脑心通06号对血管平滑肌细胞增殖影响课题研究科会(西安交大)课件.ppt

1、2013N-KH-062013N-KH-06号号 正常状态下,平滑肌细胞的功能主要是通过不断收缩与松弛起到调节血流的作用.在一些刺激作用下(如脂蛋白的作用,由损伤引起的炎症反应)平滑肌细胞可出现表型的改变,细胞呈收缩型向合成型的转换.当处于合成型,平滑肌细胞通过表面的受体接受外来生长因子的调节而大量增殖,由中膜向内膜迁移,在内膜增生,合成包括胶原蛋白,弹性纤维和多糖等大量细胞外基质.使得平滑肌细胞在动脉粥样硬化的纤维性增生中起重要作用.ox-LDL通过诱发一系列与细胞增殖有关的反应,包括增加原癌基因(如c-fos,c-sis基因)的表达,刺激内皮细胞,单核巨噬细胞,血小板和增生的平滑肌细胞自身

2、释放大量的生长因子和细胞因子,促进平滑肌细胞增殖.一些离体实验提示他汀类药物可以直接或间接参与平滑肌细胞凋亡,并且在24小时观察到细胞周期停滞于G1 期.氟伐他汀、洛伐他汀、辛伐他汀和西伐他汀(cerivastatin)均呈剂量依赖性抑制鼠和人VSMC增殖 抑制人股动脉VSMC增殖的他汀类药物浓度比较如下:西伐他汀洛伐他汀辛伐他汀阿托伐他汀氟伐他汀普伐他汀 流式细胞仪检测发现,10-4mol/L的氟伐他汀抑制人和猪VSMC G/S期转换,使其仅为对照组的50%。张敬贤等在临床对照研究中观察到脑心通可改善心绞痛临床症状,有调脂抗氧化的双重作用,；张加力观察到脑心通对患者血清C-反应蛋白(CRP)

3、有明显干预作用。刘思泰,李德才,云红梅等认为脑心通胶囊对缓解冠心病不稳定心绞痛有明显的疗效,其机理可能是通过改善血管内皮功能,降低ET水平和促进NO释放而发挥作用;也可能与其改善血管壁慢性炎症有关。张敬贤等.步长脑心通治疗冠心病合并血脂紊乱的疗效观察,中国中药杂志,2002,9,27,9:705706 杨君玲 步长脑心通治疗冠心病心绞痛60例报告,山东医药,2004,44,23:5152 张加力,杜立树等.脑心通胶囊对87例冠心病患者血清CPR的影响,JTCM.2006,Vol.47,No.6:472刘思泰,李德才,云红梅等.脑心通对不稳定型心绞痛患者血管内皮功能及超敏C反应蛋白的影响,中药药

4、理与临床,2007,23(3):7779 用阿托伐他汀做对照,观察在体外实验中脑心通是否对平滑肌细胞增殖有抑制作用,并探讨其可能机制 实验用SMCs，分为6组：1 空白对照组 2 ox-LDL组 3 ox-LDL+阿托伐他汀组(终浓度10-4mol/l)4 ox-LDL+脑心通组(终浓度1 g/L)5 ox-LDL+脑心通组(终浓度0.5g/L)6 ox-LDL+脑心通组(终浓度0.1g/L)培养48小时 终止培养 MTT比色法 比较各组OD值,间接反应活的平滑肌细胞数量 流式细胞仪测定DNA含量分析确定各组细胞中细胞周期G1期 S期 G2期所占百分数 观察加入不同药物对细胞在细胞周期运行过程

5、中的影响 流式细胞仪Annexin-v-FITC和PI双标记细胞观察药物对细胞凋亡的作用对照组对照组OxLDL组组阿托伐阿托伐他汀组他汀组脑心通组脑心通组脑心通组脑心通组脑心通组脑心通组MTT比色法比色法碘化丙啶染色流式细胞术（PI/FCM）细胞周期测定流式细胞术细胞流式细胞术细胞凋亡测定凋亡测定MDA 水平测定水平测定 1.MTT检测细胞生长抑制率 2.流式细胞仪测各细胞周期百分数 3.流式细胞仪测细胞凋亡百分数 噻唑兰（MTT）可透过细胞膜进入细胞内，活细胞线粒体中的琥珀脱氢酶能使外源性 MTT 还原为难溶于水的蓝紫色的针状结晶并沉积在细胞中，结晶物能被二甲基亚砜（DMSO）溶解，用酶联免

