微生物优良菌种的选育课件讲义.ppt

1、第四章第四章 微生物优良菌种的选育微生物优良菌种的选育微生物发酵的一般流程种子扩大培养种子扩大培养培养基配制培养基配制空气除菌空气除菌培养基灭菌培养基灭菌发酵生产发酵生产下游处理下游处理发酵设备发酵设备提纲提纲微生物优良生产菌种的特征微生物优良生产菌种的特征自然突变选育自然突变选育诱变选育诱变选育 原理原理 基本方法基本方法杂交育种杂交育种 细菌细菌 放线菌放线菌 霉菌霉菌 酵母菌酵母菌原生质体融合原生质体融合基因工程技术基因工程技术 基因表达系统基因表达系统 利用大肠杆菌的基因表达系统利用大肠杆菌的基因表达系统 利用酵母菌的基因表达系统利用酵母菌的基因表达系统 基因工程菌的稳定性基因工程菌的

2、稳定性优良菌种应具备的特征优良菌种应具备的特征对菌种的要求对菌种的要求 天然菌种的生产性能较低，一般需要进行选育。天然菌种的生产性能较低，一般需要进行选育。1.生产力：生产力：能在廉价的培养基上迅速生长，所需的代谢产能在廉价的培养基上迅速生长，所需的代谢产 物的产量高，其它代谢产物少物的产量高，其它代谢产物少2.操作性：操作性：培养条件简单，发酵易控制，产品易分离培养条件简单，发酵易控制，产品易分离3.稳定性：稳定性：抗噬菌体能力强，菌种纯，不易变异退化抗噬菌体能力强，菌种纯，不易变异退化4.安全性：安全性：是非病源菌，不产有害生物活性物质或毒素是非病源菌，不产有害生物活性物质或毒素优良菌种应

3、具备的特征优良菌种应具备的特征选择生产菌种应注意的因素1.原料方面原料方面：广，转化率高；：广，转化率高；2.产物方面产物方面：目的产物含量高，副产物少；：目的产物含量高，副产物少；3.菌体方面菌体方面：生长快、繁殖力强，耐受力强，：生长快、繁殖力强，耐受力强，抗污染、抗噬菌体能力强，遗传特性稳定抗污染、抗噬菌体能力强，遗传特性稳定4.设备方面设备方面：产泡沫少，适宜大罐生产。：产泡沫少，适宜大罐生产。（培养条件异，周期短，需氧量小，抗污染能力强（培养条件异，周期短，需氧量小，抗污染能力强）一、自然选育一、自然选育利用微生物自然突变进行的菌种选育。利用微生物自然突变进行的菌种选育。原因原因：多

4、因素低剂量的诱变效应；：多因素低剂量的诱变效应；互变异构效应互变异构效应结果结果：负变大于正变，应经常分离纯化：负变大于正变，应经常分离纯化方法方法：菌悬液：菌悬液平板分离平板分离上摇瓶上摇瓶检测检测选种选种保藏保藏l优点：简单易行，可与生产同步进行。优点：简单易行，可与生产同步进行。l缺点：频率低，缺点：频率低，10-810-9/次分裂。次分裂。二、诱变选育二、诱变选育诱导微生物发生突变进行的菌种选育，包诱导微生物发生突变进行的菌种选育，包括括诱变诱变和和筛选筛选两个步骤。两个步骤。原理原理：染色体畸变；基因突变。：染色体畸变；基因突变。影响诱变的因素：影响诱变的因素：出发菌株（有一定生产能

5、力，形态、生理强壮）出发菌株（有一定生产能力，形态、生理强壮）；诱变剂的种类（单一或复合）与剂量（不宜过高和过诱变剂的种类（单一或复合）与剂量（不宜过高和过 低，致死率：低，致死率：70-80）。）。诱变剂：能提高基因突变频率的物理、化学、生物因子。诱变剂：能提高基因突变频率的物理、化学、生物因子。筛选比诱变更重要。筛选比诱变更重要。筛选的方法：通过选择筛选的方法：通过选择/鉴别培养基加以识别。鉴别培养基加以识别。初筛初筛复筛复筛确定最佳发酵条件（负变多，正变少）确定最佳发酵条件（负变多，正变少）、营养缺陷型突变株筛选、营养缺陷型突变株筛选酶缺陷，结果造成中间产物积累；酶缺陷，结果造成中间产物

