第十五章基因工程现代遗传学优质课件.ppt

1、第十五章基因工程现代遗传学优选第十五章基因工程现代遗传学 所谓的遗传工程就是在分子水平上，用人工方法提取（或合成）不同生物的遗传物质，在体外切割、拼接和重新组合。然后通过载体把重组分子引入受体细胞，使外源在受体细胞中进行复制和表达。按人们的需要生产不同的产物或定向地创造生物的新性状，并使之稳定地遗传给下一代。所以基因工程（gene engineering）也称为遗传工程（genetic engineering）、基因操作（gene manipulation）、重组技术（recombination DNA techniques）。有时人们还称它为基因克隆（gene cloning）或分子克隆（m

2、olecular cloning）。遗传工程的基本操作程序大致包括：目的基因的制备，载体的选择，体外重组，重组引入受体细胞，克隆转化子的筛选，重组的检测等。第一节 基因工程的酶学基础一、限制性核酸内切酸（restriction endonuclease）：这 类 酶 又 简 称 为 限 制 性 内 切 酶 或 限 制 酶（restriction enzyme）。限制性内切酶本来是微生物细胞中用于专门水解外源的一类酶，其功能是避免外源的干扰或噬菌体的感染，是细胞中的一种防御机制。根据酶的功能、大小和反应条件，及切割的特点，可以将限制性内切酶分为三类：型酶：分子量较大，反应需Mg+、S-腺苷酰-L

3、-甲硫氨酸（SAM）、ATP等。这类酶有特异的识别位点但没有特异的切割位点，所以在基因工程中应用不大。型酶：分子量较小（105Da），反应只需Mg+的存在，并且具有以下两个特点，使这类酶在基因工程研究中，得到广泛的应用。识别位点是一个回文对称结构，并且切割位点也在这一回文对称结构上。许多型酶切割后，可在上形成粘性末端，有利于片段的重组。型酶：这类酶可识别特定顺序，并在这一顺序的3端2426bp处切开，所以它的切割位点也是没有特异性的。同裂酶（isoschizomers)：指来源不同但识别相同靶序列的核酸内切酶。同裂酶进行切割，产生同样或不同的末端（视切割位点而定）。但有些同裂酶对甲基化位点的敏

4、感性不同。同尾酶（isocaudamer）：指来源不同、识别靶序列不同但产生相同的粘性末端的核酸内切酶。利用同尾酶可使切割位点的选择余地更大。限制性核酸内切酶的命名原则：第一个字母：大写，表示所来自的微生物的属名的第一个字母。第二、三字母：小写，表示所来自的微生物种名的第一、二个字母。其它字母：大写或小写，表示所来自的微生物的菌株号。罗马数字：表示该菌株发现的限制酶的编号。例：EcoR I:来自于Escheria coli RY13的第一个限制酶。二、末端转移酶（terminal transferase）该酶全称为末端脱氧核苷酸转移酶（terminal deoxynucleotidyl tra

5、nsferase），它所催化的反应与DNA pol I 相似，所不同的是它不需要模板，它可以含有的片段为引物，在端加入核苷酸达几百个。末端转移酶常用于在平头上合成一段寡聚核苷酸，从而形成粘性末端。平末端的另一种处理方式是利用衔接物（linker）进行处理，人工加上粘性末端。衔接物是一种人工合成的小分子DNA，约1020个核苷酸，其结构特征是含有多种限制性核酸内切酶的酶切位点的回文结构。如：CCGGATCCGG GGCCTAGGCC 将衔接物分子与平末端DNA分子连接，再用限制性核酸内切酶酶切，便可产生粘性末端。这种方法的优点是克隆位点具有限制酶的酶切位点。Hpa II Hpa IIBamH I

6、 或Sau3A三、连接酶（DNA ligase）该酶常从噬菌体的受感细胞中提取，是由噬菌体基因组所编码的，所以基因工程中常用的连接酶是连接酶。它可催化中磷酸二脂键的形成，从而使两个片段以共价键的形式结合起来。DNA连接酶对具有粘性末端的DNA分子经退火后能很好地连接，对平末端的DNA分子也可以进行连接，但连接效率较低，必须加大酶的用量。四、反转录酶（reverse transcriptase）这类酶来自于反转录病毒，它可以为模板，催化合成。目前常用的有禽源（AMV）及鼠源（M-MLV）反转录酶两种。五、DNA pol I及Klenow片段 该酶常用于制备放射性比度比活体标记高得多的探针，探针的

