第15章核酸的研究方法课件.ppt

1、第第1515章章 核酸的研究方法核酸的研究方法核酸的分离、提纯和定量测定核酸的分离、提纯和定量测定核酸的超速离心核酸的超速离心核酸的凝胶电泳核酸的凝胶电泳核酸的核苷酸序列测定核酸的核苷酸序列测定DNA聚合酶链式反应（聚合酶链式反应（PCR）DNA的化学合成的化学合成 制备天然核酸必需采用温和的条件，制备天然核酸必需采用温和的条件，防止过酸、过碱，避免剧烈搅拌，尤其防止过酸、过碱，避免剧烈搅拌，尤其重要的是防止核酸酶的作用重要的是防止核酸酶的作用一、核酸的分离、提纯和定量测定一、核酸的分离、提纯和定量测定真核真核DNA以核蛋白（以核蛋白（DNP）形式存在，）形式存在，DNP溶于溶于水或高盐溶液（

2、水或高盐溶液（1mol/L NaCl），但不溶于低盐），但不溶于低盐溶液（溶液（0.14mol/L NaCl），据此，细胞破碎后采），据此，细胞破碎后采用高盐提取，低盐沉淀，可将用高盐提取，低盐沉淀，可将DNP与与RNA核蛋核蛋白分开，提取出白分开，提取出DNP。去除蛋白质去除蛋白质：水饱和酚，氯仿异戊醇。：水饱和酚，氯仿异戊醇。DNA沉淀沉淀：0.3M NaAC-70%乙醇乙醇（一）（一）DNA分离纯化分离纯化也可用也可用SDS破碎细胞，蛋白酶破碎细胞，蛋白酶K降解蛋白后，苯酚降解蛋白后，苯酚抽提，再用抽提，再用RNase分解除去分解除去RNA而获得纯化的而获得纯化的DNA。制备制备RNA时

3、，最重要的是使时，最重要的是使RNase灭活：灭活：容器用容器用0.1焦碳酸二乙酯（焦碳酸二乙酯（DEPC）处理。处理。然后经过然后经过高温处理高温处理。DEPC能使蛋白质乙基化而破坏能使蛋白质乙基化而破坏RNase活性；活性；加入加入强变性剂强变性剂（如胍盐：（如胍盐：可使所有蛋白质变性可使所有蛋白质变性）使使RNase失活；失活；在在RNA的反应体系内加入的反应体系内加入RNase的的抑制剂抑制剂（如（如RNasin)（二）（二）RNA的分离的分离 用0.14mol/L Nacl使DNP沉淀，上清中即为RNA核蛋白（RNP）。盐酸胍、苯酚等去蛋白用酸性胍盐用酸性胍盐/苯酚苯酚/氯仿抽提：异

4、硫氰酸胍是极氯仿抽提：异硫氰酸胍是极强的蛋白质变性剂。后用苯酚和氯仿多次除净蛋强的蛋白质变性剂。后用苯酚和氯仿多次除净蛋白质白质用胍盐用胍盐/氯化铯将细胞抽提物进行密度梯度离氯化铯将细胞抽提物进行密度梯度离心，蛋白质在最上面，心，蛋白质在最上面，DNADNA在中间，在中间，RNARNA沉在底部沉在底部mRNA的制备：oligo(dT)纤维素（琼脂糖凝胶）亲合层析法 制备制备RNA的方法：的方法：（三）核酸含量的测定（三）核酸含量的测定2、定糖法定糖法 RNA：核糖核糖 糠醛糠醛 绿色物质（绿色物质（670-680nm）DNA：脱氧核糖脱氧核糖+二苯胺二苯胺兰色物质（兰色物质（595-620nm

5、）苔黑酚/地衣酚浓HCl浓硫酸1、紫外吸收法紫外吸收法1个个A50g/ml 双链双链DNA 40g/ml RNA或单链或单链DNA3、定磷法定磷法 核酸含磷量为核酸含磷量为9.5%1g磷相当于磷相当于10.5g核酸核酸4、琼脂糖凝胶电泳琼脂糖凝胶电泳 溴乙锭溴乙锭能插入能插入DNA分子的分子的碱基碱基对对间形成复合物间形成复合物在紫外线照射下溴乙锭发橘红色荧光在紫外线照射下溴乙锭发橘红色荧光 荧光强度与荧光强度与DNA含量成正比含量成正比细胞或组织中核酸含量测定方法细胞或组织中核酸含量测定方法生物组织生物组织酸溶性物质酸溶性物质残留物残留物冷的稀酸抽提冷的稀酸抽提脂类物质脂类物质残留物残留物热

