第四章目的基因的转化及其原理1课件.ppt

1、第四章目的基因的转化及其原理优选第四章目的基因的转化及其原理3一、植物基因工程载体命名规则及种类一、植物基因工程载体命名规则及种类 1、植物基因工程载体命名规则、植物基因工程载体命名规则(1)pSC101plasmidStanley Cohen(人名)pTiT37/pAtT37根癌农杆菌的质粒类型根癌农杆菌的质粒类型（Agrobacterium tumefaciens）pRiT37/pArT37发根农杆菌的质粒类型发根农杆菌的质粒类型（Agrobacterium rhizogenes）4（2）每个基因位点均以三个斜体小写字母表示，）每个基因位点均以三个斜体小写字母表示，如如leu（亮氨酸基因位

2、点）（亮氨酸基因位点）基因表现型用正体表示，如基因表现型用正体表示，如Leu（3）基因中任何位点发生突变则在该基因符号后）基因中任何位点发生突变则在该基因符号后加该位点斜体大写字母，如亮氨酸加该位点斜体大写字母，如亮氨酸A、B位点分别位点分别为突变型或缺陷型，表示为为突变型或缺陷型，表示为leuA、leuB (4)抗性和敏感性分别用抗性和敏感性分别用R或或r，S或或s表示表示 52 2、植物基因工程载体的种类及特性、植物基因工程载体的种类及特性植物基因植物基因工程载体工程载体克隆载体克隆载体中间载体中间载体中间克隆载体中间克隆载体中间表达载体中间表达载体卸甲载体卸甲载体onc-onc+转化载体

3、转化载体中间黏粒载体中间黏粒载体质粒质粒/黏粒载体黏粒载体基因标记载体基因标记载体一元转化载体一元转化载体（顺式载体）（顺式载体）双元转化载体双元转化载体（反式式载体）（反式式载体）共整合载体共整合载体SEV（拼接末端载体；（拼接末端载体；split-end vector）6二、根癌农杆菌二、根癌农杆菌TiTi质粒的结构与功能质粒的结构与功能 1、Ti质粒的遗传特性、结构及功能质粒的遗传特性、结构及功能 2、TDNA的基因结构与功能的基因结构与功能 3、Vir区操纵子的基因结构与功能区操纵子的基因结构与功能 7一、一、TiTi质粒的遗传特性、结构及功能质粒的遗传特性、结构及功能 1.Ti质粒的

4、遗传特性及类型质粒的遗传特性及类型 Ti质粒是根癌农杆菌染色体外的遗传物质，为双股共价闭合质粒是根癌农杆菌染色体外的遗传物质，为双股共价闭合的环状的环状DNA分子。分子。根据其诱导的植物冠瘿瘤中所合成的冠瘿碱种类不同，根据其诱导的植物冠瘿瘤中所合成的冠瘿碱种类不同，Ti质粒质粒可以被分成四种类型可以被分成四种类型 章鱼碱型章鱼碱型(octopine)胭脂碱型胭脂碱型(nopaline)农杆碱型（农杆碱型（agropine）农杆菌素碱型（农杆菌素碱型（agrocinopine）或称琥珀碱型）或称琥珀碱型(succinamopine)8图图3-1 章鱼碱型章鱼碱型Ti质粒基因图。质粒基因图。章鱼碱

5、基因章鱼碱基因T-DNA区区结合转移区结合转移区冠瘿碱代谢冠瘿碱代谢复制起始区复制起始区毒力区毒力区生长素基因生长素基因细胞分裂素基因细胞分裂素基因冠瘿碱合成冠瘿碱合成92.Ti质粒的功能区域质粒的功能区域 Ti质粒可分为四个区质粒可分为四个区（1）TDNA区（区（transferredDNA regions）TDNA是农杆菌侵染植物细胞时，从是农杆菌侵染植物细胞时，从Ti质粒上切割下来转移到植物细胞的一段质粒上切割下来转移到植物细胞的一段DNA，称为转移，称为转移DNA。该。该DNA片段上的片段上的基因与肿瘤的形成有关。基因与肿瘤的形成有关。（2）Vir区（区（virulence regio

