第三章菌种选育课件.ppt

1、第三章第三章 菌种选育的理论与技术菌种选育的理论与技术v微生物发酵制药工艺过程：微生物发酵制药工艺过程：菌种菌种斜面培养斜面培养种子制备种子制备发酵发酵发酵液预处理发酵液预处理提取精制提取精制成品检验成品检验成品包装成品包装菌种选育菌种选育发酵工艺发酵工艺提取工艺提取工艺v微生物发酵工业化生产生物药物的三大环节：微生物发酵工业化生产生物药物的三大环节：发酵工艺发酵工艺提取工艺提取工艺菌种选育菌种选育第一节第一节 概述概述一、菌种选育的目的（掌握）一、菌种选育的目的（掌握）提高发酵产量提高发酵产量改进菌种性能改进菌种性能产生新的发酵产物产生新的发酵产物去除多余的组分去除多余的组分青霉素：青霉素：

2、20IU/ml-85000IU/ml青霉素产黄色素、土霉素产泡沫的消除青霉素产黄色素、土霉素产泡沫的消除提高有用组分含量，方便纯化提高有用组分含量，方便纯化二、菌种选育的基本理论二、菌种选育的基本理论（一）遗传与变异（理解）（一）遗传与变异（理解）v菌种选育的最基本理论菌种选育的最基本理论遗传：遗传：子代和亲代间的连续性，相似性的现象。子代和亲代间的连续性，相似性的现象。变异：变异：子代与亲代间的不连续性，差异性。子代与亲代间的不连续性，差异性。基因型：基因型：一个个体所具有的内在遗传基础一个个体所具有的内在遗传基础表型：表型：基因突变形成新的基因型在一定条件下表现出基因突变形成新的基因型在一

3、定条件下表现出来的个体性状。来的个体性状。意义：意义：遗传性遗传性使高产菌株能够保留下来，供后人使用；使高产菌株能够保留下来，供后人使用；变异性变异性使诱变育种提高发酵水平得以施行。使诱变育种提高发酵水平得以施行。微生物菌种的遗传特性使菌种能够不断延续其后代，微生物菌种的遗传特性使菌种能够不断延续其后代，保持菌种稳定性。保持菌种稳定性。本质：本质：亲代的遗传基因传递给子代，亲代的遗传基因传递给子代，使子代具有与亲代相同的基因，从使子代具有与亲代相同的基因，从而发育成相似的个体。而发育成相似的个体。（二）遗传与变异的物质基础（了解）（二）遗传与变异的物质基础（了解）v物质基础：物质基础：DNAv

4、DNA中核苷酸的特定排中核苷酸的特定排列顺序，对遗传起决定列顺序，对遗传起决定作用。作用。v基因的产物为蛋白质或基因的产物为蛋白质或酶，基因的改变，导致酶，基因的改变，导致相应蛋白质或酶的改变，相应蛋白质或酶的改变，从而引起生物体表型的从而引起生物体表型的变化。变化。脱氧核糖核酸（脱氧核糖核酸（DNA），），是染色体的主要化学成分，是染色体的主要化学成分，同时也是组成基因的材料。同时也是组成基因的材料。有时被称为有时被称为“遗传微粒遗传微粒”，因为在繁殖过程中，父代因为在繁殖过程中，父代把它们自己把它们自己DNA的一部分的一部分复制传递到子代中，从而复制传递到子代中，从而完成性状的传播。完成性

5、状的传播。三联密码三联密码（三）基因突变的本质与类型（了解）（三）基因突变的本质与类型（了解）基因突变的本质：基因突变的本质：DNA中核苷酸碱基的化学中核苷酸碱基的化学结构和排列顺序或数目发生变化，导致生物结构和排列顺序或数目发生变化，导致生物体表型改变。体表型改变。这种表型改变可稳定地一代代传递下去，也这种表型改变可稳定地一代代传递下去，也可称为可称为遗传变异遗传变异。遗传变异的类型（熟悉）遗传变异的类型（熟悉）一、自发突变一、自发突变二、诱发突变二、诱发突变微生物未经微生物未经人为人为诱变处理或杂交等生物技术手段诱变处理或杂交等生物技术手段而自然发生地突变。而自然发生地突变。原因：原因：1

6、.环境中存在低剂量的物理、化学诱变因素（宇宙环境中存在低剂量的物理、化学诱变因素（宇宙紫外线、短波辐射、高温、病毒等）紫外线、短波辐射、高温、病毒等）2.生长过程中，生长过程中，DNA复制过程中发生错误。复制过程中发生错误。3.微生物自身代谢过程中产生一些具有诱变作用的微生物自身代谢过程中产生一些具有诱变作用的物质，如过氧化氢、硫氰化合物等。物质，如过氧化氢、硫氰化合物等。特点：特点：速度慢，时间长、突变频率低，一般为速度慢，时间长、突变频率低，一般为107109一、自发突变：一、自发突变：二、诱发突变：二、诱发突变：人为用化学、物理诱变剂（紫外线、亚硝酸等）去人为用化学、物理诱变剂（紫外线、

