血液分子生物学检验课件.ppt

1、第三临床医学院临床检验教研室程真珍2学时教学目的与要求教学目的教学目的 掌握主要分子生物学检验技术的原理及方法，以及流式细胞仪的工作原理及数据分析，明确其在血液病诊断、治疗中的应用。教学要求教学要求1、掌握掌握：核酸分子杂交技术、PCR技术及流式细胞仪的工作原理及方法。2、熟悉熟悉：基因芯片技术、GEP、SNP的工作原理及方法。3、了解：血液分子生物学检验及流式细胞仪在血液病的应用。血液分子生物学检验技术主要包括PCR技术、DNA测序技术、限制性片段长度多态性（RFLP）、转基因技术及基因芯片（DNA-chip）技术等。目前，这些技术在血液学检验领域已得到广泛应用，如应用于血液病基因分析、基因

2、诊断、白血病分型、指导治疗、判断预后和微小残留病检测等方面。随着分子生物学技术的进一步发展，血液病的基因表达和治疗、细胞之间和细胞内的信号传导、特异的血液病基因或融合基因的检测及应用将成为当代血液分子生物学检验的主要内容和方向。一、核酸一、核酸分子杂交分子杂交技术技术 具一定同源性的两条具一定同源性的两条(DNA或或RNA)单链单链在适宜的温度及离子强度等条件下在适宜的温度及离子强度等条件下,可按可按碱基互补配对原则碱基互补配对原则特异性地复性，特异性地复性，形成形成双链双链。探针探针(已知核酸片断，已知核酸片断，单链单链)待测核苷酸序列待测核苷酸序列(单链单链)DNADNA杂交分子杂交分子D

3、NARNA杂交分子杂交分子 DNA分子分子DNA分子分子SouthernSouthern印迹杂交印迹杂交使在电泳凝胶中分离的使在电泳凝胶中分离的DNA片段转移并结合在适片段转移并结合在适当的滤膜上，然后通过同标记的单链当的滤膜上，然后通过同标记的单链DNA或或 RNA探针的杂交作用检测这些被转移的探针的杂交作用检测这些被转移的DNA片段，这片段，这种实验方法叫做种实验方法叫做DNA印迹杂交印迹杂交技术。由于它是由技术。由于它是由英国人英国人Edwin Mellor Southern于于1975年首先设计年首先设计出来的，故又叫出来的，故又叫Southern blot。（a）（b）（c）（d）（

4、e）基因组基因组DNADNA限制片段限制片段硝酸纤维素滤膜硝酸纤维素滤膜同探针同源杂交的基因同探针同源杂交的基因DNA片段片段X光底片光底片*1979 1979年，年，J.C.J.C.AlwineAlwine等人发展而来，是将等人发展而来，是将RNARNA分子从电分子从电泳凝胶转移到硝酸纤维素滤膜或其他化学修饰的活性泳凝胶转移到硝酸纤维素滤膜或其他化学修饰的活性滤纸上，进行核酸杂交的一种实验方法。也称滤纸上，进行核酸杂交的一种实验方法。也称NorthernNorthern印迹（印迹（Northern BlotNorthern Blot），用以检测某一特），用以检测某一特定的定的RNARNA（通

5、常是（通常是mRNAmRNA）片段的存在及表达量。）片段的存在及表达量。因这种方法与因这种方法与Southern blotSouthern blot杂交技术十分类似，与杂交技术十分类似，与DNADNA的的杂交（杂交（Southern Southern 杂交）相对应，被趣称为杂交）相对应，被趣称为NorthernNorthern杂交。杂交。检测蛋白质，即将电泳分离的非标记蛋白质转移到固相载体上，用特异的抗血清对蛋白质进行鉴定及定量的方法靶蛋白的免疫学检测靶蛋白于第一抗体（一抗）反应与标记的第二抗体（酶标二抗）反应显色反应：酶促反应 印迹技术的类别及应用印迹技术的类别及应用（一）（一）DNA印迹技