6、n）该区段上的基因能激活该区段上的基因能激活TDNA转移，转移，使农杆菌表现出毒性，故称之为毒区。使农杆菌表现出毒性，故称之为毒区。TDNA区与区与Vir区在质粒区在质粒DNA上彼此相邻，上彼此相邻，约占约占Ti质粒质粒DNA的三分之一。的三分之一。10（3）Con区（区（regions encoding conjugations）该区段上存在着与细菌间接合转移的有关基因（该区段上存在着与细菌间接合转移的有关基因（tra），调控），调控Ti质粒在农杆菌之间的转移。冠瘿碱能激活质粒在农杆菌之间的转移。冠瘿碱能激活tra基因，诱导基因，诱导Ti质粒转质粒转移，因此称之为接合转移编码区。移，因此称之

7、为接合转移编码区。（4）Ori区（区（origin of replication）该区段基因调控该区段基因调控Ti质粒的自我复制，故称之为复制起始区。质粒的自我复制，故称之为复制起始区。11它应该含有单一的限制性内切酶切点，以利于外源基因的插入；必须用Southern杂交或PCR对大的共整合体质粒进行检测；三、农杆菌Ti质粒基因转化机理已知农杆菌附着到植物细胞后，只留在细胞间隙中。3）共整合载体的选择。A nick introduced into the second strand of the target initiates repair synthesis of the second s

8、trand of the TDNA.它应该含有阳性植物选择标记，以利于转化植物细胞的筛选，例如新霉素磷酸转移酶(neomycin phosphotransferase,Npt)基因，其可赋予转化植物细胞卡那霉素抗性；frs：琥珀碱合成酶；pTiAch5（195kb）iaaM：色氨酸单加氧酶；Ti质粒的遗传特性及类型三、Vir区操纵子的基因结构与功能Ti质粒的生物学功能（2）Vir区（virulence region）不过，人们可能还要设计一些特殊的实验来研究外源基因在冠瘿瘤组织中的表达问题。中间表达载体与受体Ti质粒之间同源序列是pBR322。3.Ti质粒的生物学功能质粒的生物学功能参与寄主细

9、胞合成植物激素吲哚乙酸（参与寄主细胞合成植物激素吲哚乙酸（IAA）和一些细胞分裂素的活动。）和一些细胞分裂素的活动。诱发植物产生冠瘿瘤并决定所诱导的肿瘤的形态学特征和冠瘿碱成分。诱发植物产生冠瘿瘤并决定所诱导的肿瘤的形态学特征和冠瘿碱成分。赋予寄主菌株具有分解代谢各种冠瘿碱化合物的能力。赋予寄主菌株具有分解代谢各种冠瘿碱化合物的能力。赋予寄主菌株对土壤杆菌所产生的细菌素的反应性。赋予寄主菌株对土壤杆菌所产生的细菌素的反应性。为农杆菌提供附着于植物细胞壁的能力。为农杆菌提供附着于植物细胞壁的能力。决定寄主菌株的植物寄主范围。决定寄主菌株的植物寄主范围。有的有的Ti质粒能够抑制某些根瘤土壤杆菌噬菌

10、体生长与发育，即具有对噬菌质粒能够抑制某些根瘤土壤杆菌噬菌体生长与发育，即具有对噬菌体的体的“排外性排外性”。12表表41 Ti质粒放入部分基因及其功能质粒放入部分基因及其功能基因缩写基因缩写表型及功能表型及功能在基因图上的位置（在基因图上的位置（kb）pTiC58（211kb）pTiAch5（195kb）age排斥噬菌体排斥噬菌体API111-11310-12agr对对PAT-K84质粒编码的农杆菌素敏感质粒编码的农杆菌素敏感138-141arc分解精氨酸分解精氨酸4-59-10agc分解农杆菌分解农杆菌54-57noc分解胭脂碱分解胭脂碱18-20nos合成胭脂碱合成胭脂碱0-1occ分解

11、章鱼碱分解章鱼碱39-41ocs合成章鱼碱合成章鱼碱0-1ori复制起点复制起点33-3590-95roi（tmr）抑制长根抑制长根206-207190-192shi（tms）抑制长芽抑制长芽202-203187-188traTi质粒转移质粒转移121-12321-30inc质粒不相容性质粒不相容性33-3590-9513二、二、TDNA的基因结构与功能的基因结构与功能 1.TDNA的发现的发现 Chilton等人于等人于1982发现。发现。(MD CHILTON,D TEPFER,A PETIT,D CHANTAL,CD FRANCINE,T JACQUES.Agrobacterium rh

