乳酸发酵研究进展解析课件.ppt

1、 乳酸发酵乳酸发酵:指糖经无氧酵解而生成指糖经无氧酵解而生成乳酸乳酸的发酵的发酵(lactic(lactic fermentation fermentation，fermentation of lactic acid)fermentation of lactic acid)。与乙醇发酵同为生物与乙醇发酵同为生物体内二种主要的发酵形式。体内二种主要的发酵形式。在动物组织中，在动物组织中，除特殊的内脏外，除特殊的内脏外，几乎所有的组织都具有进行这种发酵的性质，此过程称为糖酵几乎所有的组织都具有进行这种发酵的性质，此过程称为糖酵解。解。乳酸细菌乳酸细菌能利用葡萄糖及其他相应的可发酵性糖产生乳酸，能利

2、用葡萄糖及其他相应的可发酵性糖产生乳酸，称为乳酸发酵。称为乳酸发酵。乳酸是重要的天然有机酸乳酸是重要的天然有机酸,一元羧基酸（一元羧基酸（-羟基丙酸）羟基丙酸）.存存在于酸牛奶而得名，产、销量仅次于柠檬酸。在于酸牛奶而得名，产、销量仅次于柠檬酸。17801780年瑞士化学家年瑞士化学家ScheeleScheele首先首先从酸乳中提炼从酸乳中提炼得到乳酸得到乳酸;18571857年年PasteurPasteur在研究在研究乳酸发酵乳酸发酵过程中发现了乳酸菌过程中发现了乳酸菌;18781878年年J.ListerJ.Lister从从酸败的牛乳酸败的牛乳中分离了乳酸菌中分离了乳酸菌,命名为乳命名为乳

3、杆菌杆菌;自然发酵自然发酵乳酸是乳酸是19411941年由年由BoutronBoutron和和FremyFremy发现的发现的;纯种发酵纯种发酵工业化生产乳酸是工业化生产乳酸是19811981由美国由美国Charles EaveyyCharles Eaveyy开始开始,荷兰的荷兰的PuracPurac公司和美国的公司和美国的ADMADM公司是世界上较大公司是世界上较大的乳酸生产企业。的乳酸生产企业。中国有数十年乳酸生产历史中国有数十年乳酸生产历史,安徽丰源生化公司安徽丰源生化公司(2002(2002年年建立建立)最大最大,设计年产设计年产3 3万吨。万吨。H H CH CH3 3-C-COOH

4、-C-COOH OH OH 分子式分子式C C3 3H H6 6O O3 3,分子量为分子量为90.0890.08，结构中含有不对，结构中含有不对称碳原子，具有旋光性称碳原子，具有旋光性.分子带有分子带有(-OH)(-OH)和羧基和羧基(-(-COOH)COOH)两个官能团两个官能团,是自然界中存在最广泛的一种羟是自然界中存在最广泛的一种羟基羧酸。基羧酸。粘稠状液体，无色，澄明，微具黄色，无嗅，味粘稠状液体，无色，澄明，微具黄色，无嗅，味微酸，有较强吸湿性，可以与水、酒精和乙醚以任微酸，有较强吸湿性，可以与水、酒精和乙醚以任意比例混合。意比例混合。l乳酸经乳酸经氧化氧化可形成丙酮酸、乙醛、乙酸

5、可形成丙酮酸、乙醛、乙酸和二氧化碳和二氧化碳.l乳酸可被乳酸可被还原还原为丙酸为丙酸,丙二醇丙二醇(不饱和聚酯、不饱和聚酯、环氧树脂、聚氨酯树脂的重要原料环氧树脂、聚氨酯树脂的重要原料 )l乳酸乳酸缩合缩合反应生成线性聚脂反应生成线性聚脂-聚乳酸聚乳酸.l乳酸乳酸酯化酯化反应为乳酸酯反应为乳酸酯.l乳酸乳酸脱水脱水生成生成丙烯酸丙烯酸(400(400万吨市场容量万吨市场容量/a,/a,絮凝絮凝剂剂,分散剂分散剂,复膜剂复膜剂,油漆油漆,皮革、造纸、纺织粘合剂等皮革、造纸、纺织粘合剂等生产的重要工业原料生产的重要工业原料,1.5,1.5万元万元/吨吨)2.2.乳酸的用途乳酸的用途 作为终端产品作

6、为终端产品 食品饮料食品饮料：酸味剂、调味剂、：酸味剂、调味剂、防腐剂防腐剂;现代医药现代医药：乳酸亚铁铁质食：乳酸亚铁铁质食品添加剂，容易被人体吸收，品添加剂，容易被人体吸收，治疗缺铁性贫血治疗缺铁性贫血;日用化工日用化工:生产染料生产染料,可降解可降解材料等等材料等等;制革制革:鞣革剂鞣革剂;农业农业:植物生长调节剂植物生长调节剂.乳酸链球菌素是由乳酸链球菌产生的一种多肽抗菌素类物质，由34个氨基酸组成。它是一种高效、无毒的天然食品防腐剂。室温下、酸性加热条件下均很稳定。如在pH2.0/121加热30分钟，产品仍很稳定。乳酸链球菌的抗菌谱比较窄，它只能杀死或抑制革兰氏阳性菌，特别是细菌孢子

