第十九单元第七章微生物遗传学(一)课件.ppt

1、遗传（遗传（heredity）:上一代生物将自身的一整套遗传基因稳定地上一代生物将自身的一整套遗传基因稳定地传递给下一代的特性传递给下一代的特性。变异（变异（variation）：生物体在某种外因或内因的作用下，发生遗生物体在某种外因或内因的作用下，发生遗传物质结构或数量的改变，而且这种改变稳传物质结构或数量的改变，而且这种改变稳定，具有可遗传性定，具有可遗传性。引言引言1.遗传与变异遗传与变异遗传保证了微生物种的相对稳定性、种的存在和延续，遗传保证了微生物种的相对稳定性、种的存在和延续，而变异则推动了种的进化和发展。而变异则推动了种的进化和发展。2.遗传型和表型遗传型和表型遗传型（遗传型（g

2、enotype）表型表型(phenotype)某一生物体个体所含有的全部遗传因子，某一生物体个体所含有的全部遗传因子，即基因的总和即基因的总和，又称为基因型。又称为基因型。某一生物体所具有的一切外表特征及内某一生物体所具有的一切外表特征及内在特性的总和在特性的总和。表型的实现是由生物体的表型的实现是由生物体的遗传型遗传型和和环境条件环境条件共同作用的结果。共同作用的结果。饰变（饰变（modification）表型的差异只与环境有关。不涉及遗传物质结构改变而只发生表型的差异只与环境有关。不涉及遗传物质结构改变而只发生在转录、转译水平上的表型改变。在转录、转译水平上的表型改变。谷氨酸发酵谷氨酸发酵

3、的温度敏感菌株在的温度敏感菌株在3030时菌体生长而不产生氨基时菌体生长而不产生氨基酸，但是当温度提高到酸，但是当温度提高到3737时，菌体大量合成谷氨酸。时，菌体大量合成谷氨酸。变异变异 遗传物质改变，导致表型改变遗传物质改变，导致表型改变 3.饰变与变异饰变与变异（遗传型变异（遗传型变异,基因突变）基因突变）特点：特点：遗传性、群体中极少数个体的行为遗传性、群体中极少数个体的行为 （自发突变频率通常为（自发突变频率通常为1010-6-6-10-10-9-9）特点：特点：暂时性、不可遗传性、表现为全部个体的行为。暂时性、不可遗传性、表现为全部个体的行为。微生物是遗传学研究中的明星微生物是遗传

4、学研究中的明星:微生物细胞结构简单，营养体一般为单倍体，方便建立纯系。微生物细胞结构简单，营养体一般为单倍体，方便建立纯系。很多常见微生物都易于人工培养，快速、大量生长繁殖很多常见微生物都易于人工培养，快速、大量生长繁殖。对环境因素的作用敏感，易于获得各类突变株，操作性强。对环境因素的作用敏感，易于获得各类突变株，操作性强。第一节第一节 遗传变异的物质基础遗传变异的物质基础一、证明核酸是遗传物质基础的三个经典实验一、证明核酸是遗传物质基础的三个经典实验二、遗传物质在细胞内存在部位和方式二、遗传物质在细胞内存在部位和方式一、三个经典实验一、三个经典实验1.经典转化实验经典转化实验:证明证明DNA

5、是遗传变异的物质基础。是遗传变异的物质基础。Avery在四十年代以更精密的实验设计重复了以上实验分别用S型菌中提取的DNA、RNA和蛋白质转化R型菌且DNA被酶降解破坏的抽提物无转化活性DNA是转化所必需的转化因子T2噬菌体感染实验噬菌体感染实验2.噬菌体感染实验（噬菌体感染实验（1952年，A.D.Hershey 和 M.Chase）3.植物病毒的重建实验证明杂种病毒的蛋白质外壳来自TMV还是HRV,可用血清学反应鉴定证明核酸（证明核酸（RNA）是遗传的物质基础是遗传的物质基础血清学反应说明病毒蛋白质的特性由核酸而定H.Fraenkel-Conrat(1956年)病斑的特性和病毒核酸一致二、