7、制备方法是采用所谓的缺口平移（nick translation）法制备的。该酶还用于裂口（gap）修补、反转录第二条链的合成（Klenow）、隐蔽末端的填平反应（Klenow）等。Klenow片段：DNA pol I 用枯草杆菌蛋白酶水解成两个片段，小片段（36KD）具有5 3 核酸外切酶活性，大片段（76KD）称为Klenow片段，具有DNA链聚合及3 5核酸外切酶的活性。优点：不需要克隆基因的表达，不需要探针或抗体。疾病的诊断：包括遗传性疾病与传染性疾病。有意思的是在形成冠瘿瘤的同时，一部分Ti质粒（T DNA）可以重组到植物染色体中去，这一特性使Ti质粒有希望成为有效的植物基因工程载体，

8、事实上，Ti质粒是迄今研究得最多的植物基因工程载体。第七章 基因工程的应用coli用冷CaCl2(0)致敏，而后在高温（42）下热休克，这样可使外原DNA进入受体细胞。第十五章基因工程现代遗传学由于E.用于基因文库构建的载体常用噬菌体或cosmid载体，因为它们的容量比较大，可克隆大片段的DNA。将DNA溶液加入到CaCl2中，然后在强烈震荡下加入由Na2HPO4和NaH2PO4组成的磷酸缓冲液，使溶液产生磷酸钙沉淀并将DNA包裹在沉淀中。但它不会产生子代噬菌体，而是以质粒DNA的形式存在于细胞内。例：EcoR I:来自于Escheria coli RY13的第一个限制酶。限制性核酸内切酶的命

9、名原则：在体外，可以合成一系列长约几百的寡聚核苷酸链，然后按照基因的顺序将这些短的核苷酸链连接起来。这类载体主要用来获得大量的单链片段，这种单链片段在遗传学研究中主要用来测定序列（sanger双脱氧法）、基因的定点突变研究、异源双链DNA的分析等。噬菌体DNA体外重组后，一般必须经过体外包装，然后以噬菌体感染的方式将重组DNA导入E.第二，一般常用的限制酶大多识别六个bp序列，切割DNA所产生的片段的平均大小相对比较小（约4kb即464096bp），因此整个基因文库要含有非常大量的重组体，这样应用分子杂交法进行筛选就十分费事费时。mRNA的分离有许多种方法，例如化学的方法，物理的方法（如差速梯

10、度离心法）等。mRNA的差别显示技术就是用来分离这些差别表达的基因的一项有用的技术。2、M13噬菌体载体：Klenow六、S1核酸酶：来自于稻谷曲霉，该酶只水解单链DNA，用于将粘性末端水解成平末端及cDNA发夹式结构的处理。七、碱性磷酸酶：来自于大肠杆菌（bacterial alkaline phosphatase BAP）或小牛肠（calf intestinal alkaline phosphatase CIP），该酶用于脱去DNA（RNA）5末端的磷酸根，使5-P成为5-OH，该过程称核酸分子的脱磷酸作用。当需要5端同位素标记（脱P后利用T4多核苷酸激酶磷酸化）或为了避免DNA片段自身连

11、接（或环化）时可进行脱磷反应。第二节第二节 目的基因的制备目的基因的制备一、化学合成法：1979年Khorana首先成功地合成了tRNA基因。在体外，可以合成一系列长约几百的寡聚核苷酸链，然后按照基因的顺序将这些短的核苷酸链连接起来。化学合成的不足之处在于：（）要已知基因的核苷酸顺序；（）基因不能太大，这一方面是测定核苷酸（或氨基酸）顺序比较困难，另一方面是因为每次仅能合成几百的短片段，短片段越多，要连接成正确的基因顺序就越困难，得率越低；（）价格昂贵。化学合成的最大优点是可以合成一些分离较困难的基因。同时，所合成的基因不含内含子。在原核生物中由于不能进行内含子剪接，所以一旦将含有内含子的基因

12、引入原核生物中表达，其产物往往是没有活性的。由于化学合成法有上述一些优缺点，所以这种方法较多地用于合成一些比较小的基因，如某些激素基因。并也取得一些成功的例子，例如胰岛素基因，生长激素释放抑制激素基因等。由于技术的进步，目前已极少利用化学合成法制备目的基因，而是利用DNA的化学合成法合成一些短的DNA片段作为探针（probe）或PCR的引物。二、从cDNA文库或基因组文库中分离cDNA文库及基因组文库的构造我们将在后面讨论，如果制备好了cDNA文库或基因组文库，那么用原位杂交法来筛选（screening）所需要的目的基因所在的克隆子。将这一克隆子大量繁殖，提取，便可获得所需的目的基因。必要的时

13、候还可以建立差示文库（differential library）。三、法：PCR（polymerase chain reaction)技术是Mullis于1986年发明的一项体外快速大量扩增片段的方法（获1994年诺贝尔奖）。其基本原理就是在体外模拟体内DNA复制的过程，在反应系统中加入欲被扩增的DNA片段，作为模板；人工合成的寡聚核苷酸，作为引物；耐热的DNA聚合酶（Taq）以及四种核苷酸三磷酸。反应时，先加热至约92，使模板变性。降温至约50使引物与模板结合（退火），加温至，在Taq酶作用下，使新链延伸。重复92（变性）、50（复性）、72（延伸）的过程使片段得到不断的扩增，可以重复几十个