7、，对阴性菌、酵母菌均无作用。一般10-50ppm即有效。ADI 0-33000IU/Kg(bw)(FAO/WHO,1994)乳酸链球菌是多肽，食用后在消化道中很快被蛋白水解酶分解成氨基酸，不会改变肠道内正常菌群，以及引起常用其他抗菌素所出现的抗药性，更不会与其它抗菌素出现交叉抗性。l化学工业中重要的化学工业中重要的平台原料平台原料l制成制成乳酸盐乳酸盐,乳酸酯乳酸酯;l催化催化生成乙醛生成乙醛,丙二醇丙二醇,丙稀酸丙稀酸,戊二醛等戊二醛等;l更为重要的是更为重要的是用于合成用于合成生物能够降解的新型环生物能够降解的新型环保材料保材料聚乳酸聚乳酸(PLA).(PLA).单个的乳酸分子中有一个羟基

8、和单个的乳酸分子中有一个羟基和一个羧基，多个乳酸分子在一一个羧基，多个乳酸分子在一起，起，-OH与别的分子的与别的分子的-COOH脱水缩合，脱水缩合，-COOH与别的分子与别的分子的的-OH脱水缩合，就这样，它脱水缩合，就这样，它们手拉手形成了聚合物，叫做们手拉手形成了聚合物，叫做聚乳酸。聚乳酸。聚乳酸也称为聚丙交聚乳酸也称为聚丙交酯，属于聚酯家族。聚乳酸是酯，属于聚酯家族。聚乳酸是以乳酸为主要原料聚合得到的以乳酸为主要原料聚合得到的聚合物，原料来源充分而且可聚合物，原料来源充分而且可以再生。聚乳酸的生产过程无以再生。聚乳酸的生产过程无污染，而且产品可以生物降解，污染，而且产品可以生物降解，实

9、现在自然界中的循环，因此实现在自然界中的循环，因此是理想的绿色高分子材料。是理想的绿色高分子材料。1.1.菌种及产酸机理菌种及产酸机理菌种为发酵的基本要素菌种为发酵的基本要素 目前乳酸生产菌种为细菌目前乳酸生产菌种为细菌(乳杆菌为代表乳杆菌为代表,Lactobacilus delbrackiiLactobacilus delbrackii（德氏乳杆菌（德氏乳杆菌)和霉菌和霉菌(以米根霉为代表以米根霉为代表,Rhizopus oryzaeRhizopus oryzae)乳制品、葡萄酒、酸泡菜、酱醪、醋醅中乳制品、葡萄酒、酸泡菜、酱醪、醋醅中 都可分离到乳酸菌都可分离到乳酸菌.l同型乳酸发酵同型乳

10、酸发酵l细菌发酵细菌发酵乳球菌乳球菌(Lactococcus),链球菌链球菌(Streptococcus).片球菌片球菌(Pediococcus)及乳杆菌及乳杆菌(Lactobacilus)的部分。的部分。l同型乳酸发酵乳酸细菌同型乳酸发酵乳酸细菌EMP 由由1 1个个葡萄糖分子产生葡萄糖分子产生2 2个乳酸分子个乳酸分子(理论转化理论转化率率100%)100%)l优势优势:纯度高纯度高;转化率高转化率高;能耗低能耗低(需无菌需无菌空气和搅拌动力都很低空气和搅拌动力都很低)。l缺点缺点:需在培养基中添加有机氮源需在培养基中添加有机氮源,这样这样增加了生产成本和分离纯化难度。增加了生产成本和分离

11、纯化难度。细菌发酵细菌发酵肠膜明肠膜明串株菌串株菌（Leuconostoc mesenteroides）、葡葡聚糖明串珠菌聚糖明串珠菌（L.dextranicum）、双双歧杆菌歧杆菌（Bifidobacterium bifidum）等等6-磷酸葡萄糖酸的途径磷酸葡萄糖酸的途径（磷酸酮解途径）（磷酸酮解途径）:总反应式总反应式:C6H12O6+ADP+Pi CH3CHOHCHOH+CH3COOH+CO2+ATP通过磷酸戊糖途径（通过磷酸戊糖途径（HMP HMP）,1mol,1mol己糖生成己糖生成1mol1mol乙醇、乙醇、lmollmol二氧化碳和二氧化碳和1mol1mol乳酸。乳酸对糖转乳酸

12、。乳酸对糖转化率化率5050。l双歧途径双歧途径（磷酸酮糖途径）（磷酸酮糖途径）双歧发酵是双歧杆菌发酵葡萄糖的一条途径。经双歧发酵是双歧杆菌发酵葡萄糖的一条途径。经HKHK途径途径磷酸己糖解酮酶途径。磷酸己糖解酮酶途径。l发酵总应式为：发酵总应式为：2C 2C6 6H H1212O O6 6 2CH 2CH3 3CHOHCOOH CHOHCOOH+3CH+3CH3 3COOHCOOH此发酵过程中，此发酵过程中，2mol2mol的葡萄糖生成的葡萄糖生成2mol2mol乳酸和乳酸和3mol3mol的乙酸，乳酸转化率理论为的乙酸，乳酸转化率理论为50%50%。米根霉米根霉(Rhizopus oryz

