柠檬酸发酵机制课件.ppt

1、第四章第四章 柠檬酸发酵机制柠檬酸发酵机制 柠檬酸又名枸橼酸，学名柠檬酸又名枸橼酸，学名-羟基丙烷三羧酸，是生羟基丙烷三羧酸，是生物体主要代谢产物之一。物体主要代谢产物之一。性质：性质：分子式分子式C C6 6H H8 8O O7 7，分子量，分子量192.12 192.12 有两种形式有两种形式 水合物：水合物：100100时融解，密度时融解，密度1.542g/cm3(18)1.542g/cm3(18)无水物：无色晶体或粉末，熔点无水物：无色晶体或粉末，熔点153 153 有强酸味。溶于水、乙醇和乙醚有强酸味。溶于水、乙醇和乙醚 用途：用途：1 1）食品行业）食品行业 2 2）医药行业）医药

2、行业 3 3）化工行业）化工行业 4 4）其它行业）其它行业 柠檬酸的生产：柠檬酸的生产：18741874年首次从柠檬汁中提出柠檬酸并结晶年首次从柠檬汁中提出柠檬酸并结晶成固体；成固体；19131913年首次实现利用黑曲霉发酵生成年首次实现利用黑曲霉发酵生成柠檬酸。柠檬酸。一、柠檬酸合成途径一、柠檬酸合成途径葡萄糖葡萄糖丙酮酸丙酮酸柠檬酸柠檬酸乙酰乙酰-CoA-CoA草酰乙酸草酰乙酸EMPEMP途径途径氧化脱羧氧化脱羧羧化羧化 19531953年年，JagnnathanJagnnathan等证实了黑曲霉中等证实了黑曲霉中存在存在EMPEMP途径的所有酶；途径的所有酶；19541954年年，Sh

3、uShu提出葡萄糖分解代谢中约提出葡萄糖分解代谢中约8080走走EMPEMP途径；途径；19581958年年，MeDomoughMeDomough等发现黑曲霉还存在等发现黑曲霉还存在HMPHMP途径的酶，但途径的酶，但HMPHMP途径主要存在于孢子形成途径主要存在于孢子形成阶段；阶段；1954195419551955年年，RamakrishmanRamakrishman和和MartinMartin研研究发现黑曲霉中存在三羧酸循环；究发现黑曲霉中存在三羧酸循环；淀粉淀粉葡萄糖葡萄糖6-6-磷酸果糖磷酸果糖1 1，6-6-二磷酸果糖二磷酸果糖磷酸丙糖磷酸丙糖磷酸烯醇丙酮酸磷酸烯醇丙酮酸丙酮酸丙酮酸

4、乙酰乙酰CoACoA苹果酸苹果酸草酰乙酸草酰乙酸柠檬酸柠檬酸顺乌头酸顺乌头酸异柠檬酸异柠檬酸-酮戊二酸酮戊二酸琥珀酸琥珀酸富马酸富马酸CO2CO2Fe2+CO2CO2CO2CO2 存在两个存在两个COCO2 2固定系统（需固定系统（需MgMg2 2、K K）：）：1 1）丙酮酸（）丙酮酸（PYRPYR）在丙酮酸羧化酶作）在丙酮酸羧化酶作用下，生成草酰乙酸（此作用更强）用下，生成草酰乙酸（此作用更强）2 2）磷酸烯醇丙酮酸（）磷酸烯醇丙酮酸（PEPPEP）在）在PEPPEP激激酶的作用下，生成草酰乙酸酶的作用下，生成草酰乙酸碳平衡和能量平衡C6H12O6EMP途径途径2ADP2ATP2H29AD

5、P9ATP2C3H4O3丙酮酸脱羧丙酮酸脱羧CO2固定固定C4C2缩合缩合H2O3/2O23H2OC6H8O7柠檬酸柠檬酸（一）、糖酵解及丙酮酸代谢的调节（一）、糖酵解及丙酮酸代谢的调节 1 1、正常情况下，柠檬酸、正常情况下，柠檬酸、ATPATP对磷酸果糖激酶有抑对磷酸果糖激酶有抑制作用，而制作用，而AMPAMP、无机磷、铵离子对该酶则有激活、无机磷、铵离子对该酶则有激活作用，特别是还能解除柠檬酸、作用，特别是还能解除柠檬酸、ATPATP对磷酸果糖激对磷酸果糖激酶的抑制作用。酶的抑制作用。铵离子浓度与柠檬酸生成速度有密切关系，正铵离子浓度与柠檬酸生成速度有密切关系，正是由于细胞内浓度升高，使