6、术印迹技术(Southern blotting)用于基因组用于基因组DNADNA、重组质粒和噬菌体的、重组质粒和噬菌体的分析。分析。（二）（二）RNA印迹技术印迹技术(Northern blotting)用于用于RNARNA的定性定量分析的定性定量分析。（三）蛋白质的印迹分析（三）蛋白质的印迹分析(Western blotting)用于蛋白质定性定量及相互作用研究。用于蛋白质定性定量及相互作用研究。核酸原位杂交核酸原位杂交n将标记的核酸探针与固定在细胞或组织中的核酸进行杂交，将标记的核酸探针与固定在细胞或组织中的核酸进行杂交，称称原位杂交原位杂交。根据检测物分细胞内原位杂交和组织切片内。根据检

7、测物分细胞内原位杂交和组织切片内原位杂交；根据探针与待检核酸分：原位杂交；根据探针与待检核酸分：DNA/DNA、RNA/DNA、RNA/RNA 杂交。杂交。n特点特点能在成分复杂的组织中进行能在成分复杂的组织中进行单一细胞单一细胞的研究的研究不需从组织或细胞中提取核酸，对不需从组织或细胞中提取核酸，对含量极低的靶序列含量极低的靶序列灵敏度高灵敏度高能准确反映组织细胞的相互关系及功能状态能准确反映组织细胞的相互关系及功能状态。荧光原位杂交荧光原位杂交(Fluorescence(Fluorescence in situ in situ hybridization,hybridization,FIS

8、H)FISH)是一种在放射性原位杂交基础上发展起来的非放射是一种在放射性原位杂交基础上发展起来的非放射性原位杂交技术，是把性原位杂交技术，是把生物素生物素或或地高辛地高辛(DIG)(DIG)等标记等标记物质标记的物质标记的DNADNA片段作为片段作为探针探针（probeprobe），与染色体），与染色体DNADNA进行进行分子杂交分子杂交，利用，利用荧光色素荧光色素为检测信号，在为检测信号，在荧荧光显微镜光显微镜下直接检测探针互补的下直接检测探针互补的DNADNA片段的存在部位。片段的存在部位。探针探针DNA染色体标本染色体标本切口平移法切口平移法前处理前处理探针探针DNA变性变性染色体染色体

9、DNADNA变性变性单链单链DNA单链单链DNADNA用用PI、DAPI对染色体染色对染色体染色荧光原位杂交（荧光原位杂交（FISHFISH）示意图）示意图 探针探针DNA与染色体与染色体DNA分子杂交分子杂交用抗生物素蛋白用抗生物素蛋白荧光素处理荧光素处理找出杂交信号找出杂交信号 用荧光显微镜观察用荧光显微镜观察生物素（地高辛）标记生物素（地高辛）标记二、聚合酶链反应技术聚合酶链反应技术聚合酶链反应（聚合酶链反应（polymerase chain reaction，PCR）技术是生物技术领域中最重要的四项生物技术是生物技术领域中最重要的四项生物技术（即技术（即细胞融合技术、分子克隆术、蛋白工

10、程细胞融合技术、分子克隆术、蛋白工程技术和基因扩增技术技术和基因扩增技术）之一。由于通过体外（试）之一。由于通过体外（试管内）扩增，可以将目的基因（或靶基因）片段管内）扩增，可以将目的基因（或靶基因）片段百万倍的放大，从而达到极大地提高核酸分子检百万倍的放大，从而达到极大地提高核酸分子检测的灵敏度，理论上其检测的灵敏度可以达到一测的灵敏度，理论上其检测的灵敏度可以达到一个细胞、甚至一个分子的水平。个细胞、甚至一个分子的水平。1.1.聚合酶链反应技术的原理聚合酶链反应技术的原理PCR技术实际上是在模板技术实际上是在模板DNA、引物和四种、引物和四种dNTP存存在的条件下，依赖于在的条件下，依赖于

11、DNA聚合酶的酶促反应。聚合酶的酶促反应。PCR由变性退火延伸三个基本反应步骤构成。由变性退火延伸三个基本反应步骤构成。模板DNA94变性55退火72引物延伸第二次循环模板变性退火延伸经25-30次循环，目的DNA增加106-7图6-1 PCR原理示意图以上为一个循环。在下一轮循环中，以上为一个循环。在下一轮循环中，DNADNA双链再经变性、双链再经变性、退火、延伸三步退火、延伸三步,模板模板DNADNA数量翻一倍数量翻一倍(假设扩增效率为假设扩增效率为100%)100%)。如此反复循环，便可使。如此反复循环，便可使DNADNA以指数形式进行扩增。以指数形式进行扩增。每完成一个循环需每完成一个