13、ae)(Rhizopus oryzae)是中国是中国药和酒曲中的重要霉菌之一药和酒曲中的重要霉菌之一 。在。在土壤、空气及其他物质上亦常见。土壤、空气及其他物质上亦常见。菌落疏松或稠密，最初白色后变菌落疏松或稠密，最初白色后变为灰褐至黑褐色，匍匐枝爬行，为灰褐至黑褐色，匍匐枝爬行，无色。假根发达，指状或根状分无色。假根发达，指状或根状分枝。囊托楔形，菌丝形成厚垣孢枝。囊托楔形，菌丝形成厚垣孢子，接合孢子未见。发育温度子，接合孢子未见。发育温度30303535，最适温度，最适温度3737，4141亦能生长。亦能生长。能糖化淀粉、转化蔗糖能糖化淀粉、转化蔗糖 ，产生乳酸、，产生乳酸、反丁烯二酸及微

14、量酒精。产反丁烯二酸及微量酒精。产L(+)L(+)乳酸能力强，达乳酸能力强，达70%70%左右。左右。l米根霉发酵米根霉发酵l发酵总应式为：发酵总应式为：2C2C6 6H H1212O O6 6 3CH 3CH3 3CHOHCOOH CHOHCOOH+C+C2 2H H5 5OH+COOH+CO2 2 由由2 2个葡萄糖分子产生个葡萄糖分子产生3 3个乳酸分个乳酸分子子(理论转化率理论转化率75%)75%)l 缺点缺点:好氧发酵好氧发酵,能耗大能耗大;l 传递限制传递限制,反应效率低反应效率低;l 转化率低转化率低,杂酸难去除杂酸难去除.l 优点优点:有淀粉酶有淀粉酶,能直接利用淀粉能直接利用

15、淀粉;l 培养基简单培养基简单,无机氮无机氮;l 单一的光学异构体单一的光学异构体,L-,L-乳酸乳酸.GLUGLU：葡萄糖，：葡萄糖，PYRPYR：丙酮酸，：丙酮酸，LACLAC：乳酸，：乳酸，MALMAL：苹果酸，：苹果酸，FUMFUM：富马酸，：富马酸，Ac-CAc-CO OA A：乙酰辅酶：乙酰辅酶A ATCATCA：三羧酸循环，：三羧酸循环，EMPEMP：糖酵解途径，：糖酵解途径，a a：乳酸脱氢酶，：乳酸脱氢酶，b b：丙酮酸脱氢酶、：丙酮酸脱氢酶、乙醇脱氢酶，乙醇脱氢酶，c c：丙酮酸脱氢酶，：丙酮酸脱氢酶，d d：丙酮酸激酶：丙酮酸激酶l利用聚氨酯泡沫为载体固定化米根霉生产乳酸

16、的新工艺。确定了固定化细胞发酵条件：葡萄糖浓度为50gl，载体立方体边长为mm，载体量为20cm70ml培养基，固定化细胞制备培养时间为24利用固定化细胞发酵产酸速率是游离菌的倍以上，对糖转化率达77.70，与理论转化率相近。该固定化细胞应用在反复间歇发酵中可稳定10批次以上。2.2.菌种选育菌种选育-优良菌种选育为工艺技术的核心优良菌种选育为工艺技术的核心 自然选育自然选育自然界是生产菌种的最大来源自然界是生产菌种的最大来源,从自然界中筛从自然界中筛选乳酸生产菌种有着悠久的历史选乳酸生产菌种有着悠久的历史.Berry,Berry,1999;1999;王轶雄王轶雄,2005;,2005;李海军

17、李海军,2007.,2007.培养条件对鼠李培养条件对鼠李糖乳杆菌糖乳杆菌(Lactobacillus rhamnosusLactobacillus rhamnosus)产生乳酸的影响产生乳酸的影响.CarlsonCarlson,1999.,1999.从玉米浸渍水分到耐酸从玉米浸渍水分到耐酸(pH3.83)(pH3.83)菌菌4141号号,产乳产乳酸近酸近100g/L.100g/L.PayotPayot,1999.,1999.分离到能在分离到能在5252生长的生长的TB/04.TB/04.赵博赵博,2005.2005.筛选到在筛选到在2L2L罐用葡萄糖发酵罐用葡萄糖发酵120h120h使使L-

18、L-乳酸浓度乳酸浓度达到达到202g/L202g/L的高产乳杆菌的高产乳杆菌,转化率转化率91.3%,L-91.3%,L-乳酸占总酸的乳酸占总酸的98%.98%.菌种改良菌种改良经典技术经典技术 DemirciDemirci,1992.,1992.处理德氏乳杆菌处理德氏乳杆菌ATCC9649;ATCC9649;刘勇军刘勇军,2003.LB1;2003.LB1;郑艳郑艳,2004.2004.处理干酪乳杆菌处理干酪乳杆菌R2;R2;Kadam,Kadam,2006.2006.德氏乳杆菌德氏乳杆菌NCM2365;NCM2365;仇俊鹏仇俊鹏,2007.2007.嗜热乳杆菌嗜热乳杆菌ATCC8317.