12、izogenes inserts TDNA into the genomes of the host plant root cells.Nature,1982(295):432 434）研究证明，这部分研究证明，这部分DNA是从质粒是从质粒DNA上切割后，上切割后，转 移 到 肿 瘤 细 胞，故 称 之 为 转 移转 移 到 肿 瘤 细 胞，故 称 之 为 转 移 D N A（transferredDNA）。）。14GGCAGGATATATATTCAATTGTAATGGCAGGATATATATACCGGTTGTAATT图图3-2 Ti质粒上几个重要区域及其序列质粒上几个重要区域及其序列LB：左

13、边界序列；：左边界序列；RB：右边界序列：右边界序列152.TDNA的结构特点的结构特点 l Ti质粒TDNA区的长度约为23kb；l TDNA仅存在于植物肿瘤细胞的核DNA中；l 在TDNA的5端和3端都有真核表达信号。如TATAbox、AATAAbox及polyA等。16 TDNA的两端左右边界各为的两端左右边界各为25bp的重复序列，即边界序列的重复序列，即边界序列（border sequence），分别称之为左边界（），分别称之为左边界（BL或或TL）和右边界（和右边界（BR或或TR）。）。该该25bp边界序列属保守序列边界序列属保守序列,但通常右边界（但通常右边界（TR）序列更）序列

14、更为保守，左边界为保守，左边界(TL)序列在某些情况下有所变化。其核心序列在某些情况下有所变化。其核心部分是部分是14bp，可分为，可分为10bp(CACGATATAT)及及4bp(GTAA)两部分两部分,是完全保守的。是完全保守的。致瘤性右边界作用大于左边界致瘤性右边界作用大于左边界17双元载体系统的中间载体中间载体是一种在一个普通大肠杆菌的克隆载体（例如pBR322质粒）中插入了一段合适的TDNA片段，而构成的小型质粒。iaaM：色氨酸单加氧酶；三、Vir区操纵子的基因结构与功能iaaH：吲哚乙酸胺水解酶；表 44 章鱼碱型Ti质粒vir基因基本结构与功能（1）TDNA区（transfer

15、redDNA regions）农杆碱型（agropine）Mismatch repair may similarly explain the observed deletion.中间表达载体与受体Ti质粒之间同源序列是pBR322。单链缺口修复模型（SSGR model）帮助接受植物信号分子启动毒性区表达TDNA invasion depicted in the model involves VirD2mediated recognition of a nick(or gap)that is followed by ligation of the 5 end of the Tstrand to

16、 the target DNA.由于pGV3850共整合载体，带有大肠杆菌pBR322序列，外源基因嵌合在该序列中，因而转化的植物中也带有重复的pBR322序列。此重复序列可能对转化植物中的外源基因的稳定性有影响，而SEV系统则排除了这种可能。在这种情况下，使用onc+菌株载体则比较合适。TDNA具典型的真核生物RNA合成起始和终止的调节信号，1、Ti质粒的遗传特性、结构及功能2）MiniTi质粒具有E.3.TDNA上的编码基因及功能上的编码基因及功能 TDNA的转录有下述共同点的转录有下述共同点 TDNA的两条链都是有意义链的两条链都是有意义链,即都能被转录。即都能被转录。TDNA上每个基因

17、都有各自的启动子。上每个基因都有各自的启动子。基因的转录由植物细胞基因的转录由植物细胞RNA聚合酶聚合酶完成。完成。TDNA具典型的真核生物具典型的真核生物RNA合成起始和终止的调节信号，合成起始和终止的调节信号，TDNA的转录机理可能与真核生物相同。的转录机理可能与真核生物相同。植物或农杆菌中可能有甲基化或去甲基化的调节基因活性。植物或农杆菌中可能有甲基化或去甲基化的调节基因活性。18TLTRTCiaaH iaaM auxiptcytocsfrsmasags图图4-3 章鱼碱型章鱼碱型Ti质粒的质粒的T-DNA编码基因结构编码基因结构iaaH：吲哚乙酸胺水解酶；：吲哚乙酸胺水解酶；iaaM：