6、积累；解除协同反馈，使另一分支末端产物积累；解除协同反馈，使另一分支末端产物积累；渗漏型突变（酶未完全丧失活性，下降），末渗漏型突变（酶未完全丧失活性，下降），末端产物少，中间产物积累。端产物少，中间产物积累。、抗反馈阻遏和抗反馈抑制、抗反馈阻遏和抗反馈抑制突变株筛选突变株筛选调节基因或操纵基因突变，产生的阻遏调节基因或操纵基因突变，产生的阻遏蛋白与终产物不能结合或结合；蛋白与终产物不能结合或结合；结合，但不发生作用；结合，但不发生作用；结构基因突变，使结构酶无结合能力但结构基因突变，使结构酶无结合能力但有催化活性；有催化活性；方法方法：末端产物结构类似物筛选；（未突变者：末端产物结构类似物筛

7、选；（未突变者 死，突变为抗者，生并产菌落）死，突变为抗者，生并产菌落）营养缺陷型回复突变株筛选。营养缺陷型回复突变株筛选。（活性复，结构改变）（活性复，结构改变）、组成型突变株筛选、组成型突变株筛选 诱导型依赖诱导物。组成型不依赖诱导物。诱导型依赖诱导物。组成型不依赖诱导物。突变发生在调节基因或操纵基因突变发生在调节基因或操纵基因,解除对解除对诱导物的依赖诱导物的依赖,可获组成型突变株。可获组成型突变株。筛选方法：设计条件使组成型优势生长，筛选方法：设计条件使组成型优势生长，或通过菌落分辨。或通过菌落分辨。加诱导酶合成抑制物加诱导酶合成抑制物交替培养法交替培养法显色反应法显色反应法筛选方法筛

8、选方法加诱导酶合成抑制物加诱导酶合成抑制物 如：加邻硝基如：加邻硝基-D-岩藻糖苷，抑制岩藻糖苷，抑制-半乳糖苷酶合成。半乳糖苷酶合成。诱导型不能利用乳糖，不长；组成型产酶，能利用乳糖，诱导型不能利用乳糖，不长；组成型产酶，能利用乳糖，生长，被富集。生长，被富集。交替培养法交替培养法 含诱导物（乳糖）中培养含诱导物（乳糖）中培养组成型快组成型快不含诱导不含诱导 物（葡萄糖）中培养物（葡萄糖）中培养诱导型失酶诱导型失酶反复。反复。显色反应法显色反应法 不含诱导物平板培养不含诱导物平板培养加底物加底物分解（有颜色变分解（有颜色变 化）化）检出。检出。.抗（敏感）性突变株筛选抗（敏感）性突变株筛选包

9、括：抗生素、金属离子、温度、噬菌体包括：抗生素、金属离子、温度、噬菌体 抗生素抗性突变：抗生素抗性突变：提高产量；提高产量；抗噬菌体突变：抗噬菌体突变：消除噬菌体污染；消除噬菌体污染；（与噬菌体存在与否无关）（与噬菌体存在与否无关）条件抗性突变：条件抗性突变：如温度，可提高产量；如温度，可提高产量；（温度敏感突变，高温呈营养缺陷表型）（温度敏感突变，高温呈营养缺陷表型）物敏突变：物敏突变：如：氟乙酸抑制顺乌头酸酶，氟乙酸敏感突变型，如：氟乙酸抑制顺乌头酸酶，氟乙酸敏感突变型，顺乌头酸酶活性极低，更敏感，异柠檬酸产量顺乌头酸酶活性极低，更敏感，异柠檬酸产量少，柠檬酸积累。少，柠檬酸积累。三、三、