19、ATCC8317.菌种改良菌种改良现代技术现代技术 Picataggio,Picataggio,1997.1997.把把植物乳杆菌植物乳杆菌中能同化木质纤中能同化木质纤维素构造中木糖组分所需的维素构造中木糖组分所需的木糖异构酶木糖异构酶和和木酮糖激酶木酮糖激酶基因转入能同型发酵基因转入能同型发酵L-L-阿拉伯糖和阿拉伯糖和D-D-核糖为乳酸的一核糖为乳酸的一株株乳杆菌乳杆菌中中.Kyla-Nikkila Kyla-Nikkila,2000.,2000.瑞士乳杆菌瑞士乳杆菌CNRZ32CNRZ32的的ldhDldhD基因失活基因失活,构建没有构建没有D-LDHD-LDH酶活力的工程菌酶活力的工程

20、菌,结果只产生单一结果只产生单一L L构型的构型的L-L-乳酸乳酸.Dien,Dien,2001.2001.构建了能利用混合己糖和戊糖构建了能利用混合己糖和戊糖生产生产L-L-乳酸的重组大肠杆菌乳酸的重组大肠杆菌.l Parro,Parro,1999.1999.把牛的把牛的L-LDHL-LDH的基因引入乳酸的基因引入乳酸克鲁维酵母中克鲁维酵母中,工程酵母转化率为工程酵母转化率为1.19mol1.19mol乳酸乳酸/mol/mol削耗的葡萄糖削耗的葡萄糖.l 张黎张黎,2005.,2005.克隆了牛链球菌克隆了牛链球菌L-LDHL-LDH基因基因.3.3.主要生产原料主要生产原料 乳酸发酵是生长

21、和发酵同步进行的生长耦乳酸发酵是生长和发酵同步进行的生长耦联型联型,整个发酵过程贯穿着对营养物的要求整个发酵过程贯穿着对营养物的要求,故故氮源需求量大。以淀粉为主的培养基氮源需求量大。以淀粉为主的培养基,氮源举氮源举足轻重。足轻重。未加工的粗原料未加工的粗原料 玉米、木薯、大米玉米、木薯、大米;-非粮薯类非粮薯类:木薯、甘薯、马铃薯木薯、甘薯、马铃薯;-桔杆、玉米芯、废旧报纸、木屑、乳清。桔杆、玉米芯、废旧报纸、木屑、乳清。淀粉淀粉 玉米、木薯、马铃薯的淀粉玉米、木薯、马铃薯的淀粉 糖液糖液淀粉水解糖淀粉水解糖,优点为发酵液洁净优点为发酵液洁净,发酵结束后发酵结束后残余物质少残余物质少,十分有

22、利于乳酸的提取与精制十分有利于乳酸的提取与精制.l l4.4.营养物营养物l 乳酸细菌乳酸细菌专性异养微生物专性异养微生物,自身不能合成自身不能合成必需的生长因子。必需的生长因子。l 含氮营养物常用酵母膏、蛋白胨等含氮营养物常用酵母膏、蛋白胨等;l 酵母膏酵母膏替代物替代物是玉米浆是玉米浆;l 蛋白胨蛋白胨替代物替代物是大豆粉的酶水解物是大豆粉的酶水解物大豆大豆蛋白胨。蛋白胨。l l5.5.乳酸发酵的常用工艺乳酸发酵的常用工艺l 分批发酵工艺分批发酵工艺l 是目前或相当一段时间内发酵乳酸的是目前或相当一段时间内发酵乳酸的最主要工艺最主要工艺.在欧洲一直使用分批发酵工在欧洲一直使用分批发酵工艺生

23、产乳酸艺生产乳酸;在美国已使用了在美国已使用了6060年之久年之久;在国内一直采用这一工艺。在国内一直采用这一工艺。l 细菌发酵工艺细菌发酵工艺l 国内均采用德氏乳杆菌生产国内均采用德氏乳杆菌生产DL-DL-乳乳酸酸,其优点是能大规模降低能耗。其优点是能大规模降低能耗。l玉米淀粉玉米淀粉高压喷射液化与糖化高压喷射液化与糖化,糖化液糖化液板板框过滤框过滤,清糖液清糖液发酵罐发酵罐调糖调糖10%,10%,添添10%10%米糠米糠,冷至冷至50 50 接种接种,接种量为接种量为10%10%4h 4h后后,用石用石灰粉调灰粉调pH4.8 pH4.8 加碳酸钙加碳酸钙,继续发酵继续发酵整个过整个过程控温

24、程控温50 ,pH4.-5.5,50 ,pH4.-5.5,每每2h2h搅拌一次搅拌一次,每次每次5-10min 5-10min 发酵周期发酵周期55-75h,55-75h,转化率不低于转化率不低于90%.90%.l混合菌种工艺混合菌种工艺l 大麦粉浓度大麦粉浓度180g/L,180g/L,大麦芽大麦芽0.80.8%(培养培养基不添加任何氮源、维生素和无机盐等营养基不添加任何氮源、维生素和无机盐等营养)接种接种食淀粉乳杆菌食淀粉乳杆菌和和不产生淀粉酶的不产生淀粉酶的干酪乳杆菌干酪乳杆菌混合发酵混合发酵37 48h 37 48h 乳酸乳酸浓度达浓度达36g/L,36g/L,比单独提高比单独提高20

25、%.20%.若发酵的若发酵的同时加入糖化酶同时加入糖化酶,转化率可提高转化率可提高1 1倍左右。倍左右。l米根霉工艺米根霉工艺l 米根霉能把米根霉能把葡萄糖葡萄糖转化为乳酸转化为乳酸,亦能把亦能把淀淀粉粉转化为乳酸。转化为乳酸。l 乳酸发酵的效率受菌丝体形状的影响很大乳酸发酵的效率受菌丝体形状的影响很大,近来近来,采用菌丝采用菌丝菌球体菌球体(pellets)(pellets)进行生产进行生产,菌菌球体可反复使用球体可反复使用;采用气升式发酵罐。采用气升式发酵罐。l 一个发酵周期结束一个发酵周期结束,停止通气停止通气,菌球体即沉菌球体即沉淀淀,放掉发酵液放掉发酵液,并加入新鲜培养基并加入新鲜培