7、亚硝酸等）去处理微生物而引起的突变。处理微生物而引起的突变。特点：速度快、时间短、突变频率高，一般大于特点：速度快、时间短、突变频率高，一般大于104。突变类型按遗传变异后按遗传变异后DNA结构发生改变的程度、突结构发生改变的程度、突变又可分为变又可分为基因突变、染色体畸变和染色体基因突变、染色体畸变和染色体组突变组突变。1）基因突变：）基因突变：DNA结构发生较小的损伤，碱基发生结构发生较小的损伤，碱基发生变化，包括变化，包括a.碱基置换（碱基置换（P37）：）：DNA链上的碱基序列中一个链上的碱基序列中一个碱基被另一个碱基代替的现象。其中嘌呤（碱基被另一个碱基代替的现象。其中嘌呤（A和和G

8、）之间或嘧啶（之间或嘧啶（T和和C）之间发生的互换称）之间发生的互换称转换转换。嘌。嘌呤和嘧啶之间的替换称呤和嘧啶之间的替换称颠换颠换。b.移码突变（移码突变（P38）：）：碱基序列中有一个或几个碱碱基序列中有一个或几个碱基增加或减少而产生的变异。基增加或减少而产生的变异。c.易位突变（易位突变（P38）：）：DNA链上一个密码子中的某链上一个密码子中的某个碱基和临近密码子中的一个碱基对换，造成两个碱基和临近密码子中的一个碱基对换，造成两个密码子编写的氨基酸都发生改变，从而引起突个密码子编写的氨基酸都发生改变，从而引起突变。变。v2）染色体畸变：）染色体畸变：染色体结构的变化导致遗传信息的改变

9、，染色体结构的变化导致遗传信息的改变，具遗传效应。多数由于染色体受巨大损伤，使其断裂。根具遗传效应。多数由于染色体受巨大损伤，使其断裂。根据断裂数目、位置、断裂端连接方式等的不同，可分为据断裂数目、位置、断裂端连接方式等的不同，可分为a.缺失（缺失（P38）：）：同一染色体上具有一个或多个基因的同一染色体上具有一个或多个基因的DNA片段丢失引起的突变。片段丢失引起的突变。b.重复（重复（P38）：）：在同一条染色体的某处增加一段在同一条染色体的某处增加一段DNA片段，片段，使该染色体的某些基因重复出现产生突变。使该染色体的某些基因重复出现产生突变。c.倒位（倒位（P38）：）：染色体受外来因素

10、的破坏，造成染色体部染色体受外来因素的破坏，造成染色体部分节段的位置顺序颠倒，极性相反。分节段的位置顺序颠倒，极性相反。d.易位（易位（P38）：）：同源染色体之间部分连接或交换。断裂后同源染色体之间部分连接或交换。断裂后的一段染色体，加入到另一条非同源染色体的某个位置中。的一段染色体，加入到另一条非同源染色体的某个位置中。v3）染色体组突变：）染色体组突变：染色体数目的变化，可分为整倍体和染色体数目的变化，可分为整倍体和非整倍体。非整倍体。突变的过程突变的过程1.诱变剂与微生物细诱变剂与微生物细胞的作用：胞的作用：2.诱变剂与诱变剂与DNA的作的作用：用：DNA是否处在是否处在复制状态与其接

11、触复制状态与其接触诱变剂后能否发生诱变剂后能否发生基因突变有密切关基因突变有密切关系。系。3、突变体的形成：、突变体的形成：突变不一定形成稳定突变体，突变不一定形成稳定突变体，当突变发生后，只有经过复制，才能成为突变体当突变发生后，只有经过复制，才能成为突变体。突变的修复突变的修复DNA结构被改变后有两种可能：结构被改变后有两种可能：一种是突变的一种是突变的DNA分子在复制过程中克服了分子在复制过程中克服了修复系统的作用而成为突变体；修复系统的作用而成为突变体；另一种是被修复系统修补后恢复原有另一种是被修复系统修补后恢复原有DNA分分子结构不能形成突变体。子结构不能形成突变体。用紫外线诱发微生

12、物突变，主要效应是使用紫外线诱发微生物突变，主要效应是使DNA单链上的临近两个嘧啶碱基结合形成单链上的临近两个嘧啶碱基结合形成嘧嘧啶二聚体啶二聚体。由于在二聚体的位置上碱基不能。由于在二聚体的位置上碱基不能正常配对，使正常配对，使DNA复制和复制和RNA转录不能正常转录不能正常进行。进行。由紫外线诱发损伤的修复，可分为光修复和暗修复由紫外线诱发损伤的修复，可分为光修复和暗修复修复方式修复方式1、光修复：、光修复：细菌经紫外线照射后，再用可见光照射，细菌经紫外线照射后，再用可见光照射，突变率降低的现象称为突变率降低的现象称为光复活光复活。酶促反应，光复活酶可以将单链的嘧啶二聚体分解成酶促反应，光

13、复活酶可以将单链的嘧啶二聚体分解成单体。单体。2、切补修复（暗修复）：、切补修复（暗修复）：切除嘧啶二聚体使切除嘧啶二聚体使DNA分分子修复。可先切后补或先补后切，修复过程在限制子修复。可先切后补或先补后切，修复过程在限制性内切核酸酶、外切核酸酶等的作用下进行。性内切核酸酶、外切核酸酶等的作用下进行。3、重复修复：、重复修复：指损伤的指损伤的DNA经过复制后完成修复过经过复制后完成修复过程。程。4、SOS修复修复5、DNA聚合酶的校正作用聚合酶的校正作用突变后的表型变化突变后的表型变化由基因突变引起的变异，能否产生表型改由基因突变引起的变异，能否产生表型改变有如下几种情况：变有如下几种情况：1