6、遗传物质在细胞内存在的部位和方式二、遗传物质在细胞内存在的部位和方式七个水平七个水平细胞水平细胞水平（单核，多核）（单核，多核）细胞核水平细胞核水平（真核，拟核）（真核，拟核）染色体水平染色体水平核酸水平核酸水平（DNA，部分病毒为部分病毒为RNA；双链，少数病毒为单链）双链，少数病毒为单链）基因水平基因水平（遗传功能单位）（遗传功能单位）密码子水平密码子水平（遗传信息单位）（遗传信息单位）核苷酸水平核苷酸水平（最低突变单位和交换单位）（最低突变单位和交换单位）（一套，两套（一套，两套,核外染色体）核外染色体）基因（基因（gene）是什么是什么?是实体，其物质基础是是实体，其物质基础是DNA（

7、或（或RNA）；）；是一个含有特定遗传信息的是一个含有特定遗传信息的DNA分子区段；分子区段；是遗传信息传递和性状分化发育的依据；是遗传信息传递和性状分化发育的依据；基因是可分的，根据功能不同，分为：基因是可分的，根据功能不同，分为：编码蛋白质的基因编码蛋白质的基因 结构基因（结构蛋白，酶）结构基因（结构蛋白，酶）调节基因（阻遏蛋白或激活蛋白）调节基因（阻遏蛋白或激活蛋白）无翻译产物的基因无翻译产物的基因 tRNA基因（简称基因（简称 tDNA）rRNA基因（简称基因（简称rDNA）不转录的不转录的DNA区段区段 启动子（启动子（promotor）操纵基因（操纵基因（operator）基因是一

8、个含有特定遗传信息的核苷酸序列，它基因是一个含有特定遗传信息的核苷酸序列，它是遗传的功能单位。是遗传的功能单位。第二节第二节 质粒质粒P196质粒（质粒（plasmid）一种独立于染色体外，能进行自主复制的细胞质遗传因子，一种独立于染色体外，能进行自主复制的细胞质遗传因子，主要存在于各种微生物细胞中。主要存在于各种微生物细胞中。附加体附加体(episome)指那些既可以指那些既可以整合到核染色体上，作为染色体的一部分而整合到核染色体上，作为染色体的一部分而进行复制，又可以再游离出来或携带一些寄主的染色体基因游进行复制，又可以再游离出来或携带一些寄主的染色体基因游离出来，这类质粒被称为附加体。离

9、出来，这类质粒被称为附加体。1、质粒的分子结构、质粒的分子结构(1)结构结构通常以共价闭合环状(covalently closed circle，简称CCC)的超螺旋双链DNA分子存在于细胞中；也发现有线型双链DNA质粒和RNA质粒；质粒分子的大小范围从1kb左右到1000kb；（细菌质粒多在10kb以内）2.质粒的分离质粒的分离碱提取法：碱提取法：菌体的培养和收集：菌体的培养和收集：一般采用丰富培养基对菌体进行培养，当一般采用丰富培养基对菌体进行培养，当细胞生长到细胞生长到指数期后期指数期后期时，离心收集细胞。时，离心收集细胞。溶菌：溶菌：一般用溶菌酶去壁以形成原生质体或原生质球。一般用溶菌

10、酶去壁以形成原生质体或原生质球。碱变性处理：碱变性处理：在在SDS等表面活性剂存在下加等表面活性剂存在下加NaOH液使液使pH升至升至12.4，可使菌体蛋白质、染色体，可使菌体蛋白质、染色体DNA以及质粒以及质粒DNA变性。变性。质粒复性：质粒复性：加入加入pH4.8的的KAc-HAc缓冲液，将提取液调至中性缓冲液，将提取液调至中性，由于质粒分子量小而容易复性，并稳定存在于溶液中；染色体由于质粒分子量小而容易复性，并稳定存在于溶液中；染色体DNA分分子量太大，在复性过程中形成子量太大，在复性过程中形成DNA之间的交联导致其形成更大分子的之间的交联导致其形成更大分子的不溶性物质。不溶性物质。离心

