第6章微生物遗传与变异课件.ppt

1、第六章第六章 微生物的遗传和变异微生物的遗传和变异主要内容主要内容一一微生物的遗传微生物的遗传二二微生物的变异微生物的变异三三基因重组基因重组四四突变体的检测与筛选突变体的检测与筛选五五分子遗传学技术在环境工程和环境保护分子遗传学技术在环境工程和环境保护中的应用中的应用l 基本组成元素：基本组成元素：C、H、O、N、P l 基本单位基本单位：脱氧核苷酸脱氧核苷酸 l DNA的分子组成的分子组成:F基因按功能可分为三种基因按功能可分为三种大肠杆菌乳糖操纵子的结构及调节大肠杆菌乳糖操纵子的结构及调节RPO结构基因3个Z、Y、A：结构基因：结构基因P：启动子：启动子O：操纵基因：操纵基因R：调节基因

2、：调节基因 Z Y A-半乳糖苷酶半乳糖苷酶-半乳糖苷酶半乳糖苷酶透过酶透过酶-半乳糖苷酶半乳糖苷酶乙酰氨基转移酶乙酰氨基转移酶 RPOZ Y A阻遏蛋白阻抑蛋白封闭操纵区，结构基因不表达阻抑蛋白封闭操纵区，结构基因不表达RPOZ Y A阻遏蛋白诱导物与阻抑蛋白结合，阻抑蛋白不能诱导物与阻抑蛋白结合，阻抑蛋白不能封闭操纵区，结构基因得以表达封闭操纵区，结构基因得以表达诱导物F 概念概念（G+C）%=（Tm-69.3）2.44F概念概念F复性的复性的DNADNA是随机结合的，只能部分是随机结合的，只能部分保持原有性状。保持原有性状。调节调节DNA复制、转录和翻译复制、转录和翻译核心酶核心酶全酶全

3、酶 转录起始转录起始转录延长阶段转录延长阶段亚基脱落亚基脱落：RNA聚合酶与聚合酶与DNA模板的启动子模板的启动子(promoter)结合结合-35-10Pribnow box(普里布诺盒普里布诺盒)在在RNA聚合酶催化下，以模板链为模板按聚合酶催化下，以模板链为模板按5 3方向方向合成互补的合成互补的RNA链。链。553353RNA聚合酶聚合酶DNARNARNA聚合酶到达转录终止区，则停止转录。聚合酶到达转录终止区，则停止转录。l终止子终止子能够使能够使RNA转录停止的转录停止的DNA序列序列。l终止的方式：终止的方式：（1）依赖于依赖于（Rho）因子因子的终止的终止（2）不依赖于不依赖于

4、（Rho）因子因子的终止的终止（1）依赖于依赖于 因子因子的终止的终止RNARNA聚合酶（2）不依赖于不依赖于 因子因子的终止的终止GACCGCUGGCCCGGGCCCGUU C C A C AA U U U U U U OH茎环茎环/发夹发夹结构结构细菌细菌mRNA多数不用加工，转录与翻译是偶联的。多数不用加工，转录与翻译是偶联的。少数多顺反子信使少数多顺反子信使RNA（一种能作为两种或多种多肽链翻译模板的一种能作为两种或多种多肽链翻译模板的信使信使RNA）必须由内切酶切成较小的单位，然后翻译。）必须由内切酶切成较小的单位，然后翻译。如核糖体大亚基蛋白与如核糖体大亚基蛋白与RNA聚合酶的聚合

5、酶的亚基基因组成亚基基因组成混合操纵子，转录后需经混合操纵子，转录后需经RNA酶酶III切开，各自翻译。切开，各自翻译。因为因为RNA聚合酶的合成水平低得多，切开有利于各自聚合酶的合成水平低得多，切开有利于各自的翻译调控。的翻译调控。酶酶位置位置产物产物相对活性相对活性RNA聚合酶聚合酶核仁核仁rRNA(5.8S、18S、28S)50%70%RNA聚合酶聚合酶核质核质mRNA20%40%RNA聚合酶聚合酶核质核质tRNA,5SrRNA10%RNA聚合酶聚合酶接合在起接合在起始位点附近，由转录因始位点附近，由转录因子（子（TF）协助识别启）协助识别启动子。动子。目前已知目前已知RNA聚合酶聚合酶

6、至少有六种不同的蛋白至少有六种不同的蛋白因子参与转录复合体的因子参与转录复合体的形成。这些蛋白因子被形成。这些蛋白因子被称为转录因子（称为转录因子（trans-criptional factor,TF)。包括包括 TFA，TFB，TFD，TFE，TFF，TF-I。真核生物转录终止的机制，目前了解尚不真核生物转录终止的机制，目前了解尚不多，而且多，而且3种种RNA聚合酶的转录终止不完全相聚合酶的转录终止不完全相同。同。RNA聚合酶聚合酶催化的转录有催化的转录有18 bp的终止子序列，可被辅助因的终止子序列，可被辅助因子识别。子识别。RNA聚合酶聚合酶II和和III催化转录的终止子，可能有与原核生