14、.突变不改变遗传性状突变不改变遗传性状2.显性突变和隐性突变的表型效应：显性突变和隐性突变的表型效应：3.突变的表型与环境突变的表型与环境表型延迟（理解）表型延迟（理解）表型延迟（表型延迟（P41）：）：指微生物表型的改变指微生物表型的改变总是落后于基因型改变的现象。总是落后于基因型改变的现象。产生原因产生原因1.诱变剂作用的延迟诱变剂作用的延迟2.多核细胞中的单个核突变多核细胞中的单个核突变3.原有基因产物的影响。原有基因产物的影响。多核细胞中，通过几代繁殖分裂，直多核细胞中，通过几代繁殖分裂，直到一个细胞中所有细胞核都含突变基到一个细胞中所有细胞核都含突变基因时，表型才会发生改变。因时，表

15、型才会发生改变。原来产生的酶起着支配野生型细胞表型的作用，几代繁殖原来产生的酶起着支配野生型细胞表型的作用，几代繁殖后，酶浓度降低，才表现出突变基因的表型。后，酶浓度降低，才表现出突变基因的表型。第二节第二节 自然选育自然选育自然选育：自然选育：利用微生物在一定条件下产生利用微生物在一定条件下产生自发突变自发突变的原理，的原理，通过分离、筛选排除衰退型菌株，从中选出维持或高于原有通过分离、筛选排除衰退型菌株，从中选出维持或高于原有生产水平菌株的过程。以达到稳定和提高生产能力的目的。生产水平菌株的过程。以达到稳定和提高生产能力的目的。优点：优点：简单易行简单易行v缺点：缺点：效率低、进展慢效率低

16、、进展慢以微生物的自然变异作为基础的生产选种机率并不很高，以微生物的自然变异作为基础的生产选种机率并不很高，一个基因的自然突变频率仅一个基因的自然突变频率仅1010-6-6-10-10-10-10左右。左右。自然选育的一般过程（重点）自然选育的一般过程（重点）生产菌种斜面生产菌种斜面制备单孢子（或细胞）悬浮液制备单孢子（或细胞）悬浮液涂布平板、培养后挑取单菌落涂布平板、培养后挑取单菌落斜面种子培养斜面种子培养摇瓶发酵摇瓶发酵高产菌株初选高产菌株初选菌种保藏菌种保藏斜面种子培养斜面种子培养摇瓶种子培养摇瓶种子培养摇瓶发酵摇瓶发酵高产菌株复选高产菌株复选高产菌株验证高产菌株验证v作用：对菌种进行分

17、离作用：对菌种进行分离纯化，获得遗传背景较纯化，获得遗传背景较为纯一的细胞群体。为纯一的细胞群体。初筛初筛复筛复筛自然选育的操作方法自然选育的操作方法 1、单孢子悬液的制备：、单孢子悬液的制备：无菌生理盐水或缓冲液、摇瓶。无菌生理盐水或缓冲液、摇瓶。2、稀释及单菌落培养：、稀释及单菌落培养：梯度稀释（梯度稀释（50200/ml），平板培养），平板培养（1050/皿）皿）3、单菌落传斜面：、单菌落传斜面：接种环挑取，每个单菌落传一只斜面接种环挑取，每个单菌落传一只斜面4、摇瓶初筛：、摇瓶初筛：将斜面培养成熟后直接入发酵摇瓶中，发酵后将斜面培养成熟后直接入发酵摇瓶中，发酵后测定发酵单位，初筛高产菌

18、株。测定发酵单位，初筛高产菌株。5、菌种保藏：、菌种保藏：挑选高产菌株保藏挑选高产菌株保藏6、摇瓶复筛：、摇瓶复筛：对初筛高产菌株的验证，挑选稳定高产菌株。对初筛高产菌株的验证，挑选稳定高产菌株。采用二级发酵（种子摇瓶发酵摇瓶），重复采用二级发酵（种子摇瓶发酵摇瓶），重复35次。须以次。须以出发菌株作对照。出发菌株作对照。7、放大试验：、放大试验：改进发酵条件，达到工业化生产要求。改进发酵条件，达到工业化生产要求。第三节第三节 诱变育种诱变育种v诱变育种：诱变育种：利用物理或化学利用物理或化学诱变剂处理诱变剂处理均匀均匀分散的微生物细胞群体，促进其分散的微生物细胞群体，促进其突变率大幅突变率大

19、幅提高提高，然后采用简便、高效的，然后采用简便、高效的筛选筛选方法，从方法，从中选出少数具有中选出少数具有优良性状优良性状的突变菌株。的突变菌株。v优点：优点：速度快、收效大、方法简单速度快、收效大、方法简单诱变剂诱变剂类型：类型：物理诱变剂、化学诱变剂、生物诱变剂物理诱变剂、化学诱变剂、生物诱变剂一一物理诱变剂：物理诱变剂：物理辐射，如紫外线、物理辐射，如紫外线、X射线，激射线，激光、电磁波等光、电磁波等二二化学诱变剂：化学诱变剂：一类能与一类能与DNA发生作用、改变其发生作用、改变其结构、并引起遗传变异的化学物质，常用包括结构、并引起遗传变异的化学物质，常用包括碱碱基类似物、烷化剂、移码突