10、杂交育种杂交育种 长期诱变会使菌种生活能力下降。长期诱变会使菌种生活能力下降。借助有性重组，使不同菌株的遗传物质借助有性重组，使不同菌株的遗传物质 得以交换（获优良性状集中的重组体）。得以交换（获优良性状集中的重组体）。1.细菌的杂交育种细菌的杂交育种方法方法：转化、转导、：转化、转导、F因子转导、因子转导、R因子转移、接因子转移、接 合。获部分合子。合。获部分合子。出发菌株需带遗传标记出发菌株需带遗传标记：营养缺陷、抗生素抗性、：营养缺陷、抗生素抗性、温敏、发酵性能温敏、发酵性能、放线菌的杂交育种、放线菌的杂交育种 基因重组过程近似细菌，育种方法与霉菌相似基因重组过程近似细菌，育种方法与霉菌

11、相似放线菌的遗传体系和杂交原理：放线菌的遗传体系和杂交原理：异核现象：同一细胞（菌丝）含不同基因型的核。无异核现象：同一细胞（菌丝）含不同基因型的核。无 重组体出现。重组体出现。接合现象：发生部分染色体转移（交换），形成部分接合现象：发生部分染色体转移（交换），形成部分 合子。整合子。整+部分、部分部分、部分+部分。部分。异核系的形成：部分合子产生的无性繁殖系。能在基异核系的形成：部分合子产生的无性繁殖系。能在基 本或选择培养基上生长。本或选择培养基上生长。（单交换，二体区）（单交换，二体区）重组体的形成：异核系不稳定，可经过双交换形成重重组体的形成：异核系不稳定，可经过双交换形成重 组子，产

12、生重组子孢子。组子，产生重组子孢子。放线菌的杂交方法放线菌的杂交方法混合培养法：两互补缺陷型亲株混合培养，制孢混合培养法：两互补缺陷型亲株混合培养，制孢 子悬液，选择性平板分离。子悬液，选择性平板分离。平板杂交法：一亲株培养，形成孢子，影印至已平板杂交法：一亲株培养，形成孢子，影印至已 分别铺有另几种孢子的平板上，获分别铺有另几种孢子的平板上，获 孢子后再影印至选择平板上。孢子后再影印至选择平板上。玻璃纸转移法：两亲本需要双标记，混合带纸培玻璃纸转移法：两亲本需要双标记，混合带纸培 养，未长气生菌丝时，纸移至一选养，未长气生菌丝时，纸移至一选 择平板，获异核系。解剖镜下，小择平板，获异核系。解

13、剖镜下，小 针收集小菌丝，于完全平板涂布，针收集小菌丝，于完全平板涂布，获分离子。获分离子。、霉菌的杂交育种、霉菌的杂交育种 准性生殖过程：不通过有性生殖的基因重组过程准性生殖过程：不通过有性生殖的基因重组过程异核体的形成：两不同性状细胞（菌丝）连接，导致一异核体的形成：两不同性状细胞（菌丝）连接，导致一细胞存在两个不同遗传型核。细胞存在两个不同遗传型核。杂合二倍体形成；异核体偶尔发生不同核的融合，形成杂合二倍体形成；异核体偶尔发生不同核的融合，形成杂合核，为双倍体。杂合核，为双倍体。菌丝成斑点、扇面菌丝成斑点、扇面扇变。扇变。体细胞重组：杂合二倍体只具有相对稳定性，繁殖过程体细胞重组：杂合二

14、倍体只具有相对稳定性，繁殖过程发生染色体交换，单倍化，形成各种分发生染色体交换，单倍化，形成各种分离子。离子。准性生殖的单倍体化是一个渐变过程，需要多次分准性生殖的单倍体化是一个渐变过程，需要多次分裂，形成双倍体、非整倍体、单倍体等分离子。裂，形成双倍体、非整倍体、单倍体等分离子。霉菌的杂交技术霉菌的杂交技术 诱变获具标记的亲本。诱变获具标记的亲本。异核体的形成：基本培养基上，强迫进行异核体的形成：基本培养基上，强迫进行营养互补。还可用多种方法。营养互补。还可用多种方法。双倍体检出：可从扇面上挑孢子分离。双倍体检出：可从扇面上挑孢子分离。分离子检出：杂合二倍体单孢子平板分分离子检出：杂合二倍体