14、周期。片段将2n（为反应周期数）的倍数增加。四、mRNA差别显示分离目的基因 根据表达特征，真核细胞的基因可以分为两类：一是所谓的看家基因（house-keeping gene），另一类是受到严格调控的基因（developmental regulated gene）。在不同的生长时期、在个体的发育与分化的不同阶段、在生物体对外界环境的压力的反应、在个体的衰老与死亡等不同的环境下发育调控基因的表达是不同的，这就是基因的差别表达（differential expression）。mRNA的差别显示技术就是用来分离这些差别表达的基因的一项有用的技术。该技术是年建立的，全称为mRNA差别显示反转录PC

15、R(mRNA differential display reverse transcription chain reaction,DDRT-PCR)原理：该技术是利用两组特殊的引物对差别表达的基因进行扩增。3端引物：利用mRNA的poly A尾巴设计。根据mRNA结构分析知道，poly A尾巴之前的两个碱基只有12种可能的排列组合：原理：该技术是利用两组特殊的引物对差别表达的基因进行扩增。二、噬菌体（bacterium phage,phage）载体：为了要寻找更多的DNA差异带，应使用全部的12种锚定引物以及尽可能多的5随机引物。磷酸钙一方面可以增加细胞的通透性，一方面可以避免DNA被细胞内的

16、核酸酶水解。质粒是一种独立于染色体外的小分子环状，一般大小约106108D，可自身复制和表达，有的质粒还带有可做为选择性标记的抗药性基因，所以质粒经过适当改选后便可成为良好的载体。但它不会产生子代噬菌体，而是以质粒DNA的形式存在于细胞内。第二、三字母：小写，表示所来自的微生物种名的第一、二个字母。引入lacZ基因方便筛选。一、限制性核酸内切酸（restriction endonuclease）：第十五章基因工程现代遗传学常用的植物病毒载体有以下几类：例：EcoR I:来自于Escheria coli RY13的第一个限制酶。可以定向地克隆DNA片段，克隆在M13 RF DNA分子上的双链DN

17、A片段，到了子代噬菌体便成了单链的形式。许多型酶切割后，可在上形成粘性末端，有利于片段的重组。BamHI&PstI用一种3锚定引物和一种5随机引物进行扩增，可获得50100条100500bp的DNA扩增带。基因文库（gene library）：用重组DNA技术将某种生物细胞的总DNA或染色体DNA的所有片段随机地连接在载体上，然后转移到适当的宿主细胞中通过细胞增殖而构成各个片段的克隆。同时，所合成的基因不含内含子。四、mRNA差别显示分离目的基因将这些沉淀加入到细胞中，利用细胞的胞饮作用将DNA导入到细胞中。主要在抗病虫害、抗逆性、提高品质等方面的转基因作物。根据这12种排列组合，设计12种不

18、同的引物，这样就将所有mRNA分成了12组。这些引物由1112个T及两个其它的碱基组成，用通式5-T11MN或5-T12MN表示，M为A、G、C的任一种，N为A、G、C、T的任一种。这种引物称锚定引物。5端引物：5端为10个碱基（10-mer）组成的随机引物。每一个随机引物都可能与总mRNA中的某一些分子发生杂交，杂交位点也可能在mRNA的不同位点上。用一种3锚定引物和一种5随机引物进行扩增，可获得50100条100500bp的DNA扩增带。为了要寻找更多的DNA差异带，应使用全部的12种锚定引物以及尽可能多的5随机引物。第三节第三节 基因工程载体基因工程载体 载体（）是由在细胞中能够自主复制

19、的分子构成的一种遗传成分，通过实验手段可使其它的片段连接在它的上面，而进行复制，作为基因工程的载体，必须具备以下几个性能：分子较小，可携带比较大的片段。能独立于染色体而进行自主复制并且是高效的复制。要有尽可能多种限制酶的切割位点，但每一种限制酶又要最少的切割位点。有适合的标记，易于选择。有时还要求载体要能启动外源基因进行转录及表达，并且尽可能是高效的表达。从安全角度考虑，要求载体不能随便转移，仅限于在某些实验室内特殊菌种内才可复制等等。一、质粒（plasmid）载体 质粒是一种独立于染色体外的小分子环状，一般大小约106108D，可自身复制和表达，有的质粒还带有可做为选择性标记的抗药性基因，所