6、酸法热酸法冷酸法冷酸法碱法碱法残留物残留物 酸抽提液酸抽提液(RNA+DNA)热酸提取热酸提取残留物残留物残留物残留物酸抽提液酸抽提液 (DNA)热酸提取热酸提取酸抽提液酸抽提液 (RNA)冷酸提取冷酸提取酸抽提液酸抽提液 (RNA)残留物残留物(DNA)有机溶剂抽提有机溶剂抽提碱降解再酸化碱降解再酸化纯纯DNA DNA 比值比值1.81.8，1.8 Pr1.8 Pr、苯酚污染、苯酚污染纯纯RNA RNA 比值比值2.02.0，2.0 DNA 2.0 DNA、PrPr、苯酚污染、苯酚污染（四）、核酸纯度的测定OD260OD280二、核酸的沉降特性与超速离心二、核酸的沉降特性与超速离心 利用超离

7、心技术，可以测定核酸的沉降常数利用超离心技术，可以测定核酸的沉降常数和相对分子质量。密度梯度沉降平衡超离心法在和相对分子质量。密度梯度沉降平衡超离心法在核酸分子构象的研究中应用颇广。核酸分子构象的研究中应用颇广。DNA分析时，分析时，常用氯化铯密度梯度。主要应用于以下方面：常用氯化铯密度梯度。主要应用于以下方面：1.核酸密度的测定核酸密度的测定2.测定测定DNA中的中的G-C含量含量3.溶液中核酸构象的研究溶液中核酸构象的研究4.用于核酸的制备用于核酸的制备8M CsCl，45000rpm，16h密度梯度：密度梯度：1.80g/ml1.55g/ml平衡时：浮力密度平衡时：浮力密度=CsCl密度

8、密度=离心力离心力=0+4.22（r2-r02）10-10：未知：未知DNA的密度的密度0：为标准：为标准DNA的密度的密度：角速度（弧度：角速度（弧度/秒）秒）r：样品到转轴的距离：样品到转轴的距离r0：已知：已知DNA到转轴的距离到转轴的距离（一）核酸密度的测定G-C含量与含量与DNA的浮力密度之间呈正比关系，的浮力密度之间呈正比关系，因此可用能用该方法计算因此可用能用该方法计算DNA碱基成分，碱基成分，计算公式为：计算公式为：=0.1 xG-C+1.658xG-C=（-1.658）10需注意的是：需注意的是：含含5-甲基胞嘧啶多的甲基胞嘧啶多的DNA，其，其实际浮力密度会降低，低于理论值

9、，不能实际浮力密度会降低，低于理论值，不能用该公式计算。用该公式计算。（二）测定（二）测定DNADNA的的G-CG-C含量含量RNADNA变性变性DNA双链双链DNA 蛋白质，蛋白质，变性程度越大，浮力密度越大变性程度越大，浮力密度越大（三）研究核酸的构象（三）研究核酸的构象（四）用于核酸的制备（四）用于核酸的制备 不同构象的核酸（线形、环不同构象的核酸（线形、环形、超螺旋），密度和沉降速率形、超螺旋），密度和沉降速率不同，用密度梯度离心可以将不不同，用密度梯度离心可以将不同构象同构象DNA、RNA与蛋白质区分与蛋白质区分开来，利用开来，利用EB（溴化乙锭）与核（溴化乙锭）与核酸结合，能在紫外