15、单孢子平板分离，检菌落斑点或扇面，斑点处挑孢离，检菌落斑点或扇面，斑点处挑孢子至斜面，再纯化鉴别。子至斜面，再纯化鉴别。、酵母菌的杂交育种、酵母菌的杂交育种双单特性双单特性：存在单倍体和二倍体的生活史：存在单倍体和二倍体的生活史二倍体生活力强，生产能力高，可二倍体生活力强，生产能力高，可通过杂交得二倍体来育种通过杂交得二倍体来育种。方法方法：获单倍体细胞；杂交。：获单倍体细胞；杂交。杂交方式：孢子与孢子；孢子与单倍体细胞；杂交方式：孢子与孢子；孢子与单倍体细胞；单倍体细胞间。单倍体细胞间。四、原生质体融合育种四、原生质体融合育种借助原生质融合技术实现遗传物质的交换借助原生质融合技术实现遗传物质

16、的交换.原生质体融合的优越性：原生质体融合的优越性：受限制小；受限制小；重组频率高；重组频率高；遗传物质传递更充分；遗传物质传递更充分；可先用理化因子处理；可先用理化因子处理；其诱变率更高。其诱变率更高。.原生质体融合法：原生质体融合法：原生质体制备原生质体制备 原生质体融合和再生原生质体融合和再生 融合子的检出融合子的检出.原生质体融合技术在微生物育种中的应用：原生质体融合技术在微生物育种中的应用：选育高产优质菌株选育高产优质菌株 产生新的产物产生新的产物五、基因工程育种五、基因工程育种 定向育种，技术含量高，应用面广。定向育种，技术含量高，应用面广。应用：应用：解决了一些药物或材料来源困难

17、，或制造技术复解决了一些药物或材料来源困难，或制造技术复杂，或造价昂贵而无法大量生产和应用的问题。杂，或造价昂贵而无法大量生产和应用的问题。产生了巨大的经济和社会效益。产生了巨大的经济和社会效益。工业生产的意义：工业生产的意义：基因的表达产量；基因的表达产量；表达产物的稳定性；表达产物的稳定性；产物的生物活性；产物的生物活性；产物分离纯化。产物分离纯化。（一）基因表达系统（一）基因表达系统 从育种的角度考虑从育种的角度考虑,最重要的是目的基因的高效表达。最重要的是目的基因的高效表达。.原核表达系统；原核表达系统；.真核表达系统真核表达系统、原核表达系统、原核表达系统原核生物不适宜表达需后加工处

18、理的那一部分真核基因原核生物不适宜表达需后加工处理的那一部分真核基因 不能切除不能切除mRNA的内含子；的内含子；不能进行蛋白质的糖基化；不能进行蛋白质的糖基化；不能对氨基酸进行修饰。不能对氨基酸进行修饰。大肠杆菌：大肠杆菌：遗传背景清楚；基因操作简便；遗传背景清楚；基因操作简便；易培养，世代短，生长快；适宜大规模生产易培养，世代短，生长快；适宜大规模生产注意：注意：真核蛋白后修饰；真核蛋白后修饰；多为胞内产物；产物分离纯多为胞内产物；产物分离纯 化困难；内毒素；蛋白酶破坏产物；免疫反应。化困难；内毒素；蛋白酶破坏产物；免疫反应。枯草芽孢杆菌：枯草芽孢杆菌：分泌能力强；胞外蛋白酶强分泌能力强；