18、色氨酸单加氧酶；：色氨酸单加氧酶；aux：生长素；：生长素；ipt:异戊烯基转移酶；异戊烯基转移酶；cyt：细胞分裂素；：细胞分裂素；frs：琥珀碱合成酶；：琥珀碱合成酶；mas：甘露碱合成酶；：甘露碱合成酶；ags：农杆碱合成酶：农杆碱合成酶19TDNA区基因的功能区基因的功能 第一类是编码冠瘿碱合成酶及分解代谢基因，第一类是编码冠瘿碱合成酶及分解代谢基因，如如:frs、mas、ags 第二类是致瘤基因；包括生长素基因第二类是致瘤基因；包括生长素基因aux和细胞分和细胞分裂素基因裂素基因cyt 20三、三、Vir区操纵子的基因结构与功能区操纵子的基因结构与功能 1、Vir区操纵子的基因结构区

19、操纵子的基因结构 农杆菌致瘤所必须的农杆菌致瘤所必须的；Vir区仅位于区仅位于T区区DNA左侧；左侧；两者之间的距离常随两者之间的距离常随Ti质粒类型不同而有差异。质粒类型不同而有差异。HABGCDEFtzsABGCDE章鱼碱章鱼碱胭脂碱胭脂碱图图 4-5 章鱼碱型和胭脂碱型章鱼碱型和胭脂碱型Ti质粒的质粒的Vir区编码基因结构区编码基因结构21表表 44 章鱼碱型章鱼碱型Ti质粒质粒vir基因基本结构与功能基因基本结构与功能遗传座位遗传座位分子量（分子量（kb）基因数基因数表达方式表达方式功能功能virA2.81组成型组成型帮助接受植物信号分子启动毒性区表达帮助接受植物信号分子启动毒性区表达

20、virG1.01组成型组成型转录活化转录活化virC1.52诱导型诱导型T-DNA加工加工virD4.54诱导型诱导型T-DNA加工加工virE2.22诱导型诱导型T-DNA加工加工virB9.511诱导型诱导型膜转运蛋白膜转运蛋白virF1.01诱导型诱导型T-DNA转运转运virH94.22诱导型诱导型细胞色素细胞色素P-450单氧化酶单氧化酶22三、农杆菌三、农杆菌Ti质粒基因转化机理质粒基因转化机理已知农杆菌附着到植物细胞后，只留在细胞间隙中。TDNA首先在细菌中被加工、剪切、复制，然后转入植物细胞，并非整个Ti质粒都进入植物细胞。该基因转化过程是一个复杂的遗传工程。231、TDNA的

21、加工及转移的加工及转移24四、四、T链整合植物基因组的分子机理链整合植物基因组的分子机理 1、整合位点及其特性、整合位点及其特性T-DNA在植物染色体中的插入是随机的，可插入植物任何在植物染色体中的插入是随机的，可插入植物任何一条染色体一条染色体插入位点常有以下特点：插入位点常有以下特点：T-DNA优先整合到转录活跃的植物基因位点；优先整合到转录活跃的植物基因位点；T-DNA与植物与植物DNA连接处富含连接处富含A，T碱基对；碱基对；植物植物DNA上的插入靶位点与上的插入靶位点与T-DNA边界序列有一定程度边界序列有一定程度的同源性。的同源性。257）共整合载体系统比双元载体系统更难以应用，通

22、常一个共整合载体在用于植物转化之前，应弄清Ti质粒的拷贝数和大小，所以必须通过southern杂交来鉴定。在大多数真核生物基因的3端具有AATAA序列。TDNA上每个基因都有各自的启动子。1、Ti质粒的改造及卸甲载体构建双元载体（binary vecter）系统是指由两个分别含TDNA和Vir区的相容性突变Ti质粒构成的双质粒系统,又因为其TDNA与Vir基因在两个独立的质粒上，通过反式激活TDNA转移,故称之为反式载体（trans vecter）.TDNA是农杆菌侵染植物细胞时，从Ti质粒上切割下来转移到植物细胞的一段DNA，称为转移DNA。细胞色素P-450单氧化酶1）双元载体不需要共整合

23、过程，因此系统中的两个质粒不必含有同源序列。三、Vir区操纵子的基因结构与功能中间表达载体与受体Ti质粒之间同源序列是pBR322。因为利用野生型的Ti质粒作载体时，影响植株再生的直接原因是TDNA中onc基因的致瘤作用。The Tstrand invades the gap and a synapsis is formed by partial pairing between TDNA ends and target.基因表现型用正体表示，如Leu2）MiniTi质粒具有E.1）它们的受体Ti质粒与中间载体的结构不同。(3)在植物靶位处不要求有特异的序列，但若在TDNA两端和植物靶位处之间有