20、变剂基类似物、烷化剂、移码突变剂等。等。三三生物诱变剂：生物诱变剂：一些能引起一些能引起DNA结构改变，从而结构改变，从而造成突变效应的造成突变效应的生物体或生物分子生物体或生物分子。噬菌体、人噬菌体、人工构建的质粒、转座子工构建的质粒、转座子。常用诱变剂（熟悉）常用诱变剂（熟悉）1、紫外线：、紫外线：v有效波长：有效波长：200300nm，15W紫外灯管紫外灯管诱变效果好。诱变效果好。v辐射剂量：辐射剂量：灯管功率和距离固定时，剂量灯管功率和距离固定时，剂量与照射时间成正比；照射剂量与杀菌率在与照射时间成正比；照射剂量与杀菌率在一定范围成正比，高致死剂量（一定范围成正比，高致死剂量（90-9

21、9%）、）、中等剂量（中等剂量（70-80%）80%波长集中在波长集中在253.7nm出发菌株的培养出发菌株的培养孢子悬液或菌悬浮液的制备孢子悬液或菌悬浮液的制备紫外线照射紫外线照射后培养后培养稀释涂平板稀释涂平板诱变过程2、亚硝基胍（、亚硝基胍（NTG）黄色结晶，性质不稳定，遇光易分解；棕色瓶避光黄色结晶，性质不稳定，遇光易分解；棕色瓶避光干燥保存。干燥保存。诱变作用极强，诱变作用极强，PH影响诱变效果，常用缓冲溶液配影响诱变效果，常用缓冲溶液配制。制。v诱变处理方法：诱变处理方法：制备菌悬液配制制备菌悬液配制NTG母液母液NTG与菌体的作用与菌体的作用NTG作用的终止稀释涂平皿作用的终止稀

22、释涂平皿3、硫酸二乙酯（、硫酸二乙酯（DES）v处理方法：同上处理方法：同上v终止处理：终止处理：2%Na2S2O3溶液溶液0.5ml4、亚硝酸：、亚硝酸：v终止处理：终止处理：pH8.6磷酸氢二钠缓冲液磷酸氢二钠缓冲液生理盐水洗涤菌体，离心后重新生理盐水洗涤菌体，离心后重新制备菌悬液制备菌悬液13mg/ml、30120min、2632新型诱变剂新型诱变剂v激光、微波、离子注入、高能电子流激光、微波、离子注入、高能电子流诱变的主要环节（重点）诱变的主要环节（重点）（一）出发菌株的选择（一）出发菌株的选择（二）诱变处理（二）诱变处理（三）突变株的筛选（三）突变株的筛选（一）出发菌株的选择（一）出

23、发菌株的选择1、选择、选择纯种纯种菌株菌株2、选择具有、选择具有优良性状优良性状的菌株：产量高，产孢的菌株：产量高，产孢子早而多，色素少、生长速度快等。子早而多，色素少、生长速度快等。3、选择对诱变剂、选择对诱变剂敏感敏感的菌株的菌株4、选用多个出发菌株进行诱变收效较快选用多个出发菌株进行诱变收效较快 提高突变频率提高突变频率（二）诱变处理（二）诱变处理（重点）（重点）1、诱变剂的选择、诱变剂的选择：“量体裁衣量体裁衣”，不经常采用一种，不经常采用一种诱变剂反复处理，防止诱变效应饱和。诱变剂反复处理，防止诱变效应饱和。2、诱变剂用量的选择、诱变剂用量的选择：致死率高的剂量负变株多，：致死率高的

24、剂量负变株多，但变异幅度大、效率高；中等剂量高产菌株出现率但变异幅度大、效率高；中等剂量高产菌株出现率高，效率不高，速度慢。高，效率不高，速度慢。3、影响诱变效果的因素、影响诱变效果的因素：菌种生理状态、被处理菌：菌种生理状态、被处理菌株的预培养和后培养条件、诱变处理时外界条件等。株的预培养和后培养条件、诱变处理时外界条件等。4、诱变的一般过程：、诱变的一般过程：单孢子悬浮液的制备诱变剂单孢子悬浮液的制备诱变剂处理梯度稀释涂布分离平板处理梯度稀释涂布分离平板（三）突变株的筛选（三）突变株的筛选筛选：将筛选：将分离培养后的各型单菌落中性分离培养后的各型单菌落中性状优良、具有高发酵能力的突变菌株挑

25、状优良、具有高发酵能力的突变菌株挑选出来过程。选出来过程。初筛：初筛：从从大量大量菌株中发现有苗头的优良菌株，菌株中发现有苗头的优良菌株，筛选量大，准确度要求不是很高。筛选量大，准确度要求不是很高。复筛：复筛：注重注重准确性准确性和和可重复性可重复性。一支菌种要。一支菌种要接种接种35个发酵摇瓶，采用二级发酵，力求个发酵摇瓶，采用二级发酵，力求试验结果准确可靠试验结果准确可靠筛选方法筛选方法1、随机筛选、随机筛选2、理性化筛选、理性化筛选1、随机筛选：、随机筛选：随机挑选平板分离后的单菌落，随机挑选平板分离后的单菌落，从中筛选具有优良性状的菌株。从中筛选具有优良性状的菌株。（1）摇瓶筛选法）摇