19、胞外蛋白酶强链霉菌：链霉菌：使用安全；分泌能力强；具有糖基化能力使用安全；分泌能力强；具有糖基化能力、真核表达系统、真核表达系统产生的蛋白质与天然蛋白质具有一致的生理生化功能产生的蛋白质与天然蛋白质具有一致的生理生化功能酵母：酵母：真核生物蛋白质的最佳表达系统真核生物蛋白质的最佳表达系统 优点：优点：基因组小，操作方便；基因组小，操作方便；世代周期短，易培养；世代周期短，易培养；有单、双倍体形式；能糖基化；能分泌产物到胞外。有单、双倍体形式；能糖基化；能分泌产物到胞外。应用：应用：干扰素、乙肝表面抗原基因已经成功表达；干扰素、乙肝表面抗原基因已经成功表达；酿酒酵母研究、应用最广泛。酿酒酵母研究

20、、应用最广泛。丝状真菌：丝状真菌：特点：特点：能进行翻译后加工；能进行翻译后加工；表达产物分泌能力强；表达产物分泌能力强；安全；安全；发酵、纯化工艺成熟。发酵、纯化工艺成熟。（二）利用大肠杆菌的基因表达系统（二）利用大肠杆菌的基因表达系统.表达载体表达载体条件：条件：能独立复制；能独立复制；有灵活的多克隆位点和方便的筛选标记，位点位有灵活的多克隆位点和方便的筛选标记，位点位 于于 起动子后；起动子后；有很强的起动子，能被大肠杆菌的有很强的起动子，能被大肠杆菌的RNA聚合酶识别；聚合酶识别；有使起动子受抑制的阻遏子，受诱导时才转录，可人有使起动子受抑制的阻遏子，受诱导时才转录，可人 为的通过理化

21、因素选择启动时机；为的通过理化因素选择启动时机；有很强的终止子，使有很强的终止子，使RNA聚合酶集中力量转录克隆聚合酶集中力量转录克隆 的外源基因；克服质粒高转录引起的质粒不稳定。的外源基因；克服质粒高转录引起的质粒不稳定。产生的产生的mRNA须有翻译的起始信号，即起始密码须有翻译的起始信号，即起始密码 AUG和和SD序列。序列。、影响目的基因在大肠杆菌中表达的因素、影响目的基因在大肠杆菌中表达的因素 目的基因的表达产量与每个细胞平均表达量目的基因的表达产量与每个细胞平均表达量和细胞浓度正相关。和细胞浓度正相关。影响因素：影响因素：外源基因的拷贝数；外源基因的拷贝数；外源基因的表达频率：外源基

22、因的表达频率：启动子的强度；启动子的强度；AUG和和SD序列的间距；序列的间距；密码子的组成；核糖体结合位点的有效性密码子的组成；核糖体结合位点的有效性表达产物的稳定性；表达产物的稳定性；细胞的代谢负荷。细胞的代谢负荷。、在大肠杆菌中真核基因的表达形式、在大肠杆菌中真核基因的表达形式融合蛋白：融合蛋白：N端原核序列，端原核序列，C端真核序列端真核序列表达高效、稳定，但影响免疫原性，可酶切。表达高效、稳定，但影响免疫原性，可酶切。非融合蛋白：非融合蛋白：保持生物活性，但易被水解保持生物活性，但易被水解 N端常带甲硫氨酸，引起人体免疫反应。端常带甲硫氨酸，引起人体免疫反应。分泌表达蛋白：分泌表达蛋

23、白：使外源基因位于原核蛋白使外源基因位于原核蛋白 信号肽下游（连接、构建）。信号肽下游（连接、构建）。在周质空间酶切，释放产物。在周质空间酶切，释放产物。（三）利用酵母菌的基因表达系统（三）利用酵母菌的基因表达系统.载体系统：载体系统：多用穿梭载体，同时带有细菌和酵多用穿梭载体，同时带有细菌和酵母复制原点和选择标记，在两者中复制、选择。母复制原点和选择标记，在两者中复制、选择。克隆载体的复制序列克隆载体的复制序列酵母附加质粒酵母附加质粒(YEP)酵母复制型质粒酵母复制型质粒(YRP)酵母着丝粒质粒酵母着丝粒质粒(YCP)酵母整合型质粒酵母整合型质粒(YIP).载体系统载体系统表达载体表达载体