6、磷酸果糖激酶对细胞内是由于细胞内浓度升高，使磷酸果糖激酶对细胞内积累的大量柠檬酸不敏感。积累的大量柠檬酸不敏感。二、柠檬酸生物合成的代谢调节二、柠檬酸生物合成的代谢调节淀粉淀粉葡萄糖葡萄糖6-6-磷酸果糖磷酸果糖1 1，6-6-二磷酸果糖二磷酸果糖磷酸丙糖磷酸丙糖磷酸烯醇丙酮酸磷酸烯醇丙酮酸丙酮酸丙酮酸乙酰乙酰CoACoA草酰乙酸草酰乙酸柠檬酸柠檬酸CO2CO2CO2CO2CO2CO2NH4+PiK+AMPATP 2.比较底物锰充足、锰缺乏时分批培养物的最大活力时发现，锰缺乏时黑曲霉的组成（合成）代谢受损伤，这与柠檬酸的积累有关。锰缺乏时，细胞内NH4 浓度高，Aa浓度高（蛋白合成受阻，导致升

7、高）。因此，锰离子效应是通过NH4升高而减少柠檬酸对磷酸果糖激酶的抑制来实现的。3.3.丙酮酸激酶是丙酮酸激酶是EMPEMP途径的第途径的第2 2个调节点，在某个调节点，在某些真菌得到证实，但黑曲霉未被证实。些真菌得到证实，但黑曲霉未被证实。（二）（二）TCATCA循环的调节循环的调节 1 1、TCATCA环的起始酶：柠檬酸合成酶是一种调节酶。环的起始酶：柠檬酸合成酶是一种调节酶。但在但在黑曲霉中，柠檬酸合成酶没有调节作用，这是黑曲霉黑曲霉中，柠檬酸合成酶没有调节作用，这是黑曲霉TCATCA环的第一个特点。环的第一个特点。顺乌头酸酶失活，阻断顺乌头酸酶失活，阻断TCATCA环是柠檬酸积累的必要

8、条件，环是柠檬酸积累的必要条件，顺乌头酸水合酶需要顺乌头酸水合酶需要FeFe2 2。顺乌头酸酶、异柠檬酸酶在。顺乌头酸酶、异柠檬酸酶在pH2.0pH2.0时失活，线粒体顺乌头酸酶在催化时有柠檬酸：顺时失活，线粒体顺乌头酸酶在催化时有柠檬酸：顺乌头酸：异柠檬酸乌头酸：异柠檬酸=90=90：3 3：7 7的平衡，这个平衡可能就是的平衡，这个平衡可能就是造成柠檬酸的最初积累而使造成柠檬酸的最初积累而使pHpH值降低。值降低。2.2.第二个特点：黑曲霉菌体内第二个特点：黑曲霉菌体内-酮戊二酸脱氢酶缺失酮戊二酸脱氢酶缺失或活力很低（或活力很低（TCATCA环被阻断），它被葡萄糖和环被阻断），它被葡萄糖和

9、NHNH4 4抑抑止止。（。（是是TCATCA循环中唯一不可逆的反应步骤循环中唯一不可逆的反应步骤）3.3.氧和氧和pHpH值对柠檬酸发酵的影响很大。值对柠檬酸发酵的影响很大。氧是发酵过程（氧是发酵过程（EMPEMP途径和丙酮酸脱氢）生成的途径和丙酮酸脱氢）生成的NADHNADH2 2重新氧化时所需重新氧化时所需 标准呼吸链产生标准呼吸链产生ATPATP积累，侧呼吸链不产生积累，侧呼吸链不产生ATPATP，缺氧，缺氧导致侧呼吸链失活，使导致侧呼吸链失活，使ATPATP积累，柠檬酸积累减少。积累，柠檬酸积累减少。磷酸烯醇丙糖酸磷酸烯醇丙糖酸丙酮酸丙酮酸乙酰乙酰CoACoA苹果酸苹果酸草酰乙酸草酰