20、以质粒经过适当改选后便可成为良好的载体。作为载体的质粒大多是由天然质粒经人工适当改造而成的，目前已有多种经改造的良好的质粒载体。以Ampr和Tetr为选择性标记，克隆位点在这两个选择性标记的单酶切位点上。选择AmprTets或AmpsTetr的重组子。（4363bp）pUC系列：是目前最常用的E.coli质粒载体。包括pUC7、pUC8、pUC9、pUC12、pUC13、pUC18、pUC19、pUC118、pUC119等。优点：分子量更小，拷贝数更高：分子量在3Kb左右，拷贝数可达每细胞500700个，因此不需要氯霉素扩增。引入多克隆位点（multiple cloning sites,MCS

21、）方便操作。引入lacZ基因方便筛选。筛选原理互补兰白筛选：Lac Z是lac Z基因的突变型，编码半乳糖苷酶N端的146个氨基酸（全长1201氨基酸）。MCS也在这个区域内。这类载体的适合宿主细胞必须是Z基因突变型，只具有Z基因C端的序列。当两个Z基因的突变产物在一起时可产生蛋白质间的互补，称互补。具有互补的细菌培养在含IPTG（异丙基硫代-D-半乳糖苷）及X-gal（5-溴-4-氯-3-吲哚-D-半乳糖苷）的培养基上会形成的兰色菌落。相反，不互补则产生白色的菌落。X-gal本身是无色的，在半乳糖苷酶的水解下产生兰色的物质（被水解为无色的半乳糖及深兰色的5-溴-4-氯靛兰），因此菌落为兰色。

22、如果在MCS位点上插入DNA片段导致插入突变，则不能产生互补，因此菌落是白色的。IPTG起诱导表达的作用，相当于乳糖，但它的诱导效率远高于乳糖。杂交用一种3锚定引物和一种5随机引物进行扩增，可获得50100条100500bp的DNA扩增带。合成互补链成为ds-DNA主要在抗病虫害、抗逆性、提高品质等方面的转基因作物。指来源不同、识别靶序列不同但产生相同的粘性末端的核酸内切酶。cDNA文库是指得到足够多的分别克隆的cDNA片段，汇集这些克隆应包含某种细胞中各种mRNA的相应顺序，每种顺序至少有一份拷贝，这种克隆片段的汇集体称为某种细胞的cDNA文库。将DNA溶液加入到CaCl2中，然后在强烈震荡

23、下加入由Na2HPO4和NaH2PO4组成的磷酸缓冲液，使溶液产生磷酸钙沉淀并将DNA包裹在沉淀中。cI基因失活后将导致噬菌体不能溶原化，产生清晰的噬菌斑。这类酶来自于反转录病毒，它可以为模板，催化合成。相反，不互补则产生白色的菌落。例：EcoR I:来自于Escheria coli RY13的第一个限制酶。质粒是一种独立于染色体外的小分子环状，一般大小约106108D，可自身复制和表达，有的质粒还带有可做为选择性标记的抗药性基因，所以质粒经过适当改选后便可成为良好的载体。包装蛋白的制备可采用单菌株法或双菌株法。各克隆子提取相应的cDNAEcoR I BanH I Sal I Sal I Ba

24、mH I EcoR IB S B S但是无论是RF DNA或ss DNA都能转染E.B P B P原核表达载体：pGEM系列包括pGEM-3、pGEM-3Z、pGEM-3Zf（-）、pGEM-4、pGEM-4Z等。带有噬菌体编码的RNA聚合酶启动子SP6及T7启动子，可用于外源基因的表达。pGEX系列：包括pGEX-1、pGEX-1T、pGEX-2T、pGEX-3X等。该系列是一类融合表达载体，在克隆位点上游有一个谷胱甘肽巯基转移酶（glutathione S-transferase，GST）基因的一个片段。融合位点上有特异蛋白酶水解位点，方便GST的去除。在GST上游有一个启动子Ptac（t

25、rp操纵子启动子与lac操纵子启动子的融合启动子），在IPTG诱导下表达。二、噬菌体（bacterium phage,phage）载体：1、噬菌体载体：噬菌体的基因组结构：A W B C D E F Z U V G H M L K I J b2 cI cro cII O P Q S R att int xis gam red cIII NCOS COS 头部基因 尾部基因 功能不明区 溶原化 重组 早期控制 阻遏 DNA合成 溶菌生长非必须区段cI基因：溶原过程控制基因，插入式载体：噬菌体载体相对于质粒载体来说，克隆片段较大，所以一般用于cDNA文库或基因组文库的构建。cI基因插入失活：如 g

26、t10、NM1149等载体，在cI基因上有EcoR I及Hind III的酶切位点。外源基因插入后将导致cI基因的失活。cI基因失活后将导致噬菌体不能溶原化，产生清晰的噬菌斑。相反，产生混浊的噬菌斑。Lac Z基因插入失活：如charon16A载体，在非必须区段引入lac Z基因，在lac Z基因上有EcoR I位点，插入失活后利用X-gal法筛选（兰白筛选）。由 于 噬 菌 体 包 装 时，只 包 装 它 的 野 生 型 D N A（48.5KB）的75%105%左右的，所以插入式载体可携带的外源片段较取代式为小。cIEcoR I LA 32.7RA10.6 gt 10 lac ZLA 19