12、循环需24min24min，23h23h就能将待扩目的基因就能将待扩目的基因扩增放大几百万倍。到达平台期（扩增放大几百万倍。到达平台期（plateauplateau）所需循环）所需循环次数取决于样品中模板的拷贝数。次数取决于样品中模板的拷贝数。2.PCR2.PCR产物分析产物分析(一一)电泳方法电泳方法1琼脂糖凝胶电泳法（琼脂糖凝胶电泳法（经典经典）琼脂糖凝胶电泳法的操作方法简单，能对琼脂糖凝胶电泳法的操作方法简单，能对PCR产物产物的长度进行粗略的鉴定，是应用最广泛的检测的长度进行粗略的鉴定，是应用最广泛的检测PCR产物的方法。不同浓度的凝胶分辨产物的方法。不同浓度的凝胶分辨DNA的有效范围

13、的有效范围不同，如表不同，如表4.1所示：所示：2聚丙烯酰胺凝胶电泳法（聚丙烯酰胺凝胶电泳法（高效分离高效分离）表表4.2 丙烯酰胺浓度与分离丙烯酰胺浓度与分离DNA分子的有效范围分子的有效范围表4.1 琼脂糖浓度与分离线状DNA的有效范围琼脂糖含量琼脂糖含量(%)分离线状分离线状DNA的有效范围的有效范围(kb)0.51-30 0.70.8-12 1.00.5-10 1.20.4-7 1.50.2-3 2.00.1-2表6.2 丙烯酰胺浓度与分离DNA分子的有效范围丙烯酰胺丙烯酰胺(%)有效分离范围有效分离范围(bp)溴酚蓝位置溴酚蓝位置(bp)二甲苯蓝位置二甲苯蓝位置(bp)3.51000

14、-2000 1004605.080-500 652608.060-400 4510012.040-200 207015.025-150 156020.05-100 1245PCRPCR产物分析产物分析（二）（二）Southern印迹杂交印迹杂交可提高检测可提高检测PCR产物的灵敏度产物的灵敏度（三）斑点杂交法（三）斑点杂交法 固相杂交技术，可用于判断产物序列的突变类型和产固相杂交技术，可用于判断产物序列的突变类型和产物的特异性鉴定，有助于血液系统遗传病的基因诊断，物的特异性鉴定，有助于血液系统遗传病的基因诊断，基因的多态性分析基因的多态性分析PCRPCR产物分析产物分析(四四)PCR-ELIS

15、A引物采用双标记，通过修饰其中一个引物的引物采用双标记，通过修饰其中一个引物的55端使其携端使其携带便于带便于PCRPCR产物固定的功能基团产物固定的功能基团 (如生物素如生物素)，而通过另一，而通过另一引物的引物的55端的修饰使产物便于检测，（如地高辛、荧光端的修饰使产物便于检测，（如地高辛、荧光素等）。本法避免了电泳和杂交的步骤，适用于常规素等）。本法避免了电泳和杂交的步骤，适用于常规ELISAELISA记数仪检测。极大地提高了灵敏度。记数仪检测。极大地提高了灵敏度。PCRPCR产物分析产物分析（五）原位杂交法五）原位杂交法原位杂交（细胞定位）原位杂交（细胞定位）+PCR+PCR（高度特异

16、敏感高度特异敏感）特点：定性、定量、定位分析特点：定性、定量、定位分析（六）实时定量（六）实时定量PCR（real-time PCR,RT-PCR）定性定性 定量定量特点：灵敏度高、特异性强、线性关系好、自动化程度特点：灵敏度高、特异性强、线性关系好、自动化程度高、操作简单高、操作简单三、基因芯片技术三、基因芯片技术也也叫叫DNADNA芯片芯片（DNA chipDNA chip）是指在固相载体（玻璃、硅等）上有序地、高密是指在固相载体（玻璃、硅等）上有序地、高密度地（点间距度地（点间距500500 m m）排列固定了大量的靶基因）排列固定了大量的靶基因或寡核苷酸（也叫探针）。这些被固定的分子探