11、分离：离心分离：经高速离心可以使细胞碎片和已变性的菌体蛋白及染经高速离心可以使细胞碎片和已变性的菌体蛋白及染色体色体DNA一起沉淀，上清液中主要是质粒一起沉淀，上清液中主要是质粒DNA，经乙醇沉淀后，可获经乙醇沉淀后，可获得质粒得质粒DNA。（参见（参见 P197）3.质粒的检测质粒的检测t 提取所有胞内提取所有胞内DNA后电镜观察；后电镜观察；t 氯化铯-溴化乙啶密度梯度超速离心；超速离心；t 对于实验室常用菌，可用质粒所带的某些特点，对于实验室常用菌，可用质粒所带的某些特点，如抗药性初步判断。如抗药性初步判断。对于由于三种构型同时存在时造成的多带现象（提取质粒时造成对于由于三种构型同时存在

12、时造成的多带现象（提取质粒时造成或自然存在），可以进行特异性单酶切，使其成为一条带。或自然存在），可以进行特异性单酶切，使其成为一条带。t 琼脂糖凝胶电泳后观察；琼脂糖凝胶电泳后观察；4.质粒的特性质粒的特性(1)位于核基因组外；位于核基因组外；(3)自主复制；自主复制；(2)cccDNA链霉菌和酵母菌中发现了线状链霉菌和酵母菌中发现了线状dsDNA质粒和质粒和RNA质粒质粒(4)有的质粒可整合到核染色体上；有的质粒可整合到核染色体上；(5)可重组（质粒与质粒间，质粒与染色体间）；可重组（质粒与质粒间，质粒与染色体间）；(6)人为消除（丫叮类，人为消除（丫叮类，UV，电离辐射，利福平等）电离辐

13、射，利福平等）(7)有的质粒可在细胞间转移（有的质粒可在细胞间转移（F因子，因子，R因子）因子）质粒所含的基因对宿主细胞一般是非必需的；质粒所含的基因对宿主细胞一般是非必需的；有时能赋予宿主细胞以特殊的机能，从而使宿主得到生长优势有时能赋予宿主细胞以特殊的机能，从而使宿主得到生长优势5、质粒的主要类型、质粒的主要类型根据质粒所根据质粒所编码的功能编码的功能和赋予宿主和赋予宿主的表型效应的表型效应分类分类:致育因子致育因子（Fertility factor，F因子）因子）抗性质粒抗性质粒（Resistance factor，R因子）因子）产细菌素的质粒产细菌素的质粒（Bacteriocin pr

14、oduction plasmid）毒性质粒毒性质粒（virulence plasmid）代谢质粒代谢质粒（Metabolic plasmid）隐秘质粒隐秘质粒（cryptic plasmid）2m质粒质粒（参见（参见 P197）(1)致育因子致育因子(Fertility factor，F因子因子)又称F质粒，其大小约100kb，这是最早发现的一种与大肠杆菌的有性生殖现象（接合作用）有关的质粒。携带F质粒的菌株称为F+菌株（相当于雄性），无F质粒的菌株称为F-菌株（相当于雌性）。F因子能以游离状态因子能以游离状态(F+)和和以与染色体相结合的状态以与染色体相结合的状态(Hfr)存在于细胞中，所以

15、存在于细胞中，所以又称之为又称之为附加体附加体(episome)。在志贺氏菌属（在志贺氏菌属（Shigella）、沙门氏菌属（）、沙门氏菌属（Salmonella）和链）和链球菌属（球菌属（Streptococcus）等其他细菌中也发现了与大肠杆菌）等其他细菌中也发现了与大肠杆菌类似的致育因子。类似的致育因子。在放线菌中，天蓝色链霉菌含有在放线菌中，天蓝色链霉菌含有SCP1和和SCP2两种致育质粒两种致育质粒，这两种质粒在天蓝色链霉菌的接合过程中起重要作用，带，这两种质粒在天蓝色链霉菌的接合过程中起重要作用，带动染色体从供体细胞向受体细胞转移。动染色体从供体细胞向受体细胞转移。（参见（参见 P

