组香菇多糖对荷瘤小鼠胸腺树突状细胞表达的影响课件.ppt

1、组香菇多糖对荷瘤小鼠胸腺树突状细胞表达的影响背景背景 肿瘤已成为人类健康的头号杀手，肿瘤的治疗研肿瘤已成为人类健康的头号杀手，肿瘤的治疗研究也是生物医学领域一个炙手可热的方向。究也是生物医学领域一个炙手可热的方向。*由于肿瘤抗原的存在，势必被机由于肿瘤抗原的存在，势必被机体免疫系统所识别，并由此激发体免疫系统所识别，并由此激发特异性免疫反应，包括特异性免疫反应，包括细胞免疫细胞免疫和和体液免疫体液免疫。*在细胞免疫方面，在细胞免疫方面，T T淋巴细胞淋巴细胞、K K细胞细胞（抗体依赖性细胞毒细胞）、（抗体依赖性细胞毒细胞）、NKNK细胞细胞（自然杀伤细胞）和（自然杀伤细胞）和巨噬巨噬细胞细胞对

2、肿瘤细胞均具杀伤作用。对肿瘤细胞均具杀伤作用。*肿瘤的体液免疫主要是肿瘤的体液免疫主要是抗肿瘤抗抗肿瘤抗体体对肿瘤细胞的破坏效应。对肿瘤细胞的破坏效应。研究现状研究现状 从香菇的子实体提取物中获取的主要有效分从香菇的子实体提取物中获取的主要有效分香菇多糖，香菇多糖，作为一种天然的免疫调节剂，对各种恶性肿瘤有较好的防治作为一种天然的免疫调节剂，对各种恶性肿瘤有较好的防治作用作用1。香菇多糖在实验动物中有促进香菇多糖在实验动物中有促进B淋巴细胞的分化、增殖，增淋巴细胞的分化、增殖，增强免疫功能的作用强免疫功能的作用2,3。Mushiake等等4的研究结果还表明：香菇多糖能通过改善的研究结果还表明：

3、香菇多糖能通过改善树突树突状细胞状细胞的功能，调节的功能，调节DCs介导的特异性免疫，增强抗瘤活性，介导的特异性免疫，增强抗瘤活性，最终提高荷瘤鼠的存活率。最终提高荷瘤鼠的存活率。树突状细胞与抗癌树突状细胞与抗癌树突状细胞树突状细胞树突状细胞树突状细胞来源来源 人树突状细胞起源于人树突状细胞起源于造血干细胞造血干细胞。DCDC的来源有的来源有两条途径两条途径。树突状细胞与抗癌树突状细胞与抗癌树突状细胞树突状细胞树突状细胞树突状细胞主要功能主要功能 机体功能最强的专职机体功能最强的专职抗原抗原递呈细胞递呈细胞(APC)(APC)树突状细胞与抗癌树突状细胞与抗癌树突状细胞抗肿瘤树突状细胞抗肿瘤 外

4、周外周DCsDCs可迁入胸腺，以便更高效率可迁入胸腺，以便更高效率地诱导地诱导T T细胞分化增殖，由它激活的细胞细胞分化增殖，由它激活的细胞免疫应答在机体抗肿瘤中起主导作用免疫应答在机体抗肿瘤中起主导作用6,76,7。1 1、MHC-MHC-类和类和MHC-MHC-类分子类分子抗原呈递分子抗原呈递分子共刺激分子共刺激分子第二信号第二信号2 2、DCDC与与T T细胞结合细胞结合IL-12IL-12、IL-18IL-18T T细胞增殖，诱导细胞增殖，诱导CTLCTL生成，主生成，主导导Th1Th1型免疫应答，利于肿瘤清除；型免疫应答，利于肿瘤清除；激活激活穿孔素穿孔素P P颗粒酶颗粒酶B B和和