26、瓶筛选法（2）琼脂块筛选法）琼脂块筛选法摇瓶筛选法摇瓶筛选法操作步骤操作步骤平板分离单菌落平板分离单菌落接种斜面培养接种斜面培养摇瓶发酵摇瓶发酵测定生物活性物质含量测定生物活性物质含量高产菌株的筛选高产菌株的筛选初筛初筛复筛复筛琼脂块筛选法琼脂块筛选法抗生素产生菌孢子悬液抗生素产生菌孢子悬液诱变处理诱变处理涂布平板涂布平板打孔取单菌琼脂块，放入另一打孔取单菌琼脂块，放入另一无菌空培养皿中无菌空培养皿中将琼脂块转移到将琼脂块转移到生物鉴定平板生物鉴定平板上上12d28、35d通过通过抑菌圈抑菌圈的大小的大小判定生物效价的高判定生物效价的高低，高效价的琼脂低，高效价的琼脂块，接种斜面培养块，接种斜

27、面培养基、摇瓶发酵筛选基、摇瓶发酵筛选抗生素高产菌抗生素高产菌株的筛选株的筛选2、理性化筛选：、理性化筛选：v根据产物已知或可能的生物合成途径、代根据产物已知或可能的生物合成途径、代谢调控机制和分子结构设计的一些筛选方谢调控机制和分子结构设计的一些筛选方法。法。v打破微生物原有代谢调控机制，获得能大打破微生物原有代谢调控机制，获得能大量形成发酵产物的高产突变株。量形成发酵产物的高产突变株。（1）初级代谢产物高产菌株的筛选）初级代谢产物高产菌株的筛选营养缺陷型突变株的筛选营养缺陷型突变株的筛选氨基酸结构类似物抗性突变菌株的筛选氨基酸结构类似物抗性突变菌株的筛选细胞膜透性突变株的筛选细胞膜透性突变

28、株的筛选初级代谢产物：初级代谢产物：与菌体的生长繁殖有密切关系的代与菌体的生长繁殖有密切关系的代谢产物，如氨基酸、核苷酸、维生素等小分子，以谢产物，如氨基酸、核苷酸、维生素等小分子，以及蛋白质、多肽、核酸等大分子产物。及蛋白质、多肽、核酸等大分子产物。1、营养缺陷型突变菌株的筛选、营养缺陷型突变菌株的筛选 营养缺陷型营养缺陷型:诱变产生的缺乏合成某些营养诱变产生的缺乏合成某些营养物质的能力，须在基本培养基中加入相应物质的能力，须在基本培养基中加入相应的营养成分才能正常生长的的营养成分才能正常生长的变异株变异株。野生型野生型:与营养缺陷型对应的是野生型。与营养缺陷型对应的是野生型。基本培养基基本

29、培养基(MM)(MM)：能满足能满足野生型菌株野生型菌株正常正常生长的培养基生长的培养基补充培养基补充培养基(SM)(SM)：在基本培养基中加入相在基本培养基中加入相应的营养成分的培养基应的营养成分的培养基完全培养基完全培养基(CM)(CM)：能满足各种营养缺陷型能满足各种营养缺陷型生长的培养基生长的培养基v选育高产赖氨酸产生选育高产赖氨酸产生菌，可以筛选菌，可以筛选高丝氨高丝氨酸的营养缺陷型突变酸的营养缺陷型突变菌株菌株，由于突变株中，由于突变株中高丝氨酸脱氢酶失活，高丝氨酸脱氢酶失活，不能合成高丝氨酸，不能合成高丝氨酸，使其全部用于赖氨酸使其全部用于赖氨酸的生物合成，有利于的生物合成，有利

30、于赖氨酸的合成。赖氨酸的合成。天冬氨酸天冬氨酸天冬氨酰磷酸天冬氨酰磷酸天冬氨酰天冬氨酰半醛半醛高丝氨酸高丝氨酸蛋氨酸蛋氨酸苏氨酸苏氨酸丙酮酸丙酮酸异亮氨酸异亮氨酸天冬氨酸激酶天冬氨酸激酶反反馈馈抑抑制制赖氨酸赖氨酸高丝氨酸脱氢酶（高丝氨酸脱氢酶（HD）争夺底物，解除反馈抑制争夺底物，解除反馈抑制2、氨基酸结构类似物抗性突变菌株的筛选、氨基酸结构类似物抗性突变菌株的筛选氨基酸结构类似物：氨基酸结构类似物：与某种氨基酸在化学结与某种氨基酸在化学结构上仅有微小差异的化合物。与氨基酸具有构上仅有微小差异的化合物。与氨基酸具有相似生物学功能相似生物学功能，不能被菌体用来合成蛋白不能被菌体用来合成蛋白质质

31、。结构类似物：结构类似物：结构与代谢产物类似的化合物结构与代谢产物类似的化合物 特点：特点：有反馈调节作用有反馈调节作用 无正常生理功能无正常生理功能结构类似物抗性突变株的筛选氨基酸类似物反馈阻遏氨基酸类似物反馈阻遏或反馈抑制对应氨基酸或反馈抑制对应氨基酸的生物合成，使该种氨的生物合成，使该种氨基酸产生菌不能在该平基酸产生菌不能在该平板生长。板生长。经诱变后，能在该培养经诱变后，能在该培养基上生长的突变菌株解基上生长的突变菌株解除了终产物的反馈调节，除了终产物的反馈调节，因而可以积累过量相应因而可以积累过量相应氨基酸。氨基酸。基本培养基基本培养基加入氨基酸结构类似物加入氨基酸结构类似物涂布氨基