16、197）(2)抗性因子（抗性因子（Resistance factor，R因子）因子）包括抗药性和抗重金属二大类，简称R质粒。R100质粒质粒(89kb)可使宿主对可使宿主对下列药物及重金属具有抗性：下列药物及重金属具有抗性：汞（汞（mercuric ion，mer）四环素（四环素（tetracycline，tet）链霉素链霉素(Streptomycin,str)、磺胺磺胺(Sulfonamide,sul)、氯霉素氯霉素(Chlorampenicol,cml)夫西地酸（夫西地酸（fusidic acid，fus）负责这些抗性的基因是成簇地负责这些抗性的基因是成簇地存在于抗性质粒上存在于抗性质粒上

17、。抗性质粒在细菌间的传递是细菌抗性质粒在细菌间的传递是细菌产生抗药性的重要原因之一。产生抗药性的重要原因之一。细菌素细菌素抗生素抗生素抑制或杀死近缘，甚至同种不同株的细菌抑制或杀死近缘，甚至同种不同株的细菌较广的抗菌谱通过核糖体直接合成的多肽类物质通过核糖体直接合成的多肽类物质一般是次级代谢产物编码细菌素的结构基因及相关的基因一般位编码细菌素的结构基因及相关的基因一般位于质粒或转座子上于质粒或转座子上一般无直接的结构基因，相关酶的基因多在染色体上(3)Col 质粒：产细菌素的质粒质粒：产细菌素的质粒（Bacteriocin production plasmid）细菌素结构基因、涉及细菌素运输及

18、发挥作用（processing）的蛋白质的基因、赋予宿主对该细菌素具有“免疫力”的相关产物的基因一般都位于质粒或转座子上，因此，细菌素可以杀死同种但不携带该质粒的菌株。细菌素：细菌素：许多细菌都能产生某些代谢产物，抑制或杀死其他近缘细许多细菌都能产生某些代谢产物，抑制或杀死其他近缘细菌或同种不同菌株，因为这些代谢产物是由质粒编码的蛋白质，不菌或同种不同菌株，因为这些代谢产物是由质粒编码的蛋白质，不象抗生素那样具有很广的杀菌谱，所以称为细菌素（象抗生素那样具有很广的杀菌谱，所以称为细菌素（bacteriiocin）细菌素种类很多细菌素种类很多,一般根据产生菌的种类进行命名：一般根据产生菌的种类进

19、行命名：大肠杆菌（大肠杆菌（E.coli）产生的细菌素为产生的细菌素为colicins（大肠杆菌素）大肠杆菌素），而质粒被称为而质粒被称为Col质粒。此外还有枯草杆菌素、乳酸菌素、根质粒。此外还有枯草杆菌素、乳酸菌素、根瘤菌素等。瘤菌素等。由G+细菌产生的细菌素或与细菌素类似的因子与colicins有所不同，但通常也是由质粒基因编码，有些甚至有商业价值，例如一种乳酸细菌产生的细菌素NisinA能强烈抑制某些G+细菌的生长，而被用于食品工业的保藏。大肠杆菌素是产自大肠杆菌的一种蛋白质，具有专一性地杀大肠杆菌素是产自大肠杆菌的一种蛋白质，具有专一性地杀死其亲缘关系很近的、不具死其亲缘关系很近的、不

20、具Col质粒的其它肠道细菌的功能。质粒的其它肠道细菌的功能。(4)毒性质粒（毒性质粒（virulence plasmid）许多致病菌的致病性是由其所携带的质粒引起的，这些质粒具有编码毒素的基因，其产物对宿主（动物、植物）造成伤害。产毒素大肠杆菌是引起人类和动物腹泻的主要病原菌之一，其中许多菌株含有为一种或多种肠毒素编码的质粒。苏云金杆菌含有编码内毒素(伴孢晶体中)的质粒根癌土壤杆菌所含Ti质粒是引起双子叶植物冠瘿瘤的致病因子(5)代谢质粒（代谢质粒（Metabolic plasmid）质粒上携带有有利于微生物生存的基因，如能降解某些基质质粒上携带有有利于微生物生存的基因，如能降解某些基质的酶，