5、FasL/FasFasL/Fas介导的途径增介导的途径增强强NKNK细胞毒作用；细胞毒作用；3 3、趋化因子趋化因子(CCK)(CCK)：CD4+TCD4+T趋化、长期存在；正反趋化、长期存在；正反馈旁分泌方式活化馈旁分泌方式活化DCDC；某些某些抗血管生成物质抗血管生成物质(如如IL-12IL-12、IFN-)IFN-)及前及前血管生成因子而影响肿瘤血管的形成。血管生成因子而影响肿瘤血管的形成。CD8+TCD8+T香菇多糖与香菇多糖与DCDC香菇多糖香菇多糖香菇多糖香菇多糖活性成分：活性成分：(13)D 葡聚糖葡聚糖香菇多糖与香菇多糖与DCDC香菇多糖抗肿瘤香菇多糖抗肿瘤 本实验将通过观察本

6、实验将通过观察胸腺结构胸腺结构，S100S100和和CD1aCD1a免疫组化标免疫组化标记（记（S100S100标记成熟的标记成熟的TDCsTDCs，用，用CD1aCD1a标记未成熟标记未成熟TDCsTDCs。），计算），计算S100+S100+细胞在参照物细胞在参照物(胸腺胸腺)中所占中所占面积面积百分比百分比，计算，计算TDCsTDCs密度密度，测算，测算胸腺指数胸腺指数、肿瘤指数肿瘤指数、抑瘤率抑瘤率等指标，探讨香菇多糖对荷瘤小鼠等指标，探讨香菇多糖对荷瘤小鼠S100+S100+胸腺胸腺树突状细胞树突状细胞(TDCs)(TDCs)和和CD1a+TDCsCD1a+TDCs表达的影响。表达的

7、影响。原创点：原创点：阐明阐明香菇多糖香菇多糖能增加能增加TDCsTDCs数量及促进其数量及促进其分化成熟。分化成熟。实验设计实验设计实验室要求实验室要求实验步骤实验步骤观察指标观察指标统计分析统计分析预期实验结果预期实验结果实验室要求实验仪器实验仪器实验对象实验对象药品试剂药品试剂实验室要求实验仪器 SABC试剂盒试剂盒 精密天平精密天平 组织匀浆机组织匀浆机 泡沫盒泡沫盒 放液氮的小型保温杯或者液氮罐放液氮的小型保温杯或者液氮罐 血球计数板血球计数板 进口样本冻存管进口样本冻存管5050个个 小鼠取组织学标本用手术器械小鼠取组织学标本用手术器械2 2套套 1ml1ml注射器注射器 30 3

8、0支支 DT2000图像分析软件图像分析软件V2.0 统计分析软件统计分析软件SPSS19.0实验室要求实验对象 清洁级清洁级ICR小鼠，雌雄各半，小鼠，雌雄各半，20-25g，60只只（由浙江大学实验中心提供）（由浙江大学实验中心提供）实验室要求药品试剂 小鼠小鼠S180S180细胞株细胞株 兔抗小鼠兔抗小鼠S100S100 兔抗小鼠兔抗小鼠CD1aCD1a 注射用香菇多糖注射用香菇多糖 环磷酰胺环磷酰胺 4%4%甲醛固定液甲醛固定液 1500ml 1500ml 组织固定用组织固定用250ml 4%250ml 4%甲醛甲醛2 2瓶（敞口瓶瓶（敞口瓶+瓶盖）瓶盖）生理盐水生理盐水1000ml1

9、000ml 液氮液氮 5 L 5 L实验方法实验方法 荷瘤荷瘤S180S180鼠模型的建立鼠模型的建立 动物分组动物分组 普通光镜检查普通光镜检查 免疫组织化学标记和观察分析免疫组织化学标记和观察分析 胸腺指数，肿瘤指数，抑瘤率的计算胸腺指数，肿瘤指数，抑瘤率的计算实验方法实验方法荷瘤荷瘤S180S180鼠模型的建立鼠模型的建立 取已接种取已接种7 d7 d肿瘤生长良好的肿瘤生长良好的S180S180腹水型小鼠，腹水型小鼠，抽吸抽吸乳白色的浓稠腹水乳白色的浓稠腹水以无菌生理盐水稀释以无菌生理盐水稀释后，用血球计数板进行活细胞计数，调整细后，用血球计数板进行活细胞计数，调整细胞数为胞数为1 11