17、或寡核苷酸（也叫探针）。这些被固定的分子探针在基质上形成高密度的针在基质上形成高密度的DNADNA微阵列，因此，微阵列，因此，DNADNA芯片又叫芯片又叫DNADNA微矩阵（微矩阵（DNA MicroarrayDNA Microarray）。第一块基因芯片第一块基因芯片19921992年诞生在美国。年诞生在美国。基因芯片扫描结果图基因芯片扫描结果图基因芯片技术基因芯片技术是建立在是建立在Southern blotSouthern blot基础之上的，基础之上的，可以说它是可以说它是Southern blotSouthern blot的改进和发展，它的原的改进和发展，它的原理是：变性理是：变性D

18、NA DNA 加入探针后在一定温度下退火，加入探针后在一定温度下退火，同源片段之间通过碱基互补形成双链杂交分子。同源片段之间通过碱基互补形成双链杂交分子。与与Southern blotSouthern blot相比较，基因芯片具有相比较，基因芯片具有高密度高密度、高通量高通量、并行性并行性、微量化微量化、自动化自动化的特点。的特点。用于基因功能的研究。用于基因功能的研究。原理原理：用不同的荧光染料通过：用不同的荧光染料通过RT-PCRRT-PCR标记不同来源的细胞标记不同来源的细胞mRNAmRNA制备成探针，将探针制备成探针，将探针混合后与芯片上的基因杂交、洗涤、扫描，得到这些混合后与芯片上的

19、基因杂交、洗涤、扫描，得到这些基因在不同组织或个体中的表达谱，再通过计算机分基因在不同组织或个体中的表达谱，再通过计算机分析这些基因在不同组织或个体中的表达差异，得出这析这些基因在不同组织或个体中的表达差异，得出这些基因表达的重要信息。即：些基因表达的重要信息。即：（1 1）高表达）高表达 （2 2）低表达或不表达）低表达或不表达1.1.表达谱基因芯片表达谱基因芯片HBVHBV、HCVHCV、结核杆菌等病原体检测，商检等、结核杆菌等病原体检测，商检等。2.2.诊断芯片诊断芯片在在DNA DNA 和和/或或RNARNA水平上用于疾病诊断，水平上用于疾病诊断，如肝癌、糖尿病等。如肝癌、糖尿病等。3

20、.3.检测芯片检测芯片 单核苷酸多态性（单核苷酸多态性（single nucleotide polymorphism,SNP)是指基因组是指基因组DNADNA序列中由于单个核苷酸的突变序列中由于单个核苷酸的突变而引起的多态性。而引起的多态性。同一物种不同个体间染色体上遗传密码同一物种不同个体间染色体上遗传密码单个碱基的变化，主要表现为基因组核苷酸水平单个碱基的变化，主要表现为基因组核苷酸水平上的变异引起的上的变异引起的DNADNA序列多态性序列多态性 。SNP的特征 SNPSNP是人类可遗传的变异中最常出现的一种，是人类可遗传的变异中最常出现的一种，占所有已知多态性的占所有已知多态性的90%9

21、0%以上，在人类基因组中广以上，在人类基因组中广泛存在，人类泛存在，人类DNADNA中每中每300-1000bp300-1000bp就有一个就有一个SNP.SNP.因此，一个人类个体大约携带因此，一个人类个体大约携带300300万万-1000-1000万个万个SNPsSNPs。SNPSNP的检测方法的检测方法1.1.传统经典法传统经典法l基于凝胶电泳为基础基于凝胶电泳为基础l检测速度慢、灵敏度低、效率低检测速度慢、灵敏度低、效率低2.2.高通量检测法高通量检测法l主要有主要有DNADNA芯片技术、变性高效液相色谱、芯片技术、变性高效液相色谱、DNADNA测序技测序技术、飞行质谱仪检测术、飞行质

22、谱仪检测l快速、高效、高通量、微型化、自动化快速、高效、高通量、微型化、自动化七、应用评价七、应用评价1.恶性血液病基因分型及预后判断恶性血液病基因分型及预后判断bcrbcr/ablabl融合基因：融合基因：CMLCMLPML-PML-RARaRARa融合基因：融合基因：APLAPLAML1/ETOAML1/ETO融合基因：融合基因：AML-M2AML-M2应用评价应用评价2.2.免疫球蛋白重链（免疫球蛋白重链（IgHIgH）基因和）基因和T T细胞受体细胞受体(TCR)(TCR)基因基因重排的检测重排的检测3.3.遗传性血液病的诊断遗传性血液病的诊断4.HLA4.HLA基因多态性检测基因多态