24、一段短序列（510b）同源，则可以在整合中起作用。其次，中间载体含有广泛寄主范围质粒的复制起始点（oriV），而代替了共整合载体中用以重组的同源区，能够在任何农杆菌寄主里自发复制。At the position where the 3 end of the Tstrand is stabilized by basepairing,the Tstrand is ligated to the target.十分幸运的是，大肠杆菌具有能与农杆菌高效地接合转移的特性。共合体的形成频率与两个质粒的重组频率有关,相对较低；Ti质粒是根癌农杆菌染色体外的遗传物质，为双股共价闭合的环状DNA分子。2.TDNA

25、的整合机理的整合机理 双链断裂修复模型（双链断裂修复模型（DSBR model）单链缺口修复模型（单链缺口修复模型（SSGR model）26 Sci，IF9.2052728 Fig 46 Illegitimate recombination models for TDNA integration.(a)Doublestrand breakrepair(DSBR)and singlestrand gaprepair(SSGR)models equally explain the integration events leading to TDNA insertion 621x34.As out

26、lined in the Discussion,the DSBR model predicts a doublestrand break in the target.Unwound or exonuclease processed ends of the TDNA and of the target anneal by partial homologous pairing.Singlestrand overhangs are removed by endo or exonuclease digestion;the ends are repaired and ligated.The SSGR m

27、odel predicts a nick in the target that is converted to a gap by a 53 exonuclease.The Tstrand invades the gap and a synapsis is formed by partial pairing between TDNA ends and target.The overhangs of the TDNA are removed and the Tstrand is ligated to the target.A nick introduced into the second stra

28、nd of the target initiates repair synthesis of the second strand of the TDNA.(b)Application of the SSGR model for TDNA insertion 62136.As proposed in the model of insertion 621x34,repair at the ends of invading Tstrand may occur before ligation.Absence of an internal CAGT TDNA sequence from the righ

29、t junction of insert 62136 suggests that copying of the target plant DNA led to alteration of the right TDNA end during integration.Mismatch repair may similarly explain the observed deletion.(c)A modified version of SSGR model explaining possible involvement of VirD2 protein in recombination events

30、 that resulted in TDNA insertions 62137 and N6Hcs4.TDNA invasion depicted in the model involves VirD2mediated recognition of a nick(or gap)that is followed by ligation of the 5 end of the Tstrand to the target DNA.The 3 end of the Tstrand moves along the target,while the unwound target DNA strand is

31、 removed by exonucleolytic digestion.At the position where the 3 end of the Tstrand is stabilized by basepairing,the Tstrand is ligated to the target.At the same position a nick is introduced in the second strand of the target that defines the left breakpoint of target deletion and initiates the rep

32、lication of the Tstrand.Symbols used for presentation of putative recombination events are explained underneath the models.293.TDNA整合的遗传效应整合的遗传效应TDNA插入的遗传特性插入的遗传特性(1)TDNA的插入不引起植物的插入不引起植物DNA大的重排。但多数插入会导大的重排。但多数插入会导致靶位点处小的缺失，缺失多至致靶位点处小的缺失，缺失多至79个核苷酸。个核苷酸。(2)另一个常见的结果是，在另一个常见的结果是，在TDNA植物植物DNA连接处，会有连接处，会

33、有几个至几个至33个核苷酸的个核苷酸的“填充填充”DNA（Filler DNA）存在，这些）存在，这些“填充填充”DNA的序列与靠近连接处的植物的序列与靠近连接处的植物DNA序列相似。序列相似。(3)在植物靶位处不要求有特异的序列，但若在在植物靶位处不要求有特异的序列，但若在TDNA两端和两端和植物靶位处之间有一段短序列（植物靶位处之间有一段短序列（510b）同源，则可以在整合）同源，则可以在整合中起作用。中起作用。30五、农杆菌五、农杆菌TiTi质粒的改造及载体构建质粒的改造及载体构建 1、Ti质粒的改造及卸甲载体构建质粒的改造及卸甲载体构建 2、中间载体、中间载体/表达载体的构建表达载体的