26、养基,即可进行即可进行第二轮发酵第二轮发酵.可连续进行可连续进行9 9个周期。个周期。l 连续发酵工艺连续发酵工艺l 连续搅拌罐反应器连续搅拌罐反应器;葡萄糖葡萄糖;德氏乳德氏乳杆菌。杆菌。l 在稀释率在稀释率D D为为0.35-0.4h0.35-0.4h-1-1,最大乳酸产最大乳酸产率为率为8.93g/(L8.93g/(L h),h),最大生物量产率为最大生物量产率为1.40g/(L1.40g/(L h).h).l 半连续发酵工艺半连续发酵工艺l 分割出一部分发酵液作为下一批发酵分割出一部分发酵液作为下一批发酵的种子的种子.在一定次数的周期中在一定次数的周期中,接种量越接种量越大产率越高大产

27、率越高.40%-50%.40%-50%接种量接种量,及及5-95-9次发次发酵周期酵周期,乳酸的产率可达乳酸的产率可达5g/(Lh).5g/(Lh).6.6.工艺控制工艺控制 中和剂选择和中和剂选择和pHpH控制控制 pHpH宜取的范围为宜取的范围为5-75-7(降到降到4.54.5以下以下,细菌停止生长细菌停止生长).).目前目前,所用的所用的中和剂中和剂主要是碳酸钙主要是碳酸钙,其次有液氨、其次有液氨、氢氧化钠、氧化钙等。氢氧化钠、氧化钙等。乳酸钙乳酸钙和硫酸进行酸解反应和硫酸进行酸解反应,得到粗乳酸得到粗乳酸.这是这是最常用最经济的方法最常用最经济的方法,缺点是生成大量硫酸钙缺点是生成大

28、量硫酸钙.乳酸铵或乳酸钠乳酸铵或乳酸钠经微滤膜过滤经微滤膜过滤,再经电渗析再经电渗析,离离交树脂和双极电渗析膜分离出乳酸交树脂和双极电渗析膜分离出乳酸,缺点是生缺点是生产成本高产成本高(电和膜电和膜)。l发酵温度控制发酵温度控制l 不同菌种发酵温度不同不同菌种发酵温度不同.分常温分常温(35-37),(35-37),中温中温(40-45),(40-45),高温高温(大于大于50).50).l 选择高温发酵有利于降低能耗和在一定程选择高温发酵有利于降低能耗和在一定程度上降低杂菌污染度上降低杂菌污染.l通气和搅拌通气和搅拌l 微氧乳酸发酵需少量通气和搅拌微氧乳酸发酵需少量通气和搅拌,一定保证一定保

29、证发酵罐内菌体、物料、温度、发酵罐内菌体、物料、温度、pH pH、溶解氧的、溶解氧的均匀分布均匀分布.l初糖浓度初糖浓度l 在菌种能力范围内在菌种能力范围内,初糖浓度越高初糖浓度越高,产产酸越高酸越高;l 补糖补糖;l SSF SSF。l菌体生长的控制菌体生长的控制生长耦联型生长耦联型,边生长边生长边产酸边产酸.把生长控制在合适的范围内把生长控制在合适的范围内,有有利于维持高产酸速率时间。利于维持高产酸速率时间。1.1.电渗析发酵法工艺电渗析发酵法工艺（乳酸根被阳极吸引）（乳酸根被阳极吸引）l 电渗析发酵电渗析发酵(electrodialysis fermentation,EDF)(elect

30、rodialysis fermentation,EDF)系统系统:主要有发酵罐、电渗析装置、主要有发酵罐、电渗析装置、pHpH控制装置、直流电源、控制装置、直流电源、微孔过滤装置、浓缩液储存罐、循环泵等组成微孔过滤装置、浓缩液储存罐、循环泵等组成.l 发酵与电渗析分离耦合的工艺发酵与电渗析分离耦合的工艺,优点是优点是:l 在线分离在线分离,有效消除产物抑制有效消除产物抑制;避免添加中避免添加中和剂和剂,使精制容易使精制容易,缩短了发酵周期缩短了发酵周期;无污染无污染,过程过程简单简单,消耗工业原料少消耗工业原料少,易于实现自动化连续操作。易于实现自动化连续操作。l2.2.萃取发酵法萃取发酵法l

31、 是根据是根据一种溶质一种溶质在在两种互不相溶的液相溶剂两种互不相溶的液相溶剂中中的的溶解度不同溶解度不同而进行的分离方法。而进行的分离方法。l 乳酸萃取发酵是利用乳酸萃取发酵是利用有机溶剂有机溶剂（叔胺（叔胺Alamine336Alamine336和油醇混合物）在线连续移去发酵产物和油醇混合物）在线连续移去发酵产物乳酸乳酸,以达到降低乳酸抑制作用的目的技术。以达到降低乳酸抑制作用的目的技术。l萃取发酵能耗低萃取发酵能耗低,选择性好。选择性好。l3.3.膜循环发酵法膜循环发酵法(membrance recycle fermentation,MRF)(membrance recycle ferm