24、在克隆载体中插入酵母表达盒和终止子等调控序列在克隆载体中插入酵母表达盒和终止子等调控序列,即即可构建酵母表达载体。可构建酵母表达载体。需糖基化才有生物功能的重组蛋白必须是分泌型蛋白需糖基化才有生物功能的重组蛋白必须是分泌型蛋白.要在外源要在外源DNA上游加前导肽序列。上游加前导肽序列。用啤酒酵母表达分泌型外源蛋白时，要求前导肽用啤酒酵母表达分泌型外源蛋白时，要求前导肽C端是端是赖赖精，其内切酶可识，切。精，其内切酶可识，切。如：水蛭素（强抗凝剂，溶栓药物）用如：水蛭素（强抗凝剂，溶栓药物）用al因子前导肽因子前导肽（编码酵母交配类型因子的前导肽）基因附加型质粒载体，（编码酵母交配类型因子的前导

25、肽）基因附加型质粒载体，在酵母细胞中成功表达。在酵母细胞中成功表达。、影响外源基因在酵母中表达的因、影响外源基因在酵母中表达的因素素外源基因的拷贝数：外源基因的拷贝数：拷贝数，稳定性，整合位置；拷贝数，稳定性，整合位置；外源基因的表达频率：外源基因的表达频率：启动子：启动子：有上游激活序列、有上游激活序列、TATA序列、起始密码子；序列、起始密码子；分泌信号：分泌信号：包括信号肽、前导肽序列；包括信号肽、前导肽序列；终止序列：终止序列：合成基因须加或利用载体上的；合成基因须加或利用载体上的；外源蛋白的糖基化：外源蛋白的糖基化：分泌过程中发生分泌过程中发生N-糖苷键和糖苷键和O-糖糖苷键连接的两

26、种糖基化，其产物与天然产物完全相同苷键连接的两种糖基化，其产物与天然产物完全相同宿主菌株的影响：宿主菌株的影响：生长力强、内源蛋白酶弱、性能稳生长力强、内源蛋白酶弱、性能稳定、分泌力强，用二、多倍体。定、分泌力强，用二、多倍体。（四）基因工程菌的稳定性（四）基因工程菌的稳定性分裂不稳定：分裂时，出现一定比例不含质粒的子代菌；分裂不稳定：分裂时，出现一定比例不含质粒的子代菌；结构不稳定：指外源基因从质粒上丢失、碱基重排或缺失。结构不稳定：指外源基因从质粒上丢失、碱基重排或缺失。1.产生原因产生原因：（常见是分裂不稳定）：（常见是分裂不稳定）产不含质粒的子代菌的频率；产不含质粒的子代菌的频率；两种

27、菌的比生长速率。两种菌的比生长速率。质粒拷贝数低时，可增加，但不宜太高（生长负势质粒拷贝数低时，可增加，但不宜太高（生长负势）。）。条件有利，高比生长速率，拷贝数降低，但更稳定条件有利，高比生长速率，拷贝数降低，但更稳定。质粒拷贝数过高，增加转录、翻译负担，产物未必增加。质粒拷贝数过高，增加转录、翻译负担，产物未必增加。2.提高质粒稳定性的方法提高质粒稳定性的方法：两段培养法（先长菌，后表达）；两段培养法（先长菌，后表达）；控制培养条件（温度、控制培养条件（温度、PH、培养基组分、溶解氧）。、培养基组分、溶解氧）。本章知识结构本章知识结构1、微生物优良生产菌种的特征、微生物优良生产菌种的特征2、自然突变选育、自然突变选育3、诱变选育诱变选育4、杂交育种杂交育种5、原生质体融合、原生质体融合 6、基因工程技术基因工程技术预习内容预习内容菌种的保藏菌种的保藏斜面保藏菌种斜面保藏菌种沙土管保藏菌种沙土管保藏菌种