32、酸产生菌涂布氨基酸产生菌解除了终产物反馈解除了终产物反馈调节的突变菌株调节的突变菌株3、细胞膜通透性突变株的筛选、细胞膜通透性突变株的筛选微生物产生的代谢产物如果累积在细胞内的微生物产生的代谢产物如果累积在细胞内的浓度高，容易产生浓度高，容易产生反馈调节反馈调节作用阻止这种代作用阻止这种代谢产物的继续合成。谢产物的继续合成。改变细胞通透性，使发酵产物大量分泌到胞改变细胞通透性，使发酵产物大量分泌到胞外，可避免终产物的反馈调节。外，可避免终产物的反馈调节。改变细胞的通透性可采用：改变细胞的通透性可采用：油酸缺陷型突变株油酸缺陷型突变株生物素缺陷型突变株生物素缺陷型突变株丧失合成油酸能力，形成渗漏

33、型细胞丧失合成油酸能力，形成渗漏型细胞磷脂合成受影响，改变细胞膜结构，磷脂合成受影响，改变细胞膜结构，提高细胞通透性。提高细胞通透性。（2）次级代谢产物高产菌株的筛选）次级代谢产物高产菌株的筛选营养缺陷型营养缺陷型生物合成阻断变株的回复突变株生物合成阻断变株的回复突变株去磷酸盐调节突变株（等）去磷酸盐调节突变株（等）次级代谢产物：次级代谢产物：与菌体的生长繁殖没有密切关系与菌体的生长繁殖没有密切关系的一类代谢产物，如抗生素、色素、毒素、酶抑的一类代谢产物，如抗生素、色素、毒素、酶抑制剂等。制剂等。突变菌株高产基因的表达突变菌株高产基因的表达突变株遗传特性改变，原有发酵条件已不适突变株遗传特性改

34、变，原有发酵条件已不适应新菌种的代谢需求，需对其应新菌种的代谢需求，需对其培养条件培养条件作相作相应改变。应改变。对发酵培养基及发酵条件进行系统优化和筛对发酵培养基及发酵条件进行系统优化和筛选，可使高产基因在新的发酵条件下充分表选，可使高产基因在新的发酵条件下充分表达，进一步提高菌种的生产能力。达，进一步提高菌种的生产能力。第四节第四节 杂交育种杂交育种杂交育种（杂交育种（P60）：）：将两个基因型不同的菌将两个基因型不同的菌株经吻合（或接合）使株经吻合（或接合）使遗传物质重新组合遗传物质重新组合，从中分离和筛选具有新性状菌株的过程。从中分离和筛选具有新性状菌株的过程。诱变育种长期使用会使菌种

35、产生诱变育种长期使用会使菌种产生诱变饱和诱变饱和现象，同时现象，同时可能导致菌种可能导致菌种生活能力下降生活能力下降等弊端。等弊端。各种微生物进行杂交的方式各种微生物进行杂交的方式原核：转化原核：转化 转导转导 接合接合 原生质体融合原生质体融合真核：有性杂交真核：有性杂交准性杂交准性杂交 (parasexual(parasexual hybridization)hybridization)杂交的意义杂交的意义1.遗传物质进行遗传物质进行交换交换和和重新组合重新组合，使两亲优，使两亲优良性状集中于重组体内，良性状集中于重组体内，获得新品种获得新品种。2.重组体可克服因长期诱变造成的生产力下重组

36、体可克服因长期诱变造成的生产力下降，代谢缓慢等缺陷，降，代谢缓慢等缺陷，提高对诱变剂的敏提高对诱变剂的敏感性。感性。基因重组基因重组甲生长快、产量低生长快、产量低乙生长慢、产量高生长慢、产量高生长快、产量高生长快、产量高 面包酵母面包酵母:对麦芽糖及葡萄糖的发酵力强，对麦芽糖及葡萄糖的发酵力强，产生产生 CO2 多，生长快多，生长快 酒精酵母酒精酵母:产酒率高而对麦芽糖、葡萄糖产酒率高而对麦芽糖、葡萄糖的发酵力弱的发酵力弱 杂交杂交:就得到了既能生产酒精，又能将其就得到了既能生产酒精，又能将其残余菌体用作面包厂和家用发面酵母的残余菌体用作面包厂和家用发面酵母的优良菌种。优良菌种。杂交过程：杂交

37、过程：1.两亲本菌株细胞间两亲本菌株细胞间接合接合2.染色体部分转移染色体部分转移3.形成部分结合子形成部分结合子4.交换、重组交换、重组5.重组体的产生重组体的产生是细菌通是细菌通过性菌毛相互连接过性菌毛相互连接沟通，将遗传物质沟通，将遗传物质从供体菌转移给受从供体菌转移给受体菌。体菌。细菌的杂交育种细菌的杂交育种原理：原理：通过供体向受体转移部分染色体，经过遗传通过供体向受体转移部分染色体，经过遗传物质交换，达到基因重组。物质交换，达到基因重组。细菌的遗传物质转移是单相、不可逆的，由供体菌细菌的遗传物质转移是单相、不可逆的，由供体菌转向受体菌。转向受体菌。F因子（因子（P61）：）：性因子

38、，是一种质粒，存在于细胞性因子，是一种质粒，存在于细胞中，是一种稳定的遗传物质，环状中，是一种稳定的遗传物质，环状DNA双链结构，双链结构，复制与染色体不同步。复制与染色体不同步。具有性因子的菌株为具有性因子的菌株为供体菌供体菌，具有性因子的细胞称，具有性因子的细胞称为有性因子细胞为有性因子细胞F+，不具性因子的菌株为，不具性因子的菌株为受体菌受体菌，称无性因子菌株称无性因子菌株F-。Hfr菌株：当供体菌的菌株：当供体菌的F因子整合到细胞染色体因子整合到细胞染色体DNA上时，上时，F菌株成为高度致育细胞，称菌株成为高度致育细胞，称Hfr菌株。菌株。F+环状染色体环状染色体F因子因子F-Hfr获