34、构建 3、植物基因转化载体系统的构建、植物基因转化载体系统的构建311 1、TiTi质粒的改造及卸甲载体构建质粒的改造及卸甲载体构建 野生型Ti质粒直接作为植物基因工程载体，存在如下障碍Ti质粒分子量过大，一般在160240kb，基因工程中难以操作；大型的野生Ti质粒上分布着各种限制酶的多个切点，.难以找到可利用的单一限制性内切酶位点，不能通过体外DNA重组技术直接向野生型Ti质粒导入外源基因；TDNA区内含有许多编码基因，其中onc基因产物干扰宿主植物中内源激素的平衡，转化细胞长成肿瘤，阻碍细胞的分化和植株的再生；Ti质粒不能在大肠杆菌中复制,即使得到重组质粒，也只能在农杆菌中进行扩增；而农

35、杆菌的转化率极低（10左右）,因此，通过Ti质粒的体外操作，在常规分子克隆条件下几乎不能构建在TDNA中只有单一切点的载体；Ti质粒上还存在一些对于TDNA转移不起任何作用的基因。32 为了使为了使Ti质粒成为有效的外源基因导入载体，必须对野生质粒成为有效的外源基因导入载体，必须对野生型型Ti质粒进行一番科学的改造。十分幸运的是，大肠杆菌质粒进行一番科学的改造。十分幸运的是，大肠杆菌具有能与农杆菌高效地接合转移的特性。因此，科学家们具有能与农杆菌高效地接合转移的特性。因此，科学家们可以先将可以先将TDNA片段克隆到大肠杆菌的质粒中，并插入外片段克隆到大肠杆菌的质粒中，并插入外源基因，最后通过接

36、合转移把外源基因引入到农杆茵的源基因，最后通过接合转移把外源基因引入到农杆茵的Ti质粒上，这是一种把预先进行亚克隆、切除、插入或置换质粒上，这是一种把预先进行亚克隆、切除、插入或置换的的TDNA引入引入Ti质粒的有效方法。带有重组质粒的有效方法。带有重组TDNA的大肠的大肠杆菌质粒衍生载体称为杆菌质粒衍生载体称为”中间载体中间载体”（intermediate vector），而接受中间载体的），而接受中间载体的Ti质粒则称为受体质粒则称为受体Ti质粒质粒（acceptor Ti p1asmid），一般是卸甲载体（），一般是卸甲载体（disarmed vector）。）。332、onc卸甲载体卸

37、甲载体 所谓卸甲载体就是无毒的（所谓卸甲载体就是无毒的（nononcogenic）Ti质粒载体。因为质粒载体。因为利用野生型的利用野生型的Ti质粒作载体时，影响植株再生的直接原因是质粒作载体时，影响植株再生的直接原因是TDNA中中onc基因的致瘤作用。因此，为了使野生型的基因的致瘤作用。因此，为了使野生型的Ti质粒成为基因转质粒成为基因转化的载体，必须切除化的载体，必须切除TDNA上的上的onc基因，即基因，即“解除解除”其其“武装武装”,构建成所谓构建成所谓“卸甲卸甲”或称或称“缴械缴械”载体（载体（disarmed vector）。在）。在这种这种onc载体中，已经缺失的载体中，已经缺失的

38、TDNA部位被大肠杆菌的一种常用的部位被大肠杆菌的一种常用的质粒质粒pBR322取代。这样任何适合于克隆在取代。这样任何适合于克隆在 pBR322质粒中的外源质粒中的外源DNA片段，都可以通过与片段，都可以通过与 pBR322质粒质粒DNA的同源重组，而被共的同源重组，而被共整合到整合到OncTi质粒载体上。质粒载体上。34onc+卸甲载体卸甲载体 对于研究外源基因在转基因植株中的表达，以及对于以改良农作物为目的的植物基因工程而言，onc体系是最有用的。不过，人们可能还要设计一些特殊的实验来研究外源基因在冠瘿瘤组织中的表达问题。在这种情况下，使用onc+菌株载体则比较合适。由于冠瘿瘤组织具有不

39、依赖于激素的表型特征，所以这种载体系统的优点在于它可以快速地增生冠瘿组织，比较快速而容易得到转化体。35 2 2、中间载体的构建、中间载体的构建（1）中间载体的基本结构与特点）中间载体的基本结构与特点 为解决为解决Ti质粒不能直接导入目的基因的困难，构建质粒不能直接导入目的基因的困难，构建中间载体（中间载体（intermediate vector）是有效方法之一。）是有效方法之一。中间载体是一种在一个普通大肠杆菌的克隆载体中间载体是一种在一个普通大肠杆菌的克隆载体（例如（例如pBR322质粒）中插入了一段合适的质粒）中插入了一段合适的TDNA片片段，而构成的小型质粒。中间载体通常是多拷贝的段，