10、灯下发出荧光酸结合，能在紫外灯下发出荧光的特性，将目的区带收集。的特性，将目的区带收集。是当前核酸研究中最常用的方法。有许多的是当前核酸研究中最常用的方法。有许多的优点：简单、快速、灵敏、成本低。常用的优点：简单、快速、灵敏、成本低。常用的有琼脂糖凝胶电泳和聚丙烯酰胺凝胶电泳。有琼脂糖凝胶电泳和聚丙烯酰胺凝胶电泳。三、核酸的凝胶电泳三、核酸的凝胶电泳（一）琼脂糖凝胶电泳（一）琼脂糖凝胶电泳用于大片段用于大片段DNA或或RNA的分离，精度低，但分的分离，精度低，但分离范围广。离范围广。电泳迁移率决定于：电泳迁移率决定于：（1）核酸分子的大小）核酸分子的大小（迁移率与相对分子质量对数成反比）（迁移

11、率与相对分子质量对数成反比）（2）胶浓度）胶浓度（迁移率与胶浓度成反比，常用（迁移率与胶浓度成反比，常用0.71%）（3）DNA的构象：的构象：超螺旋线状分子开环状分子超螺旋线状分子开环状分子（4 4）电压）电压 （一般（一般5V/cm,5V/cm,电压与迁移率成正比电压与迁移率成正比)（5 5）碱基组成（影响不大）碱基组成（影响不大）（6 6）温度（）温度（4 43030都可以，常室温进行）都可以，常室温进行）琼脂糖凝胶电泳常用于琼脂糖凝胶电泳常用于DNADNA分析；分析分析；分析RNARNA时需加时需加入蛋白质变性剂甲醛。电泳完毕用溴化乙锭入蛋白质变性剂甲醛。电泳完毕用溴化乙锭（0.5g/

12、mL0.5g/mL）染色，用紫外光检测）染色，用紫外光检测琼脂糖电泳用于琼脂糖电泳用于DNA分子量的测定分子量的测定在同一凝胶中加入已知相对分子质量的样品（分子marker)，在电泳完成后，通过染色，照相，从照片上比较待测样品的DNA片段与标准样品的中的已知大小片段，可以推测待测未知DNA片段的分子大小。用于小片段用于小片段DNA的分析的分析相对分子质量小于相对分子质量小于1000bp1000bp的的DNADNA片断片断和和RNARNA的电泳。的电泳。PAGEPAGE中一般不含中一般不含RNaseRNase，用于，用于RNARNA分分析时不会分解样品。析时不会分解样品。（二）聚丙烯酰胺凝胶电泳

13、（二）聚丙烯酰胺凝胶电泳（PAGEPAGE）（一）（一）DNADNA的酶法测定的酶法测定四、核酸的核苷酸序列测定四、核酸的核苷酸序列测定英国英国 SangerSanger1955 1955 确定牛胰岛素结构，确定牛胰岛素结构，1958 1958 获诺贝尔化学奖获诺贝尔化学奖1975 1975 设计出设计出DNADNA测序法，测序法，1980 1980 获诺贝尔化学奖获诺贝尔化学奖合成一系列与待测合成一系列与待测DNADNA序列互补的序列互补的DNADNA片段群。片段群。末端终止法末端终止法Sanger22，33双脱氧核苷三磷酸双脱氧核苷三磷酸（ddNTPddNTP）是）是DNADNA合成链延伸

14、的合成链延伸的抑制抑制剂剂。DNA序列分析仪：序列分析仪：四色荧光基团标记的dNTP（二）（二）DNADNA的化学法测序：由的化学法测序：由MaxamMaxam和和GilbertGilbert所所发明。其基本原理是用特异的发明。其基本原理是用特异的化学试剂化学试剂作用于作用于DNADNA分子中的不同碱基，然后用分子中的不同碱基，然后用哌啶哌啶切断反应碱切断反应碱基的多核苷酸链。用基的多核苷酸链。用4 4组不同的特异反应，可使组不同的特异反应，可使末端标记的末端标记的DNADNA分子切成不同长度的片断，其末分子切成不同长度的片断，其末端都是该特异的碱基。经变性胶电泳和放射自端都是该特异的碱基。经

15、变性胶电泳和放射自显影得到测序图谱显影得到测序图谱 4 4组特异的反应如下：组特异的反应如下：（1 1）G G反应：用硫酸二甲酯反应：用硫酸二甲酯DMSDMS使鸟嘌呤上的使鸟嘌呤上的N N7 7原子甲基化，加热引起鸟嘌呤脱落，多核苷酸原子甲基化，加热引起鸟嘌呤脱落，多核苷酸链可在此处断裂链可在此处断裂（2 2）G+AG+A反应：用甲酸使反应：用甲酸使A A和和G G嘌呤环上的嘌呤环上的N N原子原子质子化，从而使其糖苷键变得不稳定，再用哌质子化，从而使其糖苷键变得不稳定，再用哌啶使键断裂啶使键断裂（3 3）T+CT+C反应：用肼使反应：用肼使T T和和C C的嘧啶环断裂，再的嘧啶环断裂，再用哌