39、得获得F因子因子F因子与染色体结合因子与染色体结合（二）细菌杂交过程与方法（理解）（二）细菌杂交过程与方法（理解）杂交亲株的选择杂交亲株的选择亲本菌株遗传标记的确定亲本菌株遗传标记的确定不同性别菌株的制备不同性别菌株的制备重组体的形成重组体的形成选择具有选择具有不同遗传特性不同遗传特性的两个亲本的两个亲本菌株作为杂交亲本菌株。菌株作为杂交亲本菌株。通过诱变和选育使菌株带通过诱变和选育使菌株带有一定遗传标记，常用：有一定遗传标记，常用：营养缺陷型和抗生素抗性营养缺陷型和抗生素抗性标记标记F菌株可用低浓度的丫啶橙处理菌株可用低浓度的丫啶橙处理F+菌株菌株Hfr菌株可通过菌株可通过F和和F菌株杂交获

40、菌株杂交获得。得。细菌杂交方法细菌杂交方法直接混合法直接混合法1.将两个直接亲本菌株分别培养至将两个直接亲本菌株分别培养至对数期对数期，移至新鲜肉汤培养液中振荡培养，移至新鲜肉汤培养液中振荡培养，2.以一定比例混合，以一定比例混合，37水浴缓慢振荡。亲水浴缓慢振荡。亲本菌株间杂交。本菌株间杂交。3.混合液稀释分离，选择性培养基上培养筛混合液稀释分离，选择性培养基上培养筛选。选。放线菌的杂交育种放线菌的杂交育种放线菌：放线菌：原核生物，无完整细胞核结构。有一条环状原核生物，无完整细胞核结构。有一条环状染色体核，以菌丝体形态生长，形成分生孢子。染色体核，以菌丝体形态生长，形成分生孢子。杂交原理：杂

41、交原理：通过供体向受体转移部分染色体，经过遗通过供体向受体转移部分染色体，经过遗传物质交换，达到基因重组。传物质交换，达到基因重组。杂交方法：杂交方法：1.混合培养法混合培养法2.平板培养法平板培养法3.玻璃纸转移法玻璃纸转移法霉菌的杂交育种霉菌的杂交育种真核微生物，可进行准性生殖。真核微生物，可进行准性生殖。准性生殖：准性生殖：真菌中不通过有性生殖的基因重组过程。真菌中不通过有性生殖的基因重组过程。包括三阶段：包括三阶段：1.异核体的形成：异核体的形成：在基本培养基上，接种两个营养缺在基本培养基上，接种两个营养缺陷型菌株，强制其互补营养。当具有不同性状的两陷型菌株，强制其互补营养。当具有不同

42、性状的两个细胞或两条菌丝相互联结时，导致在一个细胞或个细胞或两条菌丝相互联结时，导致在一个细胞或一条菌丝中并存有两种或两种以上不同遗传型的核，一条菌丝中并存有两种或两种以上不同遗传型的核，这样的细胞或菌丝体叫做异核体。这样的细胞或菌丝体叫做异核体。2.杂交双倍体的形成杂交双倍体的形成3.体细胞的重组体细胞的重组异核体菌丝繁殖过程中，偶尔发生两异核体菌丝繁殖过程中，偶尔发生两种不同遗传型核的种不同遗传型核的融合融合，形成，形成杂合细杂合细胞核胞核。由于组成异核体的两个亲本细。由于组成异核体的两个亲本细胞核各具一个染色体组，所以杂合核胞核各具一个染色体组，所以杂合核是双倍体。是双倍体。杂合双倍体在

43、繁殖过程中发生杂合双倍体在繁殖过程中发生染色体交换染色体交换和和染色染色体单倍化体单倍化，形成各种分离子。这两个过程相对独，形成各种分离子。这两个过程相对独立，总称体细胞重组。立，总称体细胞重组。第五节第五节 原生质体融合育种（重点）原生质体融合育种（重点）v原生质体（原生质体（P65）：）：微生物在酶的作用下，微生物在酶的作用下，脱去细胞壁，剩下由原生质膜包围着的原生脱去细胞壁，剩下由原生质膜包围着的原生质部分。质部分。v20世纪世纪70年代以来，原生质体操作技术逐渐年代以来，原生质体操作技术逐渐成熟，成为工业微生物育种的重要手段。成熟，成为工业微生物育种的重要手段。一、一、原生质体的制备及

44、影响因素原生质体的制备及影响因素（掌握）（掌握）v制备：制备：细菌、放线菌溶菌酶细菌、放线菌溶菌酶酵母菌、霉菌蜗牛酶、纤维素酶酵母菌、霉菌蜗牛酶、纤维素酶影响因素（掌握）影响因素（掌握）1.培养基组成培养基组成2.菌龄菌龄3.酶浓度酶浓度4.酶解温度和酶解温度和pH5.酶解时间酶解时间6.渗透压稳定剂渗透压稳定剂影响菌体生长和细胞壁对酶的敏感性影响菌体生长和细胞壁对酶的敏感性大多数微生物在大多数微生物在对数生长期对数生长期对溶菌酶作用最敏感。对溶菌酶作用最敏感。温度升高、酶解反应加快；温度过高、酶易失活温度升高、酶解反应加快；温度过高、酶易失活一般：细菌一般：细菌3537；霉菌、酵母菌：；霉菌