32、entation,MRF)工艺工艺l 这是一种连续发酵工艺这是一种连续发酵工艺.把连续搅拌罐反应器把连续搅拌罐反应器与细胞循环膜组件相耦合与细胞循环膜组件相耦合.通过膜组件除去发酵液通过膜组件除去发酵液中的乳酸中的乳酸,消除产物的抑制作用消除产物的抑制作用,提高乳酸产率提高乳酸产率.4.4.同时糖化发酵工艺同时糖化发酵工艺 同时糖化发酵同时糖化发酵(simultaneous saccharification(simultaneous saccharification fermentation,SSF)fermentation,SSF)工艺简化了单独用糖化酶糖化淀粉工艺简化了单独用糖化酶糖化淀粉

33、的工序的工序,把糖化与乳酸发酵结合起来把糖化与乳酸发酵结合起来,在液化后加糖在液化后加糖化酶的同时就进行乳酸发酵化酶的同时就进行乳酸发酵,从而节省整个工艺时从而节省整个工艺时间间,节约了设备投资节约了设备投资,降低了运行成本。另一好处是降低了运行成本。另一好处是避免了初糖浓度过高造成的对发酵的抑制作用。避免了初糖浓度过高造成的对发酵的抑制作用。SSF SSF还常用于廉价的纤维素原料。还常用于廉价的纤维素原料。米根霉米根霉、食淀粉乳杆菌食淀粉乳杆菌本身产生糖化酶本身产生糖化酶,能同时能同时糖化发酵生产乳酸。糖化发酵生产乳酸。l 随着基因工程理论的不断成熟发展，分子生物随着基因工程理论的不断成熟发

34、展，分子生物l学技术在学技术在D一乳酸生产领域的应用也逐渐受到关注，一乳酸生产领域的应用也逐渐受到关注，利用基因工程手段对菌株进行定向改造，减少了工利用基因工程手段对菌株进行定向改造，减少了工程菌筛选的时间，提高了筛选效率。程菌筛选的时间，提高了筛选效率。l 目前研究的重点主要集中在乳酸生产菌的目前研究的重点主要集中在乳酸生产菌的D-乳乳酸脱氢酶酸脱氢酶和和L-乳酸脱氢酶乳酸脱氢酶的编码基因的编码基因(ldhD和和ldhL)上。另外还有研究人员对上。另外还有研究人员对丙酮酸甲酸裂解酶丙酮酸甲酸裂解酶的编码的编码基因基因(pfl)和和丙酮酸脱羧酶丙酮酸脱羧酶基因基因(pdc)进行敲除，从进行敲除

35、，从l而提高乳酸支路的通量。而提高乳酸支路的通量。l 应用基因敲除技术敲除旁路代谢途径中应用基因敲除技术敲除旁路代谢途径中的的关键酶关键酶基因，能够有效地基因，能够有效地抑制副产物抑制副产物的出的出现，提高乳酸支路的通量，同时敲除现，提高乳酸支路的通量，同时敲除ldhL，最终能够得到高最终能够得到高光学纯度光学纯度的的D-乳酸工程菌。乳酸工程菌。进一步在进一步在基因敲除基因敲除的基础上，通过的基础上，通过导入外源导入外源性基因性基因，使菌株的，使菌株的生产原料生产原料由葡萄糖和果糖由葡萄糖和果糖等单糖原料逐步向淀粉和纤维素等多糖原料等单糖原料逐步向淀粉和纤维素等多糖原料l转变。转变。l 当前基

36、因工程改造菌株产当前基因工程改造菌株产D一乳酸主要集一乳酸主要集中在乳酸菌、大肠杆菌、酵母菌中。中在乳酸菌、大肠杆菌、酵母菌中。l 在乳酸菌中，大部分丙酮酸都在乳酸脱氢酶的催化下形在乳酸菌中，大部分丙酮酸都在乳酸脱氢酶的催化下形成其特有的代谢终产物成其特有的代谢终产物乳酸。但是，不同的乳酸菌在不同乳酸。但是，不同的乳酸菌在不同的外界条件下，还会把一部分丙酮酸作为新的起点，通过不的外界条件下，还会把一部分丙酮酸作为新的起点，通过不同的生化反应途径产生各种代谢产物。通过同的生化反应途径产生各种代谢产物。通过对对非主要代谢通非主要代谢通路中关键酶基因路中关键酶基因的的敲除敲除，实现高光学纯度，实现高

37、光学纯度D一乳酸的生产。一乳酸的生产。植物乳杆菌植物乳杆菌(Lactobacillus plantarum)通过异构酶通过异构酶L-(+)-乳酸乳酸脱氢酶和脱氢酶和D-(-)-乳酸脱氢酶来催化丙酮酸分别生成乳酸脱氢酶来催化丙酮酸分别生成L-乳酸和乳酸和D-乳酸。乳酸。l Thierry F等对等对L plantarum DG30进行基因改造，进行基因改造，首先首先过表达过表达菌株中菌株中ldhL，使，使Lplantarum中中L-(+)乳乳酸脱氢酶的活性增长了酸脱氢酶的活性增长了13倍，但是这种方法并没有倍，但是这种方法并没有使使L.plantarum的乳酸产量带来明显提高。接着在此的乳酸产量