6、疫检测仪在 490nm 波长处测定其光吸收值，可间接反映活细胞数量。用阿托伐他汀和不同浓度脑心通作用24小时检测吸收值，并计算细胞生长抑制率。表1不同药物对VSMC增殖的影响（n=6,xs)sx）组别组别剂量剂量OD值值对照0.5090.036*Ox-LDL10mg/mL0.7330.033Ox-LDL+阿托伐他汀0.1mmol/L0.5190.057*Ox-LDL+脑心通 1 g/L 0.6720.035*Ox-LDL+脑心通0.5 g/L0.7020.058Ox-LDL+脑心通0.1 g/L0.7000.041与ox-LDL组相比*P0.01，*P0.05 与空白对照组相比,ox-LDL组

7、OD值明显增加,VSMC表现为增殖状态(P0.01)。阿托伐他汀和脑心通（1g/L）均可抑制ox-LDL诱导的VSMC增殖(P0.01;P0.01)。脑心通的作用呈现剂量依赖的趋势(见表1)。流式细胞仪检测显示ox-LDL有促VSMCs增殖的作用，表现为G0/G1期的细胞比例显著降低，S期的细胞比例显著增高(与对照组相比P0.01)，阿托伐他汀和大剂量的脑心通均可增加G0/G1期细胞比例，降低S期的细胞比例，与ox-LDL组相比，差异有显著性(P0.05或P0.01)表2不同药物对VSMC细胞周期运行的影响(n=3，xs)组别组别剂量剂量G0G1（%）G2+S+M（%）对照71.261.12*

8、28.410.59*Ox-LDL10mg/mL51.679.6448.339.64Ox-LDL+阿托伐他汀0.1mmol/L69.783.22*30.213.22*Ox-LDL+脑心通1 g/L64.705.54*35.305.54*Ox-LDL+脑心通0.5 g/L61.545.8238.465.82Ox-LDL+脑心通0.1 g/L59.606.1140.406.11与ox-LDL组相比*P0.01,*P0.05Channels(FL2-A)050100150200250ModFitLT V3.0(PMac)File analyzed:080104.001Date analyzed:4-J

9、an-2008Model:1DA0A_DSFAnalysis type:Manual analysisDiploid:100.00%Dip G1:72.20%at 52.94 Dip G2:0.18%at 93.88 Dip S:27.63%G2/G1:1.77%CV:11.88Total S-Phase:27.63%Total B.A.D.:0.85%Apoptosis:%Mean:Debris:1.47%Aggregates:5.96%Modeled events:5275All cycle events:4883Cycle events per channel:116RCS:1.587D

10、ebrisAggregatesDip G1Dip G2Dip SFL2-W0306090120R1Channels(FL2-A)050100150200250ModFitLT V3.0(PMac)File analyzed:080110.001Date analyzed:10-Jan-2008Model:1DA0A_DSFAnalysis type:Manual analysisDiploid:100.00%Dip G1:40.68%at 45.97 Dip G2:0.00%at 82.23 Dip S:59.32%G2/G1:1.79%CV:8.69Total S-Phase:59.32%T

11、otal B.A.D.:2.83%Apoptosis:1.92%Mean:13.96Debris:3.24%Aggregates:12.43%Modeled events:4186All cycle events:3453Cycle events per channel:93RCS:1.369DebrisAggregatesApoptosisDip G1Dip G2Dip SFL2-W0306090120R1Channels(FL2-A)050100150200250ModFitLT V3.0(PMac)File analyzed:080104.002Date analyzed:4-Jan-2

12、008Model:1DA0A_DSFAnalysis type:Manual analysisDiploid:100.00%Dip G1:72.95%at 47.48 Dip G2:0.00%at 65.09 Dip S:27.05%G2/G1:1.37%CV:10.30Total S-Phase:27.05%Total B.A.D.:0.32%Apoptosis:%Mean:Debris:0.69%Aggregates:8.99%Modeled events:12125All cycle events:10952Cycle events per channel:588RCS:2.465Deb

13、risAggregatesDip G1Dip G2Dip SFL2-W0306090120R1Channels(FL2-A)050100150200250ModFitLT V3.0(PMac)File analyzed:080104.005Date analyzed:4-Jan-2008Model:1DA0A_DSFAnalysis type:Manual analysisDiploid:100.00%Dip G1:71.02%at 49.47 Dip G2:0.00%at 89.90 Dip S:28.98%G2/G1:1.82%CV:11.83Total S-Phase:28.98%Tot