21、进行共生固氮，或产生抗生素（某些放线菌）等。的酶，进行共生固氮，或产生抗生素（某些放线菌）等。将复杂的有机化合物降解成能被其作为碳源和能源利用的简单将复杂的有机化合物降解成能被其作为碳源和能源利用的简单形式形式，环境保护方面具有重要的意义。环境保护方面具有重要的意义。假单胞菌：假单胞菌：具有降解一些有毒化合物，如芳香簇化合物具有降解一些有毒化合物，如芳香簇化合物(苯苯)、农药、农药(2,4dichlorophenoxyacetic acid)、辛烷和樟脑等的能力。辛烷和樟脑等的能力。降解质粒降解质粒TOL质粒：含分解甲苯的基因；质粒：含分解甲苯的基因；CAM-OCT质粒：含分解樟脑辛烷的基因质

22、粒：含分解樟脑辛烷的基因(6)隐秘质粒（隐秘质粒（cryptic plasmid）它们存在的生物学意义，目前几乎不了解。在应用上，很多隐秘质粒被加以改造作为基因工程的载体在应用上，很多隐秘质粒被加以改造作为基因工程的载体（一般加上抗性基因）（一般加上抗性基因）隐秘质粒不显示任何表型效应，它们的存在只有通过物理的隐秘质粒不显示任何表型效应，它们的存在只有通过物理的方法，例如用凝胶电泳检测细胞抽提液等方法才能发现。方法，例如用凝胶电泳检测细胞抽提液等方法才能发现。(7)2m质粒质粒 大多数酵母菌含有一种称为大多数酵母菌含有一种称为2m的质粒的质粒,属隐秘质粒属隐秘质粒 -长为长为2 m的的6kb的

23、环状双链的环状双链DNA分子分子 -位于酵母细胞核内，位于酵母细胞核内，50100拷贝拷贝 -只携带与复制和重组有关的只携带与复制和重组有关的4 个基因，无遗传表型个基因，无遗传表型 -质粒上有两个质粒上有两个600bp长的长的IR，被一个，被一个2.7kb区域和一个区域和一个2.3kb 小区域所间隔小区域所间隔 -两个两个IR上都有一个专一重组位点上都有一个专一重组位点(FRT)，经过重组，可使质，经过重组，可使质 粒互变异构成粒互变异构成A型和型和B型。型。意义：意义：2m质粒是酵母菌中进行分子克隆和基因工程的重要载体，因质粒是酵母菌中进行分子克隆和基因工程的重要载体，因此以它为基础构建的

24、克隆和表达载体已得到广泛的应用。另一方此以它为基础构建的克隆和表达载体已得到广泛的应用。另一方面，该质粒也是研究真核基因调控和染色体复制的一个十分有用面，该质粒也是研究真核基因调控和染色体复制的一个十分有用的模型的模型。根据拷贝数或复制特点，质粒可分为：根据拷贝数或复制特点，质粒可分为：高拷贝数高拷贝数(high copy number)质粒质粒（每个细胞中可以有10100个拷贝,其复制和染色体的复制不同步）如ColE1、ColE2等 松弛型质粒松弛型质粒(relaxed plasmid)低拷贝数低拷贝数(low copy number)质粒质粒（每个细胞中只有12个拷贝,其复制行为与染色体的