38、带来明显提高。接着在此基础上通过基础上通过双交换的方法敲除双交换的方法敲除了了ldhL，使得，使得Lplantarum只产生只产生D-乳酸，但最终的乳酸产量也乳酸，但最终的乳酸产量也没有显著提高。没有显著提高。l D-乳酸生产高成本一个主要的原因就是乳酸生产高成本一个主要的原因就是原材料原材料成本高，原材料的预处理成为高效生产的一个瓶颈成本高，原材料的预处理成为高效生产的一个瓶颈问题，目前问题，目前淀粉淀粉是最有望成为乳酸发酵中降低原料是最有望成为乳酸发酵中降低原料成本的物质。大多数乳酸菌不具有直接利用淀粉类成本的物质。大多数乳酸菌不具有直接利用淀粉类物质的能力，所以一般情况下需要把淀粉预处理

39、，物质的能力，所以一般情况下需要把淀粉预处理，比如用比如用-淀粉酶水解淀粉。淀粉酶水解淀粉。l 2009年年Okano等敲除了等敲除了L.plantarum NCIMB 8826的的ldhL，并将，并将Streptococcus bovis 148(AmyA)-淀粉酶基因导入到菌株中，改造后淀粉酶基因导入到菌株中，改造后的的Lplantarum IdhLlpCUSA菌株菌株D-乳酸产乳酸产量达到量达到73.2 gL，得率为，得率为0.85 g(乳酸乳酸)g(淀粉淀粉)，并且光学纯度达并且光学纯度达99.6。l 2009年年Lu等以小麦麸皮为氮源、酵母提取物为等以小麦麸皮为氮源、酵母提取物为生长

40、因子，利用糖化后糙米作为碳源，生产生长因子，利用糖化后糙米作为碳源，生产D-乳酸，乳酸，D-乳酸的产量达乳酸的产量达908 gL，得率达，得率达073 g(乳酸乳酸)g(糙米糙米)。这些研究使得从淀粉生产高光学纯度。这些研究使得从淀粉生产高光学纯度的的D一乳酸变得可行。一乳酸变得可行。l 纤维素与淀粉同样为多糖，而且纤维素在世界上含量最为丰富，充分利用纤维素作碳源，可以大大降低菌株产D-乳酸的原料成本，使D-乳酸的生产具有更高的商业价值。2007年前没有利用纤维素为碳源生产乳酸的报道，而要使D-乳酸生产菌能够利用纤维素作为碳源，可以利用的方法是通过基因工程导入外源基因并成功表达，构建完成的工程

41、菌利用外源酶水解纤维素的产物为底物来生产D-乳酸。l 2009年年Okano等将等将Clostridium thermocellum菌株的菌株的葡聚糖内切酶葡聚糖内切酶(EG)基因导入到已经敲除基因导入到已经敲除ldhL的的L.plantarum中并表达，达到了中并表达，达到了直接利用纤维五糖和直接利用纤维五糖和纤维六糖纤维六糖生产生产D-乳酸的目的。乳酸的目的。D-乳酸的得率达乳酸的得率达063 g(乳酸乳酸)g(纤维五碳糖或六碳糖纤维五碳糖或六碳糖)。l 在已构建的菌株基础上将在已构建的菌株基础上将Aspergillus aculeatus中的中的葡聚糖外切酶葡聚糖外切酶(BGL)基因导人

42、，改造后的菌株基因导人，改造后的菌株L.pantarum AldhLlpCUCelA能够能够利用利用-葡聚葡聚糖糖生产生产D-乳酸，产量达乳酸，产量达1.47 gL。上面的研究实。上面的研究实现了工程菌直接利用纤维素生产现了工程菌直接利用纤维素生产D-乳酸的目标。乳酸的目标。l 在植物组织中，除纤维素外还有大量的在植物组织中，除纤维素外还有大量的半纤维素半纤维素，能利，能利用这些物质成为基因改造乳酸菌的目标。半纤维素降解后，用这些物质成为基因改造乳酸菌的目标。半纤维素降解后，大部分物质为大部分物质为木糖和阿拉伯糖木糖和阿拉伯糖，乳酸菌是不能直接利用木糖乳酸菌是不能直接利用木糖和阿拉伯糖作为碳源

43、的和阿拉伯糖作为碳源的，因此有研究将催化，因此有研究将催化木糖到木糖到5-5-磷酸酮磷酸酮糖与阿拉伯糖到糖与阿拉伯糖到5-5-磷酸酮糖磷酸酮糖的基因的基因导入导入到能够进行同型发酵到能够进行同型发酵的乳酸菌中生成的乳酸菌中生成D-D-乳酸。采用这种方法，乳酸。采用这种方法，l moll mol的的5-5-磷酸木磷酸木酮糖通过磷酸转酮酶途径转化为酮糖通过磷酸转酮酶途径转化为1 mol1 mol的乳酸，造成了碳源的乳酸，造成了碳源的浪费。的浪费。l 为了解决这一问题，为了解决这一问题，OkanoOkano等用来自于等用来自于L.lactisL.lactis1L14031L1403的的转酮酶转酮酶基

44、因基因(tkt)(tkt)替换了替换了L.plantarum 1ldhLl 1ldhLl中的中的磷酸转磷酸转酮酶酮酶基因基因(xpkl)(xpkl)，构建的菌株，构建的菌株L Lplantarum plantarum ldhLlldhLl一一xpk11xpk11：tkt tkt能够能够利用利用阿拉伯糖阿拉伯糖生产生产D-D-乳酸，乳酸，D-D-乳酸的产乳酸的产量达量达38386 g6 gL L，对阿拉伯糖的得率为，对阿拉伯糖的得率为0 08282，D-D-乳酸的光乳酸的光学纯度为学纯度为99999 9，并且发酵过程中乙酸的产量仅为，并且发酵过程中乙酸的产量仅为0 04 g4 gL L，这一研究