45、、酵母菌：2530 放线菌放线菌2832 pH57酶解时间过长，再生率降低酶解时间过长，再生率降低高渗或等渗溶液中维持生存。高渗或等渗溶液中维持生存。细菌或放线菌：蔗糖、丁二酸钠；酵母菌：山梨醇、甘露醇；霉细菌或放线菌：蔗糖、丁二酸钠；酵母菌：山梨醇、甘露醇；霉菌：氯化钠菌：氯化钠酶浓度增加，原生质体形成率增大；过高使再生率降酶浓度增加，原生质体形成率增大；过高使再生率降低；过低不利于原生质体形成低；过低不利于原生质体形成二、原生质体诱变育种二、原生质体诱变育种由于失去细胞壁，对外界环境的影响更加敏由于失去细胞壁，对外界环境的影响更加敏感。感。适宜时期：对数生长期适宜时期：对数生长期适宜形态：

46、单个分散细胞，适宜形态：单个分散细胞，代谢旺盛、代谢旺盛、DNA复制活跃，复制活跃，易与诱变剂相互作用易与诱变剂相互作用与诱变剂接触面积大，诱变后与诱变剂接触面积大，诱变后易形成单菌落。易形成单菌落。三、原生质体再生三、原生质体再生原因：原因：重新合成细胞壁，恢重新合成细胞壁，恢复完整细胞形态，使复完整细胞形态，使之进一步生长、分裂之进一步生长、分裂和增殖。和增殖。v原生质体再生是原生原生质体再生是原生质体诱变、原生质体质体诱变、原生质体融合等技术处理细胞融合等技术处理细胞后，恢复微生物正常后，恢复微生物正常细胞形态的必经过程。细胞形态的必经过程。手段：再生培养基手段：再生培养基影响原生质体再

47、生因素影响原生质体再生因素1.菌体的生理状态菌体的生理状态2.稳定剂稳定剂3.酶的作用浓度及时间酶的作用浓度及时间4.再生培养基的组成再生培养基的组成5.培养基中水分培养基中水分年轻菌丝制备的原生质体再生能力强年轻菌丝制备的原生质体再生能力强维持高渗。维持高渗。1015蔗糖溶液、醇类、氯化钠等。蔗糖溶液、醇类、氯化钠等。时间不宜过长、浓度不宜过高时间不宜过长、浓度不宜过高通过试验确定最适培养基条件通过试验确定最适培养基条件碳源种类和浓度、钙、镁离子浓度碳源种类和浓度、钙、镁离子浓度对再生率影响较大对再生率影响较大再生培养基表面的水分应除去后，再涂布原生质体培养。再生培养基表面的水分应除去后，再

48、涂布原生质体培养。四、原生质体的融合四、原生质体的融合原生质体融合技术（原生质体融合技术（P68）：）：把两个亲株的把两个亲株的原生质体混合在一起，在融合剂原生质体混合在一起，在融合剂PEG和和Ca+作用下，发生原生质体的融合，促使两亲本作用下，发生原生质体的融合，促使两亲本的遗传物质进行交换，从而实现的遗传物质进行交换，从而实现遗传重组遗传重组。在适宜条件下，进行融合细胞的再生，获得在适宜条件下，进行融合细胞的再生，获得具有新的遗传性状的重组菌株。具有新的遗传性状的重组菌株。原生质体融合原生质体融合原生质体融合的一般过程（重点）原生质体融合的一般过程（重点）1.遗传标记的选择遗传标记的选择2

49、.两亲本原生质体的制备两亲本原生质体的制备3.原生质体的融合原生质体的融合4.再生再生5.融合子的选择融合子的选择大多采用大多采用营养缺陷型营养缺陷型或或抗药性标记抗药性标记，或，或利用亲本菌株的颜色、色素等自身遗传利用亲本菌株的颜色、色素等自身遗传标记更方便。标记更方便。酶处理，注意酶解温度、酶处理，注意酶解温度、时间及酶用量。时间及酶用量。PEG融合、电融合融合、电融合适合的再生培养基：高渗透压适合的再生培养基：高渗透压再生细胞壁形成完整细胞，恢复分裂繁再生细胞壁形成完整细胞，恢复分裂繁殖能力殖能力依靠两亲本的选择性遗传标记，在依靠两亲本的选择性遗传标记，在选择性培养基选择性培养基上，通过

50、上，通过两亲本的遗传标记互补挑选出融合子。两亲本的遗传标记互补挑选出融合子。本章小结本章小结一、概述一、概述1.菌种选育的目的（菌种选育的目的（P35）：）：2.菌种选育的基本理论：菌种选育的基本理论：3.遗传和变异的物质基础：遗传和变异的物质基础：提高产率、改进性能、提高产率、改进性能、产生新产物、减少多余组分产生新产物、减少多余组分遗传和变异、基因型和表型遗传和变异、基因型和表型DNAv遗传变异的类型（遗传变异的类型（P37）（熟悉）（熟悉）自发突变自发突变:微生物未经微生物未经人为人为诱变处理或杂交诱变处理或杂交等生物技术手段而自然发生地突变。等生物技术手段而自然发生地突变。v诱发突变诱