动物疫病监测诊断基础理论知识与方法原理课件.ppt

1、 论知识和方法原理论知识和方法原理 临床症状 病理变化 触片染色镜检 培养特性 生化特性 血清学试验 初步诊断 动物回归试验 确诊确诊 流行病学调查 细菌感染的诊断 病毒感染的诊断 电镜技术 血清学试验 分子生物学技术 病毒的分离鉴定 标本采集与送检 病毒的分离病毒的分离 动物接种 是最原始的病毒培养方法，根据病毒种类不同，选择敏感动物及适宜接种部位，如嗜 神经性病毒（狂犬病毒）可接种于小鼠脑内，痘病毒可接种于家兔角膜或皮内。鸡胚培养 鸡胚对多种病毒敏感。一般采用孵化9-14天的鸡胚，根据病毒种类不同，将病毒标本接种于鸡胚的不同部位，最常用的鸡胚接种部位有羊膜腔、尿囊腔、绒毛尿囊膜和卵黄囊等。

2、病毒的分离病毒的分离 组织培养法或细胞培养法 是将离体活组织块或分散的组织细胞加以培养的技术总称，为病毒分离鉴定中的最常用的基本方法。病毒的分离病毒的分离 形态学检查形态学检查 电镜和免疫电镜检查 普通光学显微镜检查 有些病毒在宿主细胞内增殖后，在细胞 的一定部位(胞核、胞浆或两者兼有)出现一个或数个、圆形或椭圆形、嗜酸性或嗜碱性的结构，即包涵体。包涵体对病毒感染的诊断有一定价值。病毒感染的血清学诊断病毒感染的血清学诊断 是用已知病毒抗原来检测病畜血清中有无相应抗体，故须待病畜感染后体内产生抗体时才能检出。在采取临床标本及病人血清应注意病程，必须采取患畜急性期血清与恢复期血清(双份血清)进行血

3、清学试验。若第二次血清抗体滴度比第一次高出4倍以上时，才有诊断意义。?现代免疫的概念：是机体识别“自身”与“非己”抗原，对“非己”抗原产生排斥作用，对自身抗原形成天然耐受的一种生理功能。免疫的定义免疫的定义 免疫的基本特性 1 识别自身和非自身 这是免疫应答的基础?免疫细胞膜表面的抗原受体+外来抗原的表位?识别很精细，包括异种之间，同种不同个体之间 2 特异性?即免疫具有很强的针对性 3 免疫记忆?对相同抗原物质的再次进入具有记忆，会产生更快、更强的免疫应答。免疫的基本功能 1.抵抗感染?指动物机体抵御病原微生物感染和侵袭的能力。?免疫功能亢进 变态反应?免疫功能低下或缺陷 机会感染 2.自身

4、稳定?清除机体产生的大量衰老死亡细胞?功能异常 自身免疫病 3.免疫监视?肿瘤细胞的发现和清除?功能低下或失调 肿瘤发生 免疫的类型免疫的类型 一、固有免疫：概念：出生时即有的天然免疫，经遗传获得，非特 异性，也称非特异性/先天性免疫。组成：屏障结构、吞噬细胞、某些体液因子。二、适应性免疫：概念：出生后接触特定抗原获得的针对该物质 的免疫，也称获得性/特异性免疫。包括：体液免疫、细胞免疫。抗原抗原?抗原（Antigen，Ag）：是指进入动物机体后，能刺激机体产生特异性免疫球蛋白或致敏淋巴细胞，并能与其发生特异性反应的物质，也就是说具有抗原性的物质称抗原。抗原性包括两个方面：1.免疫原性：能刺激

5、机体产生抗体或致敏淋巴细胞的特性。2.反应原性：能与由其所诱导产生的抗体或致敏淋巴细胞发生反应的特性。?免疫球蛋白：是指具有抗体活性或化学结构与抗体相似的球蛋白。?抗体：当动物机体受到抗原物质刺激后，由B淋巴细胞转化为浆细胞产生的能与相应抗原发生特异性结合反应的免疫球蛋白。抗抗 体体?IgG多为单体，占血清免疫球蛋白总量的75%80%?IgG1、IgG2和IgG3的CH2能通过经典途径激活补体?IgG是唯一能通过胎盘的抗体?通过Fc段与吞噬细胞表面FcR结合，发挥调理作用；与K细胞结合，发挥ADCC作用；与葡萄球菌A蛋白结合。?具有抗菌、抗毒和抗病毒作用?参与II、III型超敏反应 IgG?为