23、性检测5.5.肿瘤细胞多药耐药基因的检测肿瘤细胞多药耐药基因的检测6.6.基因治疗基因治疗第七节第七节 流式细胞分析流式细胞分析流式细胞仪的特点流式细胞仪的特点=单个细胞或微粒分析单个细胞或微粒分析=同时多参数分析同时多参数分析=速度快：速度快：1000010000个细胞个细胞(微粒微粒)/)/秒秒=统计学意义：提供细胞群体的均值和统计学意义：提供细胞群体的均值和分布情况分布情况=分选感兴趣的细胞或微粒分选感兴趣的细胞或微粒l流路流路 (液流系统）液流系统）p流动室流动室 p鞘液鞘液SHEATH SHEATH p样本流样本流SAMPLE SAMPLE 单细胞悬液单细胞悬液5 5*10105 5

24、11*10106 6个个/ml/mll光路（光学系统）光路（光学系统）p光源光源p滤片滤片l电路（检测系统）电路（检测系统）p光电倍增管光电倍增管PMTPMTp放大电路放大电路HVHV及及GAIN GAIN 增益增益pA/DA/D转换转换l统计统计 （分析系统）（分析系统）p计算机计算机流动室流动室Injector TipFluorescencesignalsFocused laserbeamSheath fluid液流系统常用荧光染料介绍常用荧光染料介绍 FITC：绿色 525nm PE：橙黄色 575nm ECD：橙红色 610nm PECY5：深红色 675nm PerCP：深红色 67

25、5nm PECY7：深红色 755nm 7AAD：深红色 675nm PI(碘化丙啶）：橙红色 620nm 488nm波长的氩离子激光激发信信 号号 散射光信号 FS 细胞大小 SS 细胞颗粒性 荧光信号 FL1 FITCFL1 FITC FL2 PEFL2 PE FL3 ECDFL3 ECD FL4 PC5FL4 PC5光学系统散射光信号 细胞大小及颗粒性FSSS光学系统光学系统1.单参数一维直方图 纵坐标表示细胞数，横坐标表示相对荧光信号或散色光信号值，单位是道数。2.双参数二维点图显示来自同一细胞的两个参数与细胞数量间的关系。横、纵坐标分别表示两个参数的相对含量。通过分别计算两坐标所表示

26、参数的阳性率来得到实验结果。3.等高线图 4.密度图三维图三维图FCMFCM的临床应用的临床应用=HIV免疫分型，免疫分型，CD4绝对计数绝对计数=白血病和淋巴瘤的免疫分型白血病和淋巴瘤的免疫分型=肿瘤的细胞周期和倍体分析肿瘤的细胞周期和倍体分析=网织红细胞计数网织红细胞计数=细胞移植的交叉配型和免疫状态监测细胞移植的交叉配型和免疫状态监测=干细胞计数干细胞计数=残量白血病细胞检查残量白血病细胞检查=HLA-B27检查检查=血小板功能及相关疾病血小板功能及相关疾病FCMFCM的应用的应用血液病学血液病学白血病和淋巴瘤免疫分型白血病和淋巴瘤免疫分型残留白血病残留白血病造血干细胞计数造血干细胞计数

27、PNHPNH诊断诊断网织红细胞分析网织红细胞分析血小板分析血小板分析血小板膜糖蛋白分子的表达血小板膜糖蛋白分子的表达血小板活化血小板活化网织血小板分析网织血小板分析FCM的科研应用=树突细胞研究树突细胞研究=干细胞研究干细胞研究=癌症病人的多药耐药性癌症病人的多药耐药性=细胞动力学功能研究细胞动力学功能研究=环境微生物分析环境微生物分析=流式细胞术与分子生物学研究流式细胞术与分子生物学研究小小 结结血液分子生物学常用的方法有核酸分子杂交技术、血液分子生物学常用的方法有核酸分子杂交技术、PCRPCR技术及基因芯片技术，这些技术在白血病的分子技术及基因芯片技术，这些技术在白血病的分子诊断中起决定性作用。流式细胞技术现在也已经成为诊断中起决定性作用。流式细胞技术现在也已经成为白血病免疫分型的常用方法白血病免疫分型的常用方法。谢 谢