27、.9RA21.9EcoR I Charon 16A取代式载体：野生型噬菌体染色体的中段对于噬菌体的感染和复制是非必要的，外源DNA可以取代这一片段，例如Charon 4A、EMBL 3/4、Charon40等载体，这些载体是用Lac 5（乳糖操纵子的大部分系列，包括完整的Lac Z）替换噬菌体的中间区段，同时将Lac 5作为选择标记，使用时用EcoRI水解，去掉中间的片段，再与欲克隆片段在体外进行重组、包装。而后，感染E.coli使之在E.coli内繁殖，并裂解E.coli，形成空斑。Lac 5 EcoR I EcoR IEcoR I BanH I Sal I Sal I BamH I Eco

28、R I MCS MCS Charon 4AEMBL3/4Charon 40（左右臂连接）（三段自身连接）（插入片段）为避免载体自身连接产生的假阳性，可采用双酶解的方法。例如：EMBL 4 E B S S B E EB S S BE B S B SB 欲克隆片 B体外包装：噬菌体DNA体外重组后，一般必须经过体外包装，然后以噬菌体感染的方式将重组DNA导入E.coli细胞内。这是因为以感染方式导入细胞的频率可达106108/gDNA，而以转染（translation）的方式导入的频率仅为103105/gDNA。噬菌体的包装限制为野生噬菌体DNA（约48.5 kb）的75%105%。2、M13噬菌

29、体载体：M13是一种含单键（+）DNA（ssDNA）的丝状大肠杆菌噬菌体，其基因组大小为6.4kb。这类载体主要用来获得大量的单链片段，这种单链片段在遗传学研究中主要用来测定序列（sanger双脱氧法）、基因的定点突变研究、异源双链DNA的分析等。M13噬菌体的特点：感染Ecoli后，在宿主细胞内会形成双链的复制型（replication form DNA,RF DNA）。可以象质粒那样在体外进行纯化和操作。成熟的噬菌体颗粒仅能感染E.coli的F+细胞，这是因为这种噬菌体的感染位点在性散毛上。但是无论是RF DNA或ss DNA都能转染E.coli的F+或F-细胞。噬菌体颗粒的大小是受其的大

30、小制约的，这一点正好与噬菌体相反。所以M13噬菌体并不存在包装限制的问题。RF DNAM13载体：具有多克隆位点(MCS)，方便克隆。许多M13载体的多克隆位点与质粒载体pUC序列的多克隆位点是相同的，在克隆位点选择上更为方便。可以定向地克隆DNA片段，克隆在M13 RF DNA分子上的双链DNA片段，到了子代噬菌体便成了单链的形式。所以如果要同时分离分子中的双链，则需要两种独立的克隆。根据M13的生物学特性知道，M13子代噬菌体中总是只含有（）链，所以M13载体克隆的外源DNA片段在子代噬菌体中究竟是含有DNA分子中的哪条链，则完全取决于外源克隆时的取向。这样一来，为分别分离外源分子的两条链

31、带来一定的麻烦，解决这一问题的一个行之有效的方法就是定向克隆技术。M13mp18 MCS M13mp19 MCSEcoRI BamHI HindIII PstI BglI BglI PstI HindIII BamHI EcoRI B P P BB P B P B PBamHI&PstI三、质粒与噬菌体的重组载体：1、cosmid载体：也称粘粒、柯斯载体。这是一类用于克隆大片段DNA的载体，它是由噬菌体的cos（cohesive）末端及质粒（plasmid）重组而成的载体。cosmid载体带有质粒的复制起点、克隆位点、选择性标记以及噬菌体用于包装的cos末端等，因此该载体在体外重组后，可利用噬

32、菌体体外包装的特性进行体外包装，利用噬菌体感染的方式将重组DNA导入受体细胞。但它不会产生子代噬菌体，而是以质粒DNA的形式存在于细胞内。2、噬菌粒载体：M13载体广泛应用于单链DNA的克隆，但它有明显的不足：插入外源DNA后，遗传稳定性下降；理论上说，M13载体没有包装限制，但它的有效克隆能力仅1500bp。这些限制了M13的应用，为解决这一问题，发展了噬菌粒载体。噬菌粒（phagemid or phasmid）是由单链噬菌体M13或f1与质粒载体重组而成的新型载体。它具有质粒的复制起点、选择性标记、多克隆位点等，方便DNA的操作，可在细胞内稳定存在；又具有单链噬菌体的复制起点，在辅助噬菌体