6、五聚体，是分子量最大的Ig。?IgM激活补体能力比IgG强。?IgM是抗原刺激后出现最早的抗体，故检测IgM水平可用于传染病的早期诊断。?IgM是B细胞抗原受体的主要成分。?也可参与II、III型超敏反应。IgM?分为血清型和分泌型两种，血清型 IgA主要由肠系膜淋巴组织中的浆细胞产生。而分泌型 IgA(SIgA)是由呼吸道、消化道、泌尿生殖道等处的固有层中浆细胞产生。?主要存在于初乳、唾液、泪液，以及呼吸道消化道和泌尿生殖道黏膜表面的分泌液中。?分泌型IgA的合成和主要作用部位在黏膜。IgA?血清IgD含量极低。?膜性 IgD存在于成熟B细胞表面，因此，它是成熟B细胞的主要标志。它也是B细胞

7、抗原受体（BCR）。IgD?血清中含量最低的抗体。?能与肥大细胞和嗜碱性粒细胞表面的IgE-Fc受体结合，介导型超敏反应。?与抗寄生虫感染有关。IgE?单克隆抗体由一个B细胞分化增值的子代细胞（浆细胞）产生的针对单一抗原决定簇（表位）的抗体。?多克隆抗体采用传统的免疫方法，将抗原物质经过不同途径注入动物体内，经数次免疫后采血所获得的抗血清即为多克隆抗体。人工制备抗体人工制备抗体 免疫学试验技术免疫学试验技术?血清学试验的类型血清学试验的类型 血清学反应的特点血清学反应的特点 1.特异性与交叉反应性 2.可逆性：表面的结合，有可逆性 3.适比性：比例合适，反应才可见 4.阶段性：不可见 可见反应

8、 5.条件依赖性：pH，温度，电解质?抗原抗体结合除了空间结构互补外，主要以氢键、静电引力、范德华力和疏水键等非共价结合。Ag+血清(Ab)Ag-Ab复合物 pH 7.0 T 37 pH3 T60 表面性与可逆性表面性与可逆性?Ag和Ab结合需要适当的比例，Ag或Ab过多过少，都不能形成大的Ag-Ab复合物。Ab 过剩 Ag 过剩 比例适当，交联成网络 网格学说 适合比例性适合比例性?电解质：稀释抗原、血清常用生理盐水，但稀释禽类血清时常用 810%高渗盐水。?酸碱度：酸碱度：稀释抗原、血清的溶液 pH6.08.0均可以，为了稳定pH，在抗原抗体反应中最好用pH7.07.2的磷酸缓冲液作抗原抗

9、体稀释液。?温度：通常为37，适当提高反应温度可增加Ag与Ab分子的碰撞机会，加速反应的出现 影响抗原抗体反应的因素 凝集试验?定义：细菌、红细胞等颗粒性抗原，或吸附在胶乳、白陶土和红细胞的抗原，与相立抗体结合，在有适当电解质存在下，经过一定时间，形成肉眼可见的凝集团块，称为凝集试验。凝集反应中的抗原称为 凝集原，抗体称为 凝集素。?分类：分类：凝集试验可根据抗原的性质、反应的方式分为直接凝集试验(简称凝集试验)和间接凝集试验。一、直接凝集试验?细菌、螺旋体和红细胞等颗粒抗原，在适当电解质参与下可直接与相应抗体结合出现凝集。?直接凝集试验分为：玻板凝集试验和试管凝集试验。玻板凝集试验?为一种定

10、性定性试验方法：将含有已知抗体的诊断血清 (适当稀释)与待检菌悬液各一滴在玻片上混合，数分钟后，如出现颗粒状或絮状凝集，即为阳性反应。此法简便、快速，常用于菌种鉴定或ABO血型鉴定。也可用已知的诊断抗原悬液，检测待检血清中是否存在相应抗体，如布氏杆菌的玻板凝集反应和鸡白痢全血平板凝集试验。、试管凝集试验?为一种定量定量试验方法：常用已知抗原液与一系列稀释的受检血清混合，保温后观察每管内抗原凝集程度。以产生50%凝集的最高稀释度作为血清中抗体的效价（亦称为凝集价或滴度）。二、间接凝集试验?将可溶性抗原 (或抗体)先吸附于一种与免疫无关的、一定大小的不溶性颗粒 (统称为载体颗粒)的表面，然后与相应

11、抗体 (或抗原)作用，在有电解质存在的适宜条件下，所出现的特异性凝集反应称为间接凝集反应。根据所用载体分：.乳胶凝集试验 .炭素凝集试验 .间接血凝试验 根据致敏载体用的是抗原或抗体以及凝集反应的方式分：正向间接凝集反应 反向间接凝集反应 间接凝集抑制反应 协同凝集反应 正向间接凝集反应?用抗原致敏载体以检测标本中的相应抗体 可溶性抗原 载体颗粒 抗体（凝集素）反向间接凝集反应?用特异性抗体致敏载体以检测标本中的相应抗原。抗体 可溶性抗原 载体颗粒 间接凝集抑制反应?诊断试剂为抗原致敏的颗粒载体 及相应的抗体，用于检测标本中是否存在与致敏抗原相同的抗原。也可用抗体致敏的载体及相应的抗原作为诊断