25、复制同步）如F因子，R100 严谨型质粒严谨型质粒(stringent plasmid)窄宿主范围质粒窄宿主范围质粒(narrow host range plasmid)（只能在一种特定的宿主细胞中复制）（只能在一种特定的宿主细胞中复制）广宿主范围质粒广宿主范围质粒(broad host range plasmid)（可以在许多种细菌中复制）第三节第三节 基因突变的规律及类型基因突变的规律及类型野生型野生型:-从自然界分离到的菌株一般称野生型菌株从自然界分离到的菌株一般称野生型菌株（wild type strain），简称野生型。），简称野生型。突变株突变株:-野生型经突变后形成的带有新性状的

26、菌株，野生型经突变后形成的带有新性状的菌株，称为突变株（称为突变株（mutant）。）。一、突变（一、突变（mutation）突变指细胞内遗传物质的分子结构或数量发生变化的现象。包突变指细胞内遗传物质的分子结构或数量发生变化的现象。包括基因突变（又称点突变）和染色体畸变。括基因突变（又称点突变）和染色体畸变。基因突变基因突变（gene mutation）:是指一个基因内部遗传结构或DNA序列的任何改变，涉及一对或少数几对碱基的置换、缺失或插入，因其发生的范围很小，所以又称点突变（point mutation）。染色体畸变染色体畸变（chromosomal aberration）:是指染色体较大

27、范围内结构的变化，如缺失、重复、倒位、易位等以及染色体数目的变化。同种碱基的置换同种碱基的置换不同种碱基的置换不同种碱基的置换只涉及只涉及1对碱基对碱基被另被另1对对碱基所碱基所置换置换1个或少数几个碱基对的插个或少数几个碱基对的插入或缺失，使该部位后面遗入或缺失，使该部位后面遗传密码的阅读框架发生改变，传密码的阅读框架发生改变，并进一步引起转录和转译错并进一步引起转录和转译错误的突变。误的突变。遗传物质在染色体水遗传物质在染色体水平发生较大范围的变平发生较大范围的变化化DNA分分子中子中1对或少对或少数几对数几对碱基的碱基的突变突变二、基因突变的特点（规律）二、基因突变的特点（规律）自发性自

28、发性菌种衰退的根本原因不对应性不对应性突变的性状与突变的原因无关系稀有性稀有性自发突变几率低（10-610-10）突变率：突变率：每一个细胞在每一世代中发生某一性状突变的几率。每一个细胞在每一世代中发生某一性状突变的几率。（某一单位群体在每一世代中产生突变株的数目）（某一单位群体在每一世代中产生突变株的数目）独立性独立性某基因的突变率不受它种基因突变率的影响可诱变性可诱变性自发突变的频率可因诱变剂的影响而提高（10-310-6）稳定性稳定性基因突变后的新性状是稳定的可逆性可逆性野生型菌株某一性状可发生正向突变，也可发生反向的回复突变。证明突变的性状与引起突变的原因间无直接对应关系！证明突变的性

29、状与引起突变的原因间无直接对应关系！如何证明基因突变的非对应性？如何证明基因突变的非对应性？三个经典实验三个经典实验:1.变量实验2.涂布实验3.影印实验三、基因突变自发性和不对应性的实验证明三、基因突变自发性和不对应性的实验证明1）变量实验（）变量实验（fluctuation analysis）Salvador Luria&Max Delbruck(1943)对噬菌体对噬菌体T1敏感的敏感的E.coli 对数期培养物对数期培养物，稀释至，稀释至103/mL,分装两试管，各分装两试管，各10 mL 与甲管分装的各小管与甲管分装的各小管同时保温同时保温2436h甲管 乙管 2）Newcombe的涂布实验（的涂布实验（1949）在涂布过的一组中，在涂布过的一组中，共长出抗性菌落共长出抗性菌落353个，比未经涂布过的个，比未经涂布过的（28个菌落）高得多个菌落）高得多约繁殖了约繁殖了12.3代代选用对选用对T1 噬菌体敏感的噬菌体敏感的E.coli，以相等数目涂布于以相等数目涂布于12个平板上个平板上3）影印实验（）影印实验（replica plating）Joshua Lederberg and Esther Lederberg（1952）通过使菌不接触抗性环境而检查其抗性菌落的方法