33、的存在下，可进行噬菌体的繁殖，产生单链的子代噬菌体。四、YAC载体与YAC文库：YAC（yeast artificial chromosome，酵母人工染色体）质粒载体是在人类基因组计划（HGP）实施的背景下发展起来的一类克隆特大片段的载体。这类载体含有酵母菌的复制起点ARS（automatic replication sequence,ARS），着丝粒CEN（centromere），端粒TEL（telomere），以及选择性标记和克隆位点；同时还含有大肠杆菌的复制起始点，可以在大肠杆菌中以环状质粒的形式存在。DNA体外重组后以原生质体转化的方式导入酵母细胞。这类载体克隆能力可达12Mb。主要

34、用于基因组文库的构建。原核生物主要载体用途小结：载体用途质粒 cosmid M13YAC大片段DNA克隆+基因文库构建+cDNA文库构建+序列分析+单链探针+工程菌+五、真核生物载体：由于真核生物与原核生物在复制和转录系统上存在着差异，所以要求用不同的基因载体。真核生物基因工程载体的要求与原核生物基因工程载体大体相似，所不同的是：它除了含有真核基因的转录和复制的必要结构外，还必须含有细菌的转录和复制的必要结构，以便能在细菌中大量繁殖。含有细菌及哺乳动物细胞中的双重选择性标记，这就是所谓的穿梭质粒，可在哺乳动物和原核生物之间穿梭。植物基因工程载体：用于植物基因工程的载体有Ti质粒载体及病毒载体两

35、类。Ti质粒是存在于根癌农杆菌的一种质粒。根癌农杆菌感染植物时，会在植株的根茎结合部产生未分化的细胞团，即冠瘿瘤。有意思的是在形成冠瘿瘤的同时，一部分Ti质粒（T DNA）可以重组到植物染色体中去，这一特性使Ti质粒有希望成为有效的植物基因工程载体，事实上，Ti质粒是迄今研究得最多的植物基因工程载体。由于Ti质粒的宿主范围较窄，仅感染某些双子叶植物，因此人们又发展了另一类植物基因工程载体病毒载体。常用的植物病毒载体有以下几类：ssRNA病毒：例如烟草脆裂病毒（TRV），必须先将单链RNA反转录成双链的cDNA，才可作为载体。ssDNA病毒：例如双子座病毒，这类病毒可感染单子叶植物，所以是很有前

36、途的一类载体。dsDNA病毒：这是研究得最多的植物病毒载体，例如花椰菜花叶病毒。哺乳动物基因工程载体：目前使用的哺乳动物基因载体大多由哺乳动物病毒经改造而成。用得比较多的病毒有猴空泡病毒（SV40）、单纯疱疹病毒（HSV）、Rous肉瘤病毒、EB病毒等。在哺乳动物细胞内表达的载体必须考虑以下几个表达元件：启动子与增强子终止信号与加尾信号剪接识别信号复制与选择元件选择系统：HAT选择系统胸苷激酶(TK)、黄嘌呤鸟嘌呤磷酸核糖转移酶（XGPRT）、二氢叶酸还原酶（DHFR）系统：嘌呤合成：谷氨酰胺+PRPP IMP AMP GMPFH4 FH2 H XGPRT天冬氨酸 UMPCMPTMP FH4

37、FH2 TTK7,8二氢叶酸+NADPH+H+5,6,7,8四氢叶酸+NADP+DHFR氨甲喋呤抑制选择原理：tk基因及xgprt基因的筛选：受体细胞必须是相应的tk-或xgprt-，将细胞培养在含HAT（H：黄嘌呤，A：氨甲喋呤，T：胸苷）的培养基中。在A存在下，核苷酸的从头合成途径被阻断，不能合成AMP、TMP及GMP。这三种核苷酸的合成只能有补偿途径合成，必须具有tk或xgprt基因的存在细胞才可生长。dhfr基因的筛选：受体细胞必须是dhfr-，当受体细胞培养在不含HT的培养基中，受体细胞不能生长。新霉素抗性选择系统：新霉素是原核生物的抗生素，对真核生物没有抑制作用，但新霉素的类似物G

38、418对真核细胞及原核细胞均具有抑制作用。新霉素抗性基因（neo）能在真核细胞中表达并能使G418失活（neo基因编码一个磷酸转移酶），细胞可以生长。氯霉素乙酰转移霉检测系统：氯霉素乙酰转移酶（CAT）可使氯霉素乙酰化而失去活性。当cat基因在真核细胞内表达后，制备细胞提取物，然后加入乙酰辅酶A及14C标记的氯霉素，如果细胞中存在cat，可使氯霉素乙酰化，通过薄层层析将乙酰化及未乙酰化的氯霉素分开，再用放射自显影检测。带有单纯疱疹病毒HSV的片段，tk基因，tk启动子和加尾信号带有小鼠乳腺病毒MMTV的LTR启动子（PLTR），gpt（xgprt），加尾信号等带有SV40早期启动子（PE），加