12、试剂，以检测标本中的抗体，此称 反向间接凝集抑制反应。协同凝集反应协同凝集反应?与间接凝集反应的原理相似，只是所用载体既非天然的红细胞，也非人工合成的聚合物颗粒，而是一种金黄色葡萄球菌。它的菌体细胞壁中含有A A蛋白(SPA)(SPA)SPASPA具有与IgGIgG的FcFc段结合的特性?因此当这种葡萄球菌与IgG抗体连接时，就成为抗体致敏的颗粒载体；如与相应抗原接触，即出现反向间接凝集反应。?适用于细菌和病毒等的直接检测。基本原理：许多病毒表面具血凝素，具有凝集某些动物或人红细胞的特性，称为血凝现象，可用于鉴定病毒。血凝现象可以被特异性抗体所抑制，称为血凝抑制现象，利用这种特性可进行血清学试

13、验，称为血凝抑制试验。病毒的血凝与血凝抑制试验病毒的血凝与血凝抑制试验 病毒+鸡RBC=凝集（血凝试验）病毒+特异性抗体+鸡RBC=不凝集（血凝抑制试验）沉淀试验?定义：定义：可溶性抗原(如细菌的外毒素、内毒素、病毒的可溶性抗原、血清、组织浸出液等)与相应抗体结合，在适量电解质存在下，形成肉眼可见的白色沉淀，称为沉淀试验 。参与沉淀试验的抗原称 沉淀原，抗体称为 沉淀素。?分类：分类：沉淀反应可在液体中进行，也可在半固体琼脂凝胶中进行。液相内沉淀反应 絮状沉淀反应 环状沉淀反应+抗血清 抗原+抗原 抗体 凝胶内沉淀反应凝胶内沉淀反应 免疫扩散技术 免疫电泳技术 单向扩散试验 双向扩散试验 火箭

14、电泳 对流电泳 免疫电泳 琼扩试验(Agar gel precipitation test,AGP)琼脂凝胶呈多孔结构，孔内充满水分，l%琼脂凝胶的孔径约为85nm，因此可允许各种抗原抗体在琼脂凝胶中自由扩散。Ag和Ab在琼脂凝胶中相遇，在最适比例处结合成Ag-Ab复合物，此复合物因颗粒较大而不能扩散，故形成沉淀带。中和试验(病毒、毒素中和试验)原理：病毒与抗血清中抗体特异结合后失去感染易感 动物、易感鸡胚或鸭胚、易感细胞的活性。用途：.用已知血清检测病毒鉴定病毒，诊断病毒病。.用已知病毒检测血清抗体诊断病毒感染，测定病毒免疫血清效价（中和价）。补体结合试验 1.定义：有补体参与，以绵羊红细胞

15、和溶血素作指示系统的抗原抗体反应。2.组成：有2个系统共5种成分 1)检测系统：检测系统：包括已知抗原(或抗体)和待测抗体(或抗原)2)指示系统：包括绵羊红细胞和溶血素(绵羊红细胞的特异性抗体)3)补体：取自豚鼠的新鲜血清 3.补体结合反应的基本原理 1)补体可与任何抗原抗体复合物相结合；2)指示系统遇补体后就出现明显的溶血反应。Ag Ab 红细胞 溶血素 补体 Ab Ag 红细胞 补体 溶血素 溶血 （-）不溶血 （+）补体结合反应补体结合反应 标记免疫技术标记免疫技术?免疫酶技术?免疫荧光技术?放射免疫测定?免疫胶体金技术?化学发光免疫测定 二、按标记物分类：一、按测定用途分类：免疫组化技

16、术：用于组织切片或其他标本中Ag或Ab的定位。免疫测定技术：用于液体标本中Ag或Ab的测定。免疫酶技术免疫酶技术 将酶分子与Ab或Ag分子连接形成稳定的结合物 （酶标抗体或酶标抗原）不影响：?Ab或Ag的免疫活性?酶的活性 1.Ag-Ab反应的特异性和敏感性 2.酶促反应的高效催化性和敏感性 原理 常用的酶与底物 常用酶常用酶 常用底物常用底物 反应颜色反应颜色 辣根过氧化物酶(HRP)H2O2 不溶性供氢体：3,33,3二氨基联苯胺二氨基联苯胺（DAB）黄褐色 可溶性供氢体：邻苯二胺（OPD）橙黄色 碱性磷酸酶(AP)硝基苯磷酸盐（p-NPP）黄色 葡萄糖氧化酶 与与HRP类似 棕色 DH2