10、乙酸柠檬酸柠檬酸顺乌头酸顺乌头酸异柠檬酸异柠檬酸-酮戊二酸酮戊二酸琥珀酸琥珀酸富马酸富马酸CO2CO2Fe2+CO2CO2COCO2 2抑制抑制-酮戊二酸脱氢酶系酮戊二酸脱氢酶系TCATCA循环在柠檬酸积累中所起作用可归纳为：循环在柠檬酸积累中所起作用可归纳为：（1 1）大量生成草酰乙酸是积累柠檬酸的关键）大量生成草酰乙酸是积累柠檬酸的关键（2 2）丙酮酸羧化酶和柠檬酸合成酶基本上不受代）丙酮酸羧化酶和柠檬酸合成酶基本上不受代谢调节的控制或其控制及微弱，而且这两个反应谢调节的控制或其控制及微弱，而且这两个反应的平衡保证了草酰乙酸的提供，增加了柠檬酸的的平衡保证了草酰乙酸的提供，增加了柠檬酸的合

11、成能力合成能力 （3 3）TCATCA循环的阻断微弱，导致循环循环的阻断微弱，导致循环中间代谢物积累。由于各种酶处于平衡中间代谢物积累。由于各种酶处于平衡状态，使柠檬酸积累，当柠檬酸浓度超状态，使柠檬酸积累，当柠檬酸浓度超过一定水平时，就通过抑止异柠檬酸脱过一定水平时，就通过抑止异柠檬酸脱氢酶活力来提高自身的积累。氢酶活力来提高自身的积累。柠檬酸的积累机制归纳：柠檬酸的积累机制归纳：MnMn抑制蛋白抑制蛋白合成合成NHNH4 4解除磷酸果糖解除磷酸果糖激酶激酶的代谢调节，促进的代谢调节，促进EMPEMP途径的畅通途径的畅通有一条呼吸活力强的不产生有一条呼吸活力强的不产生ATPATP的的侧系呼吸

12、链侧系呼吸链 由于丙酮酸羧化酶是组成型酶，不被调节控制。由于丙酮酸羧化酶是组成型酶，不被调节控制。2+缺乏缺乏 丙酮酸氧化脱羧生成乙酰丙酮酸氧化脱羧生成乙酰CoACoA和和CO2CO2固定两个固定两个反应的平衡，以及柠檬酸合成酶不被调节，增反应的平衡，以及柠檬酸合成酶不被调节，增强了合成柠檬酸的能力。强了合成柠檬酸的能力。由于顺乌头酸水合酶在催化时建立了以下平由于顺乌头酸水合酶在催化时建立了以下平衡：衡：柠檬酸：顺乌头酸：异柠檬酸柠檬酸：顺乌头酸：异柠檬酸=90=90：3 3：7 7 同时控制同时控制FeFe2+2+含量时，顺乌头酸酶活力降低，含量时，顺乌头酸酶活力降低，使柠檬酸积累。使柠檬酸

13、积累。随着柠檬酸积累，随着柠檬酸积累，pHpH降低到一定程度时，降低到一定程度时，使顺乌头酸酶和异柠檬酸脱氢酶失活，使顺乌头酸酶和异柠檬酸脱氢酶失活，更有利于柠檬酸的积累及排出细胞外。更有利于柠檬酸的积累及排出细胞外。三、乙醛酸循环和醋酸发酵柠檬酸三、乙醛酸循环和醋酸发酵柠檬酸 丙酮酸脱羧反应是不可逆的，草酰乙酸的供给丙酮酸脱羧反应是不可逆的，草酰乙酸的供给只能由乙醛酸循环来完成只能由乙醛酸循环来完成 存在异柠檬酸裂解酶，合成柠檬酸的存在异柠檬酸裂解酶，合成柠檬酸的C4C4二羧酸二羧酸只能由乙醛酸提供。只能由乙醛酸提供。乙醇乙醇乙酸乙酸乙酰乙酰CoACoA烃类烃类-氧化氧化 草酰乙酸草酰乙酸柠檬酸柠檬酸异柠檬酸异柠檬酸琥珀酸琥珀酸乙醛酸乙醛酸乙酰乙酰CoA苹果酸苹果酸富马酸富马酸乙醛酸循环乙醛酸循环 作业：简述柠檬酸生物合成的代谢调节