39、尾信号。原核生物的启动子T7及Ptac等。第四节第四节 重组重组DNA导入受体细胞导入受体细胞一、原核生物的转化（transfomation）与转染（transfection）E.coli的钙转化：细菌细胞在一定的生理状态（感受态），或经CaCl2处理，或制备成原生质体的情况下，都可吸收外源，利用这一特性可将重组导入受体细胞中，用质粒作载体的遗传工程一般使用这种方法。由于E.coli不会自发地产生感受态，因此E.coli的转化一般采用钙转化法。该方法是将E.coli用冷CaCl2(0)致敏，而后在高温（42）下热休克，这样可使外原DNA进入受体细胞。E.coli的电穿孔转化：在高压电场下使细胞

40、产生瞬间的穿孔，这个穿孔足够大并可维持足够的时间，使外原DNA进入受体细胞。电穿孔法的转化效率比钙转化法高23个数量级。这种方法也可用于真核生物的转染。原核生物的转染：转染是指转化感染（Transfection来自于transfomation与infection），所以凡是以噬菌体（如M13）或病毒为载体，以转化的方法将DNA导入细胞的方法均称为转染。因此转染就方法来说与转化是一样的。二、体外包装与转导（transduction）：以噬菌体作为载体，常利用转导的方法将重组DNA导入受体细胞。噬菌体载体在体外与目的DNA片段重组后，与噬菌体的头部蛋白及尾部蛋白混合保温，让DNA在体外进行包装，产

41、生有感染能力的噬菌体颗粒。利用这种噬菌体感染受体细胞从而将重组DNA导入受体细胞内。包装蛋白的制备可采用单菌株法或双菌株法。单菌株法是利用cos突变的溶源菌。双菌株法则利用两株不同的突变菌株，如BHB2688是编码头部蛋白的E基因突变，BHB2690是编码头部蛋白的D基因突变，两个菌株经诱导后都能合成包装蛋白，但不能进行包装，当两者的蛋白质混合后便具有包装能力。三、真核生物的转染：磷酸钙转染技术：主要用于动物细胞的转染。将DNA溶液加入到CaCl2中，然后在强烈震荡下加入由Na2HPO4和NaH2PO4组成的磷酸缓冲液，使溶液产生磷酸钙沉淀并将DNA包裹在沉淀中。将这些沉淀加入到细胞中，利用细

42、胞的胞饮作用将DNA导入到细胞中。磷酸钙一方面可以增加细胞的通透性，一方面可以避免DNA被细胞内的核酸酶水解。电穿孔法：原理与原核生物的电穿孔法一样，主要用于植物细胞的转染。基因抢转染法：主要用于植物细胞的转染。利用被电场或机械加速的金属微粒能够进入细胞内的基本原理，先将DNA溶液与钨、金等金属微粒一起保温，使DNA吸附在金属微粒表面，随高速的金属微粒直接进入细胞内。激光微束穿孔法：主要用于叶绿体或线粒体的基因工程操作。利用直径很小、能量很高的激光束在细胞表面引起可逆性的穿孔，使DNA进入细胞。显微注射法：主要用于动物细胞或植物的原生质体，利用毛细管直接将DNA注入细胞内。脂质体（liposo

43、me）介导法：主要用于动物细胞或植物的原生质体。将DNA包裹在人工制备的磷脂双分子层的膜状结构内，通过脂质体与细胞膜的融合而将DNA导入细胞内。多聚物介导法：用于动物细胞或植物的原生质体。利用多聚物如PEG、二乙胺乙基葡聚糖（DEAE葡聚糖）、多聚赖氨酸、多聚鸟氨酸等与二价阳离子、DNA混合形成沉淀颗粒，通过细胞的胞饮作用而进入细胞内。第五节第五节 克隆子的筛选与鉴定克隆子的筛选与鉴定一、克隆子的筛选：利用载体的选择性标记进行筛选。二、克隆子的鉴定：遗传检测法：该方法要求克隆基因能够表达，并利用相应的基因突变型作为受体细胞，当受体细胞由突变型变为野生型时或赋予受体细胞特定的表型时，我们基本可以

44、确定所克隆的基因是否是目的基因。优点：简便、快速，结果较可靠。缺点：基因必须表达并具有合适的受体细胞。凝胶电泳检测法：该方法利用凝胶电泳的方法检测重组DNA分子或克隆片段的大小（分子量）。优点：简便、快速。缺点：只能提供克隆片段大小的信息。免疫化学检测法：利用免疫学的原理，检测克隆基因的表达产物。放射性标记抗体检测法：该方法类似于原位杂交法。优点：方法简便，一次可检测大量的克隆子。缺点：克隆基因必须表达并具有相应的抗体。放射性标记抗体检测法的原理滤膜培养皿及菌落抗体溶液放射性标记抗体检测法的操作程序ELISA检测技术：ELISA（enzyme linked immuno-sorbent ass