14、al B.A.D.:1.18%Apoptosis:%Mean:Debris:1.08%Aggregates:5.79%Modeled events:13818All cycle events:12869Cycle events per channel:311RCS:3.142DebrisAggregatesDip G1Dip G2Dip SFL2-W0306090120R 1Channels(FL2-A)050100150200250ModFitLT V3.0(PMac)File analyzed:080104.004Date analyzed:4-Jan-2008Model:1DA0A_DS

15、FAnalysis type:Manual analysisDiploid:100.00%Dip G1:68.08%at 51.00 Dip G2:0.00%at 97.23 Dip S:31.92%G2/G1:1.91%CV:13.54Total S-Phase:31.92%Total B.A.D.:3.39%Apoptosis:%Mean:Debris:2.10%Aggregates:6.94%Modeled events:11330All cycle events:10305Cycle events per channel:218RCS:2.665DebrisAggregatesDip

16、G1Dip G2Dip SFL2-W0306090120R 1Channels(FL2-A)050100150200250ModFitLT V3.0(PMac)File analyzed:080104.003Date analyzed:4-Jan-2008Model:1DA0A_DSFAnalysis type:Manual analysisDiploid:100.00%Dip G1:66.49%at 52.51 Dip G2:1.44%at 103.13 Dip S:32.07%G2/G1:1.96%CV:9.87Total S-Phase:32.07%Total B.A.D.:4.49%A

17、poptosis:%Mean:Debris:1.49%Aggregates:11.44%Modeled events:10967All cycle events:9548Cycle events per channel:185RCS:2.681DebrisAggregatesDip G1Dip G2Dip SFL2-W0306090120R1 在细胞凋亡早期，位于细胞膜内侧的磷脂酰丝氨酸（PS)迁移至细胞膜外测。磷脂结合蛋白V（AnnexinV）是一种钙依赖性的磷脂结合蛋白，它与PS具有高度的结合力。因此，AnnexinV可以作为探针检测暴露在细胞外测的磷脂酰丝氨酸。故利用对PS有高度亲和力的

18、Annexin V，将AnnexinV标记上荧光素（如异硫氰酸荧光素FITC），同时结合使用PI拒染法（因坏死细胞PS亦暴露于细胞膜外测，且对PI高染）进行凋亡细胞双染法后用流式细胞仪可检测凋亡细胞。凋亡细胞Annexin V高染、PI低染；坏死细胞Annexin V/PI均高染。组别组别剂量剂量AV+PI+空白对照0.3470.1521.6100.570Ox-LDL10 mg/L0.1080.0381.7931.22Ox-LDL+阿托伐他汀0.1mmol/L1.7870.361*2.7370.316Ox-LDL+脑心通1 g/L0.6330.0762.5600.497Ox-LDL+脑心通0.

19、5 g/L0.5230.0872.3970.602Ox-LDL+脑心通0.1 g/L0.5400.1152.7400.072与空白对照组相比*P001 流式细胞仪检测显示，ox LDL组与空白对照组差异无统计学意义（P=0.117），提示10mg/Lox LDL无明显促进细胞凋亡作用。阿托伐他汀与空白对照组比较凋亡率增加(P0.01)，而各组脑心通均无此现象(P=0.067,P=0.238,P=0.199)。各组细胞PI高染率之间无显著差异，提示各组药物对细胞无毒性作用。现代动物实验及临床研究均已证实，脑心通具有降脂、缓解心绞痛及改善脑梗死的作用 目前不能判定其中的有效成分或哪些成分起主导作用

20、。但是其中丹参、黄芪、川芎、水蛭等单方在研究中均有通过抑制VSMC通过细胞周期限制点，使细胞处于静止期来抑制细胞增殖的作用 在本实验中脑心通的作用虽然弱于阿托伐他汀，但中药复方的优势在于方中各药配伍后可起到协同或拮抗的作用从而对机体进行整体调节，其化学成分并不等同于单味药化学成分的简单相加 多靶点、多途径、整体调节的优势使脑心通在AS防治上具有广阔的应用前景，但其分子机制仍需进一步探讨 阿托伐他汀和脑心通均具有抑制ox-LDL刺激下体外培养的VSMcS增殖的作用。脑心通抑制ox-LDL诱导的VSMCS增殖的机制与其阻止细胞进入有丝分裂期有关。娄莉娄莉,王东琦王东琦,雷新军雷新军,等等.脑心通对血管平滑肌细胞增殖的影响及机制 内蒙古中医药内蒙古中医药,2008,4:36-37;脑心通对ox-LDL诱导血管平滑肌细胞增殖及调亡的影响2010年10期中华老年医学杂志发表;