17、+H2O2 D+2H20 HRP 酶联免疫吸附测定 一、基本原理一、基本原理、使Ag或Ab吸附到固相载体表面，并保持其免疫活性。、使Ag或Ab与某种酶连接成 酶标Ag或Ab，酶标Ag或Ab既保 留其免疫活性，又保留酶的活性。、测定时，把受检标本(测定其中的Ab或Ag)和酶标Ag(或Ab)按不同的步骤与固相载体表面的 Ab(或Ag)起反应。、通过洗涤将固相载体上未结合的 Ag或Ab去除，最后结合在 固相载体上的酶量与标本中受检物质的量成一定的比例。、加入酶反应的底物后，底物被酶催化变为 有色产物。?产物的量与标本中受检物质的量直接相关。?可根据颜色反应的深浅进行定性或定量分析。二、ELISAEL

18、ISA方法的基本类型 双抗体（原）夹心法：检测抗原（体）的常见方法 间接法：检测抗体的方法 竞争法：检测抗原或小分子半抗原、抗体 根据检测目的和操作步骤不同有三种基本方法 间接间接ELISAELISA?用于测定抗体。用抗原包被固相载体，然后加入待检血清样品，经孵育一定时间后，若待检血清中含有特异性的抗体，即与固相载体表面的抗原结合形成抗原抗体复合物。洗涤除去其他成分，再加上酶标记的抗抗体，反应后洗涤，加入底物，在酶的催化作用下底物发生反应，产生有色物质。样品中含抗体越多，出现颜色越快越深。获得待分析物的未标定抗体 将特异性抗体与固相 载体连接形成固相抗体 洗涤除去未结合的 抗体及杂质 加入封闭

19、蛋白溶液以封闭载体 表面残留的蛋白结合位点 洗涤并除去未结合的封闭蛋白 加受检标本（抗原）形成 固相抗体抗原复合物 洗涤除去其他 未结合的物质 加酶标抗体生成 抗体待测抗原酶标记抗体 的复合物 彻底洗涤 未结合的 酶标抗体 加底物进行 酶催化反应 根据颜色反应的 程度进行该抗原 的定性或定量测定 双抗体夹心法双抗体夹心法 用已知特异性 抗体包被 固相载体 测定管加待测抗原和 一定量的酶标抗原使二者与 固相抗体竞争结合固相抗体竞争结合 对照管只加一定量酶标抗原 与固相抗体直接结合与固相抗体直接结合 分别洗涤分别洗涤 除去未结合 的成分 加底物显色 分别测定两管的吸光度值，根据对照管与测定管吸光度

20、值之比，根据对照管与测定管吸光度值之比，计算标本中待测抗原含量 竞争法 ELISA问题解析、实验室温度太低；、洗涤液配制不正确或使用了错误的洗涤液；、洗涤系统有微生物污染或含有替代洗涤模式；、使用了过度的洗涤次数；、孵育的时间太短；、试剂或包被板冷；、试剂失效或不同批号的试剂混合；、使用了错误的标记物，标记物配制不正确或标记物变质；、读板时波长错误，酶标仪功能不正常；、阳性对照被稀释；、试剂盒使用次数过多；、试剂盒以前曾使用过。读数偏低可能原因：常用的免疫胶体金检测技术常用的免疫胶体金检测技术?胶体金免疫层析法 将特异性的抗原或抗体以条带状固定在NC膜上，胶体金标记试剂(抗体或单克隆抗体)吸附

21、在结合垫上，当待检样本加到试纸条一端的样本垫上后，通过毛细作用向前移动，溶解结合垫上的胶体金标记试剂后相互反应，再移动至固定的抗原或抗体的区域时，待检物与金标试剂的结合物又与之发生特异性结合而被截留，聚集在检测带上，可通过肉眼观察到显色结果。该法现已发展成为诊断试纸条，使用十分方便。聚合酶链反应(PCR)诊断技术 PCR实质就是模仿体内 DNA复制过程的特异性DNA扩增技术。变性 95?C 延伸 72?C 退火 55?C Mg2+dCTP dGTP dUTP dATP Taq DNA聚合酶聚合酶 AmpErase Primer 靶序列 一、PCR技术概念和原理 二、二、PCR体系基本组成成分体系基本组成成分?模板DNA?特异性引物?耐热DNA聚合酶?dNTPs?Mg2+三、三、PCR检测操作程序 1.病料采集（采样标准、试剂盒说明书）2.2.病原核酸提取（RNA、DNA）3.3.RT-PCR 反转录（RNA cDNA)4.4.PCR扩增 5.5.电泳 6.6.结果判定