16、啶除去碱基用哌啶除去碱基（4 4）C C反应：当有盐存在时，只有反应：当有盐存在时，只有C C与肼反应，与肼反应，并被哌啶除去。嘧啶使修饰碱基脱落，并使去并被哌啶除去。嘧啶使修饰碱基脱落，并使去掉碱基的磷酸二酯键断裂掉碱基的磷酸二酯键断裂（三）（三）RNA的测序的测序 RNA的测序方法有的测序方法有3个：个：（1）用酶特异切断）用酶特异切断RNA链：链：胰RNase A：嘧啶核苷酸键米曲霉RNase T1：鸟苷酸核苷酸键黑粉菌RNase U2：腺苷酸核苷酸键多头黏菌RNase Phy I：A、G、U核苷酸键（2）用化学试剂裂解）用化学试剂裂解RNA（与（与DNA化学化学测序法类似）测序法类似）

17、（3）逆转录成）逆转录成cDNA19951995年年K.MullisK.Mullis发明。基本步骤为：发明。基本步骤为：1.1.设计一对引物以便有效扩增所需要的设计一对引物以便有效扩增所需要的DNADNA序列，并尽量减少可能产生的非特异产物序列，并尽量减少可能产生的非特异产物2.2.优化反应体系：包括适量模板、引物、优化反应体系：包括适量模板、引物、4 4种种dNTPdNTP、耐高温的、耐高温的DNADNA聚合酶和适量聚合酶和适量MgMg2+2+五、五、DNADNA聚合酶链式反应（聚合酶链式反应（PCRPCR）3.3.选择选择3 3个温度进行热循环：个温度进行热循环：变性变性9494，4545

18、60s60s；退火，根据引物的退火，根据引物的TmTm，一般为两引物中较，一般为两引物中较低的低的TmTm值减值减2 2，1min1min；延伸，延伸，7272，1min1min。热循环。热循环25-3025-30个周期，个周期，最后延伸最后延伸1010分钟。分钟。4.4.扩增完成后取出一定量的反应产物，检扩增完成后取出一定量的反应产物，检测扩增结果：先进行凝胶电泳，用溴化乙测扩增结果：先进行凝胶电泳，用溴化乙啶染色，紫外光下检测结果啶染色，紫外光下检测结果y=产物；产物；x=扩增效率；扩增效率；n循环次数循环次数(1)nyx PCR技术十分灵敏，扩展效率非常高，通常可技术十分灵敏，扩展效率非

19、常高，通常可扩增扩增106倍，其扩增产量可按下列公式计算。倍，其扩增产量可按下列公式计算。如此周而复始，重复进行，直至扩增产物的如此周而复始，重复进行，直至扩增产物的数量满足实验需求为止。数量满足实验需求为止。PCR技术的应用技术的应用-：（1）遗传病和某些疑难病的诊断以及孕妇的产前检查）遗传病和某些疑难病的诊断以及孕妇的产前检查（2）病原体的检测）病原体的检测（3）法医和刑侦鉴定）法医和刑侦鉴定（4）癌基因的检查）癌基因的检查（5）基因组探针的制备）基因组探针的制备（6）基因组测序、染色体巡视）基因组测序、染色体巡视（7）cDNA库的构建库的构建（8）基因突变的分析和定位诱变）基因突变的分析和定位诱变（9）DNA重组重组（10）基因的分离和克隆）基因的分离和克隆六、六、DNA的化学合成的化学合成P521图15-6固相合成法（亚磷酸三酯法）固相合成法（亚磷酸三酯法）合成DNA合成方向：3 5端5-OH用二对甲氧三苯甲基（DMT）保护。3-OH用氨基亚磷酸化合物活化碱基上氨基用苯甲酸保护 二对甲氧三苯甲基