10、0107 7，制成，制成肿瘤细胞悬液肿瘤细胞悬液(活细胞率活细胞率95%)95%)。在小鼠右前腋皮下注射在小鼠右前腋皮下注射0.2 ml S1800.2 ml S180细胞悬液，细胞悬液，制成实体瘤模型。制成实体瘤模型。实验方法实验方法动物分组动物分组组号组号(n=10)组名组名处理处理第第1 1天天第第2828天天第第9 9天天生理盐水对照组生理盐水对照组静脉注射静脉注射0.2 ml0.2 ml生理盐水生理盐水制片制片HEHE染色染色观察观察胸腺结构胸腺结构S100S100和和CD1aCD1a免疫免疫组化标记组化标记计算计算S100+S100+细胞细胞在参照物在参照物(胸腺胸腺)中中所占所占

11、面积百分比面积百分比计算计算TDCsTDCs密度密度测算胸腺指数、测算胸腺指数、肿瘤指数、抑瘤率肿瘤指数、抑瘤率等指标等指标荷瘤模型组荷瘤模型组接种肿瘤接种肿瘤每日静脉注射每日静脉注射生理盐水生理盐水0.2 ml0.2 ml荷瘤环磷酰胺组荷瘤环磷酰胺组每日静脉注射每日静脉注射环磷酰胺环磷酰胺0.2 ml(0.2 ml(每只每次每只每次1 mg)1 mg)荷瘤香菇多糖低荷瘤香菇多糖低浓度组浓度组每日静脉注射每日静脉注射香菇多糖香菇多糖0.1 ml(0.1 ml(每只每次每只每次0.0125 mg)0.0125 mg)荷瘤香菇多糖中荷瘤香菇多糖中浓度组浓度组每日静脉注射香菇多糖每日静脉注射香菇多糖

12、0.3 ml(0.3 ml(每只每次每只每次0.0375 mg)0.0375 mg)荷瘤香菇多糖高荷瘤香菇多糖高浓度组浓度组每日静脉注射香菇多糖每日静脉注射香菇多糖0.5 ml(0.5 ml(每只每次每只每次0.625 0.625 mg)mg)实验方法实验方法普通光镜检查胸腺结构普通光镜检查胸腺结构 小鼠断头处死，剥离胸腺组织，称重后入小鼠断头处死，剥离胸腺组织，称重后入4%4%多聚甲醛溶液中固定。多聚甲醛溶液中固定。低温石蜡包埋制片，低温石蜡包埋制片，HEHE染色染色，显微镜观察。，显微镜观察。实验方法实验方法免疫组织化学标记和观察分析免疫组织化学标记和观察分析将胸腺石蜡标本制成厚将胸腺石蜡

13、标本制成厚4m4m的石蜡切片。的石蜡切片。0.1%0.1%胰蛋白酶消化胰蛋白酶消化30 30 min(37)min(37)，一抗，一抗44过夜过夜(S100(S100和和CD1aCD1a工作浓度均为工作浓度均为1150)1150)。按试剂盒。按试剂盒作作SABCSABC免疫组化技术处理。免疫组化技术处理。DABDAB显色。显色。阴性对照：以阴性对照：以PBSPBS代替一抗。代替一抗。用用DT2000DT2000图像分析软件图像分析软件V2.0V2.0计数单位面积胸腺切片中阳性颗粒的个数和计数单位面积胸腺切片中阳性颗粒的个数和面积，计算面积，计算S100+S100+细胞在参照物细胞在参照物(胸腺

14、胸腺)中所占中所占面积百分比面积百分比。使用使用DigiLab 2.0DigiLab 2.0、Motic Images Plus 2.0 MLMotic Images Plus 2.0 ML软件计算软件计算TDCsTDCs密度：每密度：每组随机选取组随机选取5050个高倍视野拍照个高倍视野拍照(0.068 mm(0.068 mm2 2)，计数，计数S100+S100+细胞的个数。细胞的个数。TDCsTDCs密度密度=50=50个高倍视野个高倍视野S100+S100+细胞总和细胞总和/3.4 mm/3.4 mm2 2(阳性颗粒最小直阳性颗粒最小直径径 2m 2m 时认作一个细胞时认作一个细胞)。