40、而构成的小型质粒。中间载体通常是多拷贝的E.Coli小质粒，这一点对于通过体外遗传操作导入小质粒，这一点对于通过体外遗传操作导入外源基因是非常必要的。从结构特点看可分为两类外源基因是非常必要的。从结构特点看可分为两类中间载体，即共整合系统中间载体和双元载体系统中间载体，即共整合系统中间载体和双元载体系统中间载体。中间载体。36共整合系统中间载体的特征中间载体必须含有与中间载体必须含有与Ti质粒质粒TDNA区同源的序列，此外含有区同源的序列，此外含有pBR的序列，的序列，在其被引入到根癌农杆菌后即可高频地与在其被引入到根癌农杆菌后即可高频地与Ti质粒的质粒的TDNA的同源序列进的同源序列进行重组

41、；行重组；它应具有一个或几个细菌选择标记，这将有利于筛选共整合质粒；它应具有一个或几个细菌选择标记，这将有利于筛选共整合质粒；它必须它必须 有有bom位点，在有诱导质粒存在的情况下，位点，在有诱导质粒存在的情况下，bom位点的存在可以位点的存在可以使中间载体在不同细菌细胞内进行转移；使中间载体在不同细菌细胞内进行转移；它应该含有阳性植物选择标记，以利于转化植物细胞的筛选，例如新霉它应该含有阳性植物选择标记，以利于转化植物细胞的筛选，例如新霉素磷酸转移酶素磷酸转移酶(neomycin phosphotransferase,Npt)基因，其可赋予转化基因，其可赋予转化植物细胞卡那霉素抗性；植物细胞

42、卡那霉素抗性；它应该含有单一的限制性内切酶切点，以利于外源基因的插入；它应该含有单一的限制性内切酶切点，以利于外源基因的插入；无无Ti质粒的边界序列。质粒的边界序列。37双元载体系统的中间载体 与共整合系统中间载体不同之处是与共整合系统中间载体不同之处是:无同源序列；无同源序列；具有具有LB和和RB;无无Co1E1复制点复制点 38（2）中间表达载体）中间表达载体启动子及其它调控序列启动子及其它调控序列 转录的调控对真核生物基因表达起着关键性作用。就真核生物基因表转录的调控对真核生物基因表达起着关键性作用。就真核生物基因表达调控序列而言，大多数真核生物在转录起始点的达调控序列而言，大多数真核生

43、物在转录起始点的5端上游区第端上游区第30至至25bp处具有处具有TATA盒，在盒，在70至至 80bp处还有处还有CAAT盒。在大多数真核生物基因的盒。在大多数真核生物基因的3端具有端具有AATAA序列。这些序列。这些5和和3端的调控序列对真核生物的基因表达起着端的调控序列对真核生物的基因表达起着关键性作用。关键性作用。Ti质粒虽然来源于农杆菌，质粒虽然来源于农杆菌，但其但其Nos、Ocs、Tmr等基因具有等基因具有与真核生物启动子类似的与真核生物启动子类似的TATA盒和盒和CAAT盒，均能在植物细胞中表达，并盒，均能在植物细胞中表达，并且无组织特异性。因此，它们成为早期构建嵌合基因的启动子

44、，其中以且无组织特异性。因此，它们成为早期构建嵌合基因的启动子，其中以Nos启动子（启动子（pNos）最常用。）最常用。39403、植物基因转化载体系统的构建、植物基因转化载体系统的构建（1）一元载体系统）一元载体系统（2）双元载体系统）双元载体系统411一元载体系统的构建这一类载体是中间表达载体与改造后的受体这一类载体是中间表达载体与改造后的受体Ti质粒之间，通过质粒之间，通过同源重组所产生的一种复合型载体，通常亦称为共整合载体同源重组所产生的一种复合型载体，通常亦称为共整合载体（cointergrated vecter），又由于该载体的），又由于该载体的TDNA区与区与Ti质粒质粒Vir区