45、ay）是一种固相免疫检测技术。比较常用的方法有用于检测抗原的双抗体夹心法和用于检测抗体的间接法两种。因此，基因工程中用于检测克隆基因表达产物的方法主要是双抗体夹心法。优点：能进行定量检测，因此该方法更多地用于基因表达产物的定量分析。缺点：较繁琐。基因必须表达。分子杂交技术检测法：包括菌落或噬菌斑的原位杂交技术。优点：方法简便、快速。缺点：必须具有相应的探针。杂交抑制翻译法：该方法用于cDNA文库中目的基因的筛选。其原理是利用cDNA与mRNA杂交后导致mRNA的不能翻译，从而筛选阳性克隆子。优点：不需要克隆基因的表达，不需要探针或抗体。缺点：较烦琐。DNA序列分析：该方法通常是用在目的基因筛选

46、后最终的鉴定。各克隆子提取相应的cDNA从cDNA文库相应的细胞提取mRNA 混合杂交无细胞翻译体系（麦胚或网织红细胞提取物）体外翻译35S标记甲硫氨酸 聚丙烯酰胺凝胶电泳 放射自显影分析比较，找出目的蛋白不合成的克隆子即为目的基因PCR第六节第六节 文库的构建文库的构建一、cDNA文库（library）的构建 cDNA文库是指得到足够多的分别克隆的cDNA片段，汇集这些克隆应包含某种细胞中各种mRNA的相应顺序，每种顺序至少有一份拷贝，这种克隆片段的汇集体称为某种细胞的cDNA文库。为了得到特定基因的cDNA片段，就需要先分离出有功能的特定mRNA。所以首先必须考虑从什么细胞，用什么方法将提

47、取出来。这是由于不同细胞可限定合成不同的蛋白质，这样在一些组织细胞中除了含有普通蛋白质的mRNA外，还会有数量较多的特定mRNA。mRNA的分离有许多种方法，例如化学的方法，物理的方法（如差速梯度离心法）等。有的还可以利用真核生物的mRNA具有的poly A尾巴进行亲和层析法分离mRNA。有的则采用几种方法联合使用，其总的目标就是获得纯度高、得率高的有活性的mRNA。在取得mRNA后，接下来就是将mRNA通过反转录酶合成杂种DNA链（DNA-RNA分子），在碱（KOH）作用下水解RNA链，然后经DNA聚合酶I作用再合成第二条DNA链，即形成双链cDNA分子，将双链cDNA插入载体后形成重组体，

48、并导入细菌中，随细菌的繁殖而扩增和克隆，形成cDNA文库。二、基因组文库的构建 基因文库（gene library）：用重组DNA技术将某种生物细胞的总DNA或染色体DNA的所有片段随机地连接在载体上，然后转移到适当的宿主细胞中通过细胞增殖而构成各个片段的克隆。当制备的克隆数目多到可以把某种生物的全部基因都包含在内的情况下，这一组克隆的总体就称为某种生物的基因文库。同一定义也适用于线粒体或叶绿体的基因文库。由于制备片段的切点是随机的，所以每一克隆内所含的片段即可能是一个或几个基因，也可能是一个基因的一部分或除完整基因外还包含着两侧的邻近顺序。基因文库的构建就是利用所谓的“鸟抢法”，使基因组的D

49、NA片段随机地插入适当的载体中，导入细胞进行大量繁殖而构建的。用于构建基因文库的片段的产生大致有两种方法，一是用限制性内切酶完全消化基因组DNA，这个方法有两个特点。第一是假如所需的基因含有所用限制酶的识别位点，那么这一基因将被克隆在两个或数个片段中，给研究带来一定的困难。第二，一般常用的限制酶大多识别六个bp序列，切割DNA所产生的片段的平均大小相对比较小（约4kb即464096bp），因此整个基因文库要含有非常大量的重组体，这样应用分子杂交法进行筛选就十分费事费时。虽然可以用限制酶进行部分消化，产生约20kb的片段，但这种方法必须掌握好酶解的条件。用于制备基因组文库的随机片段的另一种方法是

50、采用机械随机切割。这种方法可以制备大片段的DNA（用噬菌体作载体约20kb，以cosmid作载体约45kb），从而克服上述的两个缺点。但是这种方法的不是之处是：所制备的片段的末端顺序是随机的，还必须经过末端修复，人工制造接头等手续才能与载体进行连接。用于基因文库构建的载体常用噬菌体或cosmid载体，因为它们的容量比较大，可克隆大片段的DNA。虽然cosmid载体比载体的容量大，但由于文库的保存（cosmid载体在E.coli中，载体在噬菌体中）比cosmid容易，因此载体用的更多些。基因组文库的克隆数：由于基因文库的DNA片段是随机克隆的，因此要保证任何一个基因在文库内都能找到，基因组文库的