45、，这一研究解决了利用解决了利用阿拉伯糖阿拉伯糖作碳源时的同型乳酸发作碳源时的同型乳酸发酵的问题酵的问题。l 为了解决为了解决利用木糖利用木糖同型发酵生产同型发酵生产D-D-乳酸乳酸的问的问题，题，Okano等将来自于菌株等将来自于菌株Lpentosus NRIC 1069的的木糖异构酶木糖异构酶基因基因(xyU)和和木酮糖木酮糖激酶激酶基因基因(xylB)导人导人Lplantarum ldhLl-xok1：tkt菌株中，改造后的菌株菌株中，改造后的菌株D-乳酸产乳酸产量达量达412 gL，转化率达，转化率达089，D-乳酸的乳酸的光学纯度达光学纯度达992，这一研究实现了以，这一研究实现了以木

46、糖木糖为原料进行同型乳酸的发酵生产。为原料进行同型乳酸的发酵生产。已经发现有些乳酸菌能够利用已经发现有些乳酸菌能够利用寡聚木糖寡聚木糖作为作为碳源，将降解寡聚木糖的关键酶基因导入同碳源，将降解寡聚木糖的关键酶基因导入同型发酵的乳酸菌株中，可能会实现利用半纤型发酵的乳酸菌株中，可能会实现利用半纤维素为原料进行同型乳酸发酵的愿望。维素为原料进行同型乳酸发酵的愿望。4.2 大肠杆菌大肠杆菌(Escherichia coli)(Escherichia coli)的基因工程改的基因工程改造造l 大肠杆菌能够以相对简单的原料实现大肠杆菌能够以相对简单的原料实现D-乳酸乳酸的生产，并且其作为基因工程模式菌株

47、相对于其的生产，并且其作为基因工程模式菌株相对于其他菌株来说具有易实现基因操作的优点。但大肠他菌株来说具有易实现基因操作的优点。但大肠杆菌的乳酸产量以及终产物中乳酸的量都不及乳杆菌的乳酸产量以及终产物中乳酸的量都不及乳酸菌，酸菌，原因就在于原因就在于大肠杆菌在发酵生产乳酸的同大肠杆菌在发酵生产乳酸的同时产生的是有机酸混合物以及乙醇等时产生的是有机酸混合物以及乙醇等非酸类物质非酸类物质。l 通过基因工程可以改造大肠杆菌的代谢网络，通过基因工程可以改造大肠杆菌的代谢网络，增加乳酸途径中的代谢通量，抑制大肠杆菌中其增加乳酸途径中的代谢通量，抑制大肠杆菌中其余产酸、醇途径，达到提高乳酸产量之目的。余产

48、酸、醇途径，达到提高乳酸产量之目的。l 先前的研究已经表明，可以通过改造先前的研究已经表明，可以通过改造E Ecolicoli来生产来生产L-L-乳酸和乳酸和D-D-乳酸。乳酸。l 文献报道产乳酸最好的大肠杆菌菌株为文献报道产乳酸最好的大肠杆菌菌株为JP203JP203碳基培养葡萄糖转化率为碳基培养葡萄糖转化率为70708080。l ZhouZhou等等敲除敲除了了E EcoliW3110coliW3110中中延胡索酸还原延胡索酸还原酶酶(frdABCD)(frdABCD)和和丙酮酸甲基裂解酶丙酮酸甲基裂解酶的基因的基因(pflB)(pflB)，抑制了丙酮酸代谢途径中除产乳酸代谢以外的抑制了丙

49、酮酸代谢途径中除产乳酸代谢以外的途径，构建了一菌株途径，构建了一菌株SZ58SZ58，改造后的菌株，改造后的菌株D-D-乳乳酸的产量达酸的产量达51.8g/L51.8g/L，光学纯度和得率分别达，光学纯度和得率分别达9999和和0.990.99。为了进一步降低乙醇和乙酸等副产。为了进一步降低乙醇和乙酸等副产物的生成，该研究在此基础上物的生成，该研究在此基础上失活失活了了乙酸激酶乙酸激酶基因基因(ackA)(ackA)和和乙醇脱氢酶乙醇脱氢酶基因基因(adhE)(adhE)，构建了，构建了一株产纯一株产纯D-D-乳酸的菌株乳酸的菌株SZ63SZ63。l改造后的菌株不但消除了乙醇和乙酸的合改造后的

50、菌株不但消除了乙醇和乙酸的合成，而且将菌株的发酵时间缩短到成，而且将菌株的发酵时间缩短到168 h，D-乳酸的产量达乳酸的产量达46.8 gL。l 大肠杆菌大肠杆菌可直接利用己糖和戊糖可直接利用己糖和戊糖作为作为碳源，这就免去了后续为利用戊糖而进行碳源，这就免去了后续为利用戊糖而进行的菌株改造，但是菌株对酸的的菌株改造，但是菌株对酸的耐受性差耐受性差，生产率较乳酸菌低，致使大肠杆菌在实际生产率较乳酸菌低，致使大肠杆菌在实际应用当中受到限制。应用当中受到限制。l 酵母菌酵母菌对酸有很好的耐受性对酸有很好的耐受性，使得通过酵母，使得通过酵母菌发酵产生乳酸成为可能。菌发酵产生乳酸成为可能。在厌氧发酵