15、实验方法实验方法观测、计算及分析观测、计算及分析观测指标观测指标 肿瘤质量肿瘤质量 胸腺质量胸腺质量 小鼠体质量小鼠体质量计算计算 胸腺指数胸腺指数(mg/g)(mg/g)=胸腺质量胸腺质量(mg)/(mg)/小鼠体质量小鼠体质量(g)(g)肿瘤指数肿瘤指数(mg/g)(mg/g)=肿瘤质量肿瘤质量(mg)/(mg)/小鼠体质量小鼠体质量(g)(g)抑瘤率抑瘤率(%)(%)=(=(荷瘤模型组肿瘤质量荷瘤模型组肿瘤质量-荷瘤药物实验组肿瘤质量荷瘤药物实验组肿瘤质量)/)/荷瘤模型组肿瘤质量荷瘤模型组肿瘤质量100%100%统计分析统计分析 采用统计学软件包采用统计学软件包SPSS19.0SPSS

16、19.0，结果用，结果用x xs s表示，各实验组之间的表示，各实验组之间的比较采用单因素方差分析，显著性检验水准为比较采用单因素方差分析，显著性检验水准为=0.05=0.05。预期实验结果切片观察切片观察胸腺结构胸腺结构 接种肿瘤小鼠胸腺均萎缩接种肿瘤小鼠胸腺均萎缩：胸腺皮质变薄，胸腺细胞稀疏，：胸腺皮质变薄，胸腺细胞稀疏，皮、髓质分界不清；胸腺皮、髓质的细胞密度比例降低。而皮、髓质分界不清；胸腺皮、髓质的细胞密度比例降低。而电镜下观察到胸腺细胞退化萎缩，出现了大量的脂肪、纤维、电镜下观察到胸腺细胞退化萎缩，出现了大量的脂肪、纤维、凋亡的胸腺细胞，线粒体肿胀，嵴减少，出现大小不等的空凋亡的胸

17、腺细胞，线粒体肿胀，嵴减少，出现大小不等的空泡，核固缩。泡，核固缩。萎缩程度萎缩程度：预期实验结果HEHE染色染色切片观察切片观察 对比观察免疫组化染色及对比观察免疫组化染色及HEHE染色切片，可见染色切片，可见HEHE染色染色中显示的中显示的TDCsTDCs多数能表达多数能表达S100S100和和CD1aCD1a。S100S100标记示标记示TDCsTDCs胞浆内有深棕色颗粒表达胞浆内有深棕色颗粒表达(部分部分TDCsTDCs细胞核也有表达细胞核也有表达)。CD1aCD1a标记主要表达在标记主要表达在TDCsTDCs细胞膜上，呈棕色阳性反细胞膜上，呈棕色阳性反应。应。环磷酰胺组环磷酰胺组、荷

18、瘤香菇多糖组荷瘤香菇多糖组胸腺皮质中见大量胸腺皮质中见大量S100S100阳性表达的阳性表达的TDCsTDCs，髓质有数量较少的，髓质有数量较少的TDCsTDCs，但，但细胞体积较大；而细胞体积较大；而正常对照组正常对照组、荷瘤模型组荷瘤模型组胸腺髓胸腺髓质质S100S100阳性表达阳性表达TDCsTDCs量很少。量很少。预期实验结果预期实验结果 S100+S100+细胞在参照物细胞在参照物(胸腺胸腺)中所占中所占面积百分比面积百分比 TDCsTDCs密度密度 光镜下药物组光镜下药物组TDCsTDCs数量明显增加，特别在胸腺皮质密度很高。数量明显增加，特别在胸腺皮质密度很高。胸腺指数胸腺指数(

