？明确：“蔚然而深秀”是两个并列的词，不宜割裂，“望之”是总起词语，故应从其后断句。【教学提示】引导学生在反复朗读的过程中划分朗读节奏，在划分节奏的过程中感知文意。对于部分结构复杂的句子，教师可做适当的讲解引导。目标导学三：结合注释，翻译训练1学生结合课下注释和工具书自行疏通文义，并画出不解之处。【教学提示】节奏划分与明确文意相辅相成，若能以节奏划分引导学生明确文意最好；若学生理解有限，亦可在解读文意后把握节奏划分。2以四人小组为单位，组内互助解疑，并尝试用“直译”与“意译”两种方法译读文章。3教师选择疑难句或值得翻译的句子，请学生用

21、两种翻译方法进行翻译。翻译示例：若夫日出而林霏开，云归而岩穴暝，晦明变化者，山间之朝暮也。野芳发而幽香，佳木秀而繁阴，风霜高洁，水落而石出者，山间之四时也。直译法：那太阳一出来，树林里的雾气散开，云雾聚拢，山谷就显得昏暗了，朝则自暗而明，暮则自明而暗，或暗或明，变化不一，这是山间早晚的景色。野花开放，有一股清幽的香味，好的树木枝叶繁茂，形成浓郁的绿荫。天高气爽，霜色洁白，泉水浅了，石底露出水面，这是山中四季的景色。意译法：太阳升起，山林里雾气开始消散，烟云聚拢，山谷又开始显得昏暗，清晨自暗而明，薄暮又自明而暗，如此暗明变化的，就是山中的朝暮。春天野花绽开并散发出阵阵幽香，夏日佳树繁茂并形成一片

22、浓荫，秋天风高气爽，霜色洁白，冬日水枯而石底上露，如此，就是山中的四季。【教学提示】翻译有直译与意译两种方式，直译锻炼学生用语的准确性，但可能会降低译文的美感；意译可加强译文的美感，培养学生的翻译兴趣，但可能会降低译文的准确性。因此，需两种翻译方式都做必要引导。全文直译内容见我的积累本。目标导学四：解读文段，把握文本内容1赏析第一段，说说本文是如何引出“醉翁亭”的位置的，作者在此运用了怎样的艺术手法。明确：首先以“环滁皆山也”五字领起，将滁州的地理环境一笔勾出，点出醉翁亭坐落在群山之中，并纵观滁州全貌，鸟瞰群山环抱之景。接着作者将“镜头”全景移向局部，先写“西南诸峰，林壑尤美”，醉翁亭坐落在有

23、最美的林壑的西南诸峰之中，视野集中到最佳处。再写琅琊山“蔚然而深秀”，点山“秀”，照应上文的“美”。又写酿泉，其名字透出了泉与酒的关系，好泉酿好酒，好酒叫人醉。“醉翁亭”的名字便暗中透出，然后引出“醉翁亭”来。作者利用空间变幻的手法，移步换景，由远及近，为我们描绘了一幅幅山水特写。2第二段主要写了什么？它和第一段有什么联系？明确：第二段利用时间推移，抓住朝暮及四季特点，描绘了对比鲜明的晦明变化图及四季风光图，写出了其中的“乐亦无穷”。第二段是第一段“山水之乐”的具体化。3第三段同样是写“乐”，但却是写的游人之乐，作者是如何写游人之乐的？明确：“滁人游”，前呼后应，扶老携幼，自由自在，热闹非凡；

24、“太守宴”，溪深鱼肥，泉香酒洌，美味佳肴，应有尽有；“众宾欢”，投壶下棋，觥筹交错，说说笑笑，无拘无束。如此勾画了游人之乐。4作者为什么要在第三段写游人之乐？明确：写滁人之游，描绘出一幅太平祥和的百姓游乐图。游乐场景映在太守的眼里，便多了一层政治清明的意味。太守在游人之乐中酒酣而醉，此醉是为山水之乐而醉，更是为能与百姓同乐而醉。体现太守与百姓关系融洽，“政通人和”才能有这样的乐。5第四段主要写了什么？明确：写宴会散、众人归的情景。目标导学五：深入解读，把握作者思想感情思考探究：作者以一个“乐”字贯穿全篇，却有两个句子别出深意，不单单是在写乐，而是另有所指，表达出另外一种情绪，请你找出这两个句子

25、，说说这种情绪是什么。明确：醉翁之意不在酒，在乎山水之间也。醉能同其乐，醒能述以文者，太守也。这种情绪是作者遭贬谪后的抑郁，作者并未在文中袒露胸怀，只含蓄地说：“醉能同其乐，醒能述以文者，太守也。”此句与醉翁亭的名称、“醉翁之意不在酒，在乎山水之间也”前后呼应，并与“滁人游”“太守宴”“众宾欢”“太守醉”连成一条抒情的线索，曲折地表达了作者内心复杂的思想感情。目标导学六：赏析文本，感受文本艺术特色1在把握作者复杂感情的基础上朗读文本。2反复朗读，请同学说说本文读来有哪些特点，为什么会有这些特点。(1)句法上大量运用骈偶句，并夹有散句，既整齐又富有变化，使文章越发显得音调铿锵，形成一种骈散结合的

26、独特风格。如“野芳发而幽香，佳木秀而繁阴”“朝而往，暮而归，四时之景不同，而乐亦无穷也”。(2)文章多用判断句，层次极其分明，抒情淋漓尽致，“也”“而”的反复运用，形成回环往复的韵律，使读者在诵读中获得美的享受。(3)文章写景优美，又多韵律，使人读来不仅能感受到绘画美，也能感受到韵律美。目标导学七：探索文本虚词，把握文言现象虚词“而”的用法用法文本举例表并列1.蔚然而深秀者；2.溪深而鱼肥；3.泉香而酒洌；4.起坐而喧哗者表递进1.而年又最高；2.得之心而寓之酒也表承接1.渐闻水声潺潺，而泻出于两峰之间者；2.若夫日出而林霏开，云归而岩穴暝；3.野芳发而幽香，佳木秀而繁阴；4.水落而石出者；5

27、.临溪而渔；6.太守归而宾客从也；7.人知从太守游而乐表修饰1.朝而往，暮而归；2.杂然而前陈者表转折1.而不知人之乐；2.而不知太守之乐其乐也虚词“之”的用法用法文本举例表助词“的”1.泻出于两峰之间者；2.醉翁之意不在酒；3.山水之乐；4.山间之朝暮也；5.宴酣之乐位于主谓之间，取消句子独立性而不知太守之乐其乐也表代词1.望之蔚然而深秀者；2.名之者谁(指醉翁亭)；3.得之心而寓之酒也(指山水之乐)【教学提示】更多文言现象请参见我的积累本。三、板书设计路线：环滁琅琊山酿泉醉翁亭风景：朝暮之景四时之景山水之乐(醉景)风俗：滁人游太守宴众宾欢 太守醉宴游之乐(醉人)心情：禽鸟乐人之乐乐其乐与民同乐(醉情)可取之处重视朗读，有利于培养学生的文言语感，并通过节奏划分引导学生理解文意，突破了仅按注释疏通文义的桎梏，有利于引导学生自主思考；不单纯关注“直译”原则，同时培养学生的“意译”能力，引导学生关注文言文的美感，在一定程度上有助于培养学生的核心素养。不足之处文章难度相对较高，基础能力低的学生难以适应该教学。会员免费下载