45、连锁，因此又称之为顺式载体（区连锁，因此又称之为顺式载体（cisvector）。）。一元载体的特点是一元载体的特点是:由两个质粒（由两个质粒（E.coli质粒和质粒和Ti质粒）重组质粒）重组而成，分子量较大；共合体的形成频率与两个质粒的重组频而成，分子量较大；共合体的形成频率与两个质粒的重组频率有关率有关,相对较低；必须用相对较低；必须用Southern杂交或杂交或PCR对大的共整合对大的共整合体质粒进行检测；构建时比较困难。一元载体系统目前主要体质粒进行检测；构建时比较困难。一元载体系统目前主要有两种载体共整合载体和拼接未端载体（有两种载体共整合载体和拼接未端载体（splitend vect

46、or,SEV）。）。42（1）共整合载体的构建共整合载体的特点是中间表达载体与受体共整合载体的特点是中间表达载体与受体Ti卸甲载体，通过同源重组共整合而卸甲载体，通过同源重组共整合而构建；中间表达载体与受体构建；中间表达载体与受体Ti质粒之间同源序列是质粒之间同源序列是pBR322。共整合载体的构建过程共整合载体的构建过程 l）中间载体）中间载体pLGV1103导入农杆菌导入农杆菌:目前通常采用两种方法，即接合转移法目前通常采用两种方法，即接合转移法（conjugative transfer）和三亲杂交转移法。）和三亲杂交转移法。2）中间载体与受体）中间载体与受体Ti质粒的同源重组。质粒的同源

47、重组。3）共整合载体的选择。）共整合载体的选择。大肠杆菌质粒大肠杆菌筛选标记农杆菌筛选标记多克隆位点重组质粒转化大肠杆菌农杆菌细菌接合T-DNA区同源整合农杆菌感染植物根部细胞T-DNA区整合在植物细胞基因组上44（2）SEV的构建SEV系统即系统即TDNA边界拼接系统，亦称拼接末端载体（边界拼接系统，亦称拼接末端载体（sp1itend vecter,SEV）。它是由）。它是由Freley等人于等人于1985年建立的另一种共整合载体，也年建立的另一种共整合载体，也因为它的两个因为它的两个LIH序列在同源重组前分别处于不同质粒上而得名。序列在同源重组前分别处于不同质粒上而得名。SEV与与pGV3

48、850的差异及构建过程如下述的差异及构建过程如下述1）SEV的受体的受体Ti质粒的质粒的TDNA上的致瘤基因（上的致瘤基因（onc）及）及TR都已被缺失，都已被缺失，TDNA的保留部分被称为的保留部分被称为“左边界内部同源区左边界内部同源区”（1eft inside homcology，LIH）。该受体）。该受体Ti质粒还保留了质粒还保留了Vir基因及其它正常的功能基因，同时还携有基因及其它正常的功能基因，同时还携有用于细菌筛选的抗性基因。用于细菌筛选的抗性基因。2）SEV中间载体具有一个细菌的抗性基因，一个植物抗性基因及与受体中间载体具有一个细菌的抗性基因，一个植物抗性基因及与受体Ti质粒同

49、源的质粒同源的LIH序列及序列及TR。3）通过三亲杂交将中间载体导入农杆菌后，由于它们之间都具有）通过三亲杂交将中间载体导入农杆菌后，由于它们之间都具有LIH同源同源序列，即可发生同源重组，形成序列，即可发生同源重组，形成SEV的共整合载体。的共整合载体。45At the position where the 3 end of the Tstrand is stabilized by basepairing,the Tstrand is ligated to the target.但多数插入会导致靶位点处小的缺失，缺失多至79个核苷酸。1）SEV的受体Ti质粒的TDNA上的致瘤基因（onc）及

50、TR都已被缺失，TDNA的保留部分被称为“左边界内部同源区”（1eft inside homcology，LIH）。2）MiniTi质粒具有E.将Mini Ti质粒转入含有He1per Ti质粒根癌农杆菌的途径有两条，一条是直接用纯化的Mini Ti质粒转化速冻的根癌农杆菌感受态细胞；3、植物基因转化载体系统的构建植物或农杆菌中可能有甲基化或去甲基化的调节基因活性。两者之间的距离常随Ti质粒类型不同而有差异。已知农杆菌附着到植物细胞后，只留在细胞间隙中。农杆菌素碱型（agrocinopine）或称琥珀碱型(succinamopine)1）它们的受体Ti质粒与中间载体的结构不同。（3）Con区（