19、mg/g)(mg/g)接种肿瘤小鼠接种肿瘤小鼠胸腺指数均下降，与正常对照组相比具有统计学胸腺指数均下降，与正常对照组相比具有统计学意义意义 荷瘤环磷酰胺组荷瘤环磷酰胺组小鼠胸腺指数回升，其指数与荷瘤模型组相比具小鼠胸腺指数回升，其指数与荷瘤模型组相比具有统计学意义有统计学意义(P0.01)(P0.01)。荷瘤香菇多糖组荷瘤香菇多糖组小鼠胸腺指数回升，其指数与荷瘤模型组相比具小鼠胸腺指数回升，其指数与荷瘤模型组相比具有统计学意义有统计学意义(P0.01)(P0.01)。且随浓度升高，指数回升更多，指数更。且随浓度升高，指数回升更多，指数更加接近于正常对照组小鼠。加接近于正常对照组小鼠。肿瘤指数肿

20、瘤指数(mg/g)(mg/g)抑瘤率抑瘤率(%)(%)可行性分析 实验动物和实验器材、试剂由实验中心提供，实验时间充裕，经费充裕。实验设计均是基于一定的文献基础，根据前人的实验结果，该实验流程和方法是完全可行的。讨论讨论 研究表明，香菇多糖具广泛的免疫调节作用，可通过研究表明，香菇多糖具广泛的免疫调节作用，可通过增加脾细胞增殖和增加脾细胞增殖和IL-2IL-2的表达水平，以及通过激活脾的表达水平，以及通过激活脾细胞受体信号转导等方式增强免疫细胞受体信号转导等方式增强免疫55。DCsDCs是目前发现的功能最强的抗原提呈细胞，它几乎是目前发现的功能最强的抗原提呈细胞，它几乎存在于所有哺乳类动物组织

21、中，通过识别和传递抗原存在于所有哺乳类动物组织中，通过识别和传递抗原肽给肽给T T细胞而参与免疫，外周细胞而参与免疫，外周DCsDCs可迁入胸腺，以便更可迁入胸腺，以便更高效率地诱导高效率地诱导T T细胞分化增殖，由它激活的细胞免疫细胞分化增殖，由它激活的细胞免疫应答在机体抗肿瘤中起主导作用应答在机体抗肿瘤中起主导作用6,76,7。荷瘤机体免疫机制的失能荷瘤机体免疫机制的失能不是由于缺乏肿瘤抗原，可不是由于缺乏肿瘤抗原，可能就是由于能就是由于DCsDCs的功能缺陷导致这些抗原不能被有效的功能缺陷导致这些抗原不能被有效地提呈给地提呈给T T淋巴细胞，从而不能诱导细胞毒性淋巴细胞，从而不能诱导细胞

22、毒性T T淋巴细淋巴细胞产生有效而特异性的免疫应答。胞产生有效而特异性的免疫应答。讨论讨论 TDCs有多种在细胞水平标记和识别的方法。通常用有多种在细胞水平标记和识别的方法。通常用S100标标记成熟的记成熟的TDCs，用，用CD1a标记未成熟标记未成熟TDCs。本实验通过多种本实验通过多种树突状细胞标记物联合标记，结合光镜形态观察，表明小树突状细胞标记物联合标记，结合光镜形态观察，表明小鼠荷鼠荷S180肉瘤后，肉瘤后，TDCs数量减少，而在应用香菇多糖后数量减少，而在应用香菇多糖后TDCs数量增加。尤其是数量增加。尤其是S100+TDCs，即成熟，即成熟TDCs增加，且增加，且不仅出现在皮质，在胸腺髓质也出现较多体积较大的成熟不仅出现在皮质，在胸腺髓质也出现较多体积较大的成熟TDCs。与其他各组比较，荷瘤香菇多糖组。与其他各组比较，荷瘤香菇多糖组TDCs密度增加具密度增加具有统计意义有统计意义(P0.01)。实验讨论 以上结果表明：以上结果表明：香菇多糖能增加香菇多糖能增加TDCsTDCs数量数量并促进其分化成熟，增强其抗原提呈能力，并促进其分化成熟，增强其抗原提呈能力，从而加强活化从而加强活化T T细胞启动细胞免疫功能。细胞启动细胞免疫功能。这可能是香菇多糖抗肿瘤的机理之一。这可能是香菇多糖抗肿瘤的机理之一。