7、物不催化转录的终止子，可能有与原核生物不依赖依赖因子的终止子相似的结构和终止机制，即有富含因子的终止子相似的结构和终止机制，即有富含GC的茎的茎-环结构环结构(stem-loop structure)和连续的和连续的U。由于成熟的由于成熟的mRNA 3端已被切除了一段并加入了端已被切除了一段并加入了poly A尾，尾，具体的转录终止点目前尚未认识。具体的转录终止点目前尚未认识。a.加帽加帽：转录合成转录合成前体前体RNA（hn RNA）在磷酸酶的作用下，在磷酸酶的作用下，将将5-端的磷酸基水端的磷酸基水解，然后再加上鸟解，然后再加上鸟苷三磷酸，形成苷三磷酸，形成GpppN的结构，再的结构，再对

8、对G进行甲基化进行甲基化;b.加尾加尾：这一过程也是细胞核内完成，首：这一过程也是细胞核内完成，首先由核酸外切酶切去先由核酸外切酶切去3-端一些过剩的核端一些过剩的核苷酸，然后再加入苷酸，然后再加入polyA。c.剪接剪接：核内小核内小RNA（snRNA）与蛋白质结合形）与蛋白质结合形成小核核糖核蛋白颗粒（成小核核糖核蛋白颗粒（snRNP），可识别内含），可识别内含子和外显子的交接位点，从而将内含子切割下来，子和外显子的交接位点，从而将内含子切割下来，并准确地将各外显子拼接好，成为完好的具有功并准确地将各外显子拼接好，成为完好的具有功能的能的mRNA。外显子外显子 真核微生物真核微生物RNAR

9、NA的转录是在细胞核内进行的转录是在细胞核内进行的，而蛋白质的合成则是在细胞质内进行的，而蛋白质的合成则是在细胞质内进行的。所以，的。所以，RNARNA转录后首先必须从核内运转录后首先必须从核内运输到细胞质内，才能指导蛋白质的合成。输到细胞质内，才能指导蛋白质的合成。真核微生物一个真核微生物一个mRNAmRNA分子一般只含有一分子一般只含有一个基因，编码一条多肽链；个基因，编码一条多肽链；原核微生物原核微生物的一个的一个mRNAmRNA分子通常含有多个基因。分子通常含有多个基因。在原核微生物中只有一种在原核微生物中只有一种RNARNA聚合酶，催聚合酶，催化所有化所有RNARNA的合成；而在真核

10、微生物中则的合成；而在真核微生物中则有有RNARNA聚合酶聚合酶、RNARNA聚合酶聚合酶和和RNARNA聚聚合酶合酶三种不同酶，分别催化不同种类型三种不同酶，分别催化不同种类型RNARNA的合成。的合成。原核生物中原核生物中RNARNA聚合酶可以直接起始转录聚合酶可以直接起始转录合成合成RNA RNA，真核生物则不能独立转录，真核生物则不能独立转录RNA RNA。在真核生物中，三种在真核生物中，三种RNARNA聚合酶聚合酶都必须在蛋白质转录因子的协助下才能进都必须在蛋白质转录因子的协助下才能进行行RNARNA的转录。另外，的转录。另外，RNARNA聚合酶对转录聚合酶对转录启动子的识别，也比原

11、核生物更加复杂。启动子的识别，也比原核生物更加复杂。DNA复制复制蛋白质合成蛋白质合成核物质核物质蛋白质蛋白质均匀分配均匀分配形成形成 横隔膜横隔膜子细胞子细胞子细胞子细胞第二节第二节 微生物的变异微生物的变异一、变异的实质一、变异的实质 生物生物DNADNA碱基系列的任何改变，包括一碱基系列的任何改变，包括一对或少数几对碱基的缺失、插入或置换，而对或少数几对碱基的缺失、插入或置换，而导致的遗传变化称为导致的遗传变化称为二、基因突变的类型二、基因突变的类型（一）（一）自发突变自发突变：指某种生物在自然条件下，没有人工指某种生物在自然条件下，没有人工参与而发生的基因突变。参与而发生的基因突变。（

12、二）（二）诱发突变诱发突变：是指利用物理或化学因素处理生物群是指利用物理或化学因素处理生物群体，促使少数个体细胞的体，促使少数个体细胞的DNADNA分子结构发生突变，分子结构发生突变，在基因内部碱基配对发生差别，引起生物的遗传性在基因内部碱基配对发生差别，引起生物的遗传性状发生突变。状发生突变。1.物理诱变物理诱变2.化学诱变化学诱变3.复合处理及协同效应复合处理及协同效应4.定向培育和驯化定向培育和驯化l定向培育（驯化）定向培育（驯化）人为用某一种特定环境长期处理某一微人为用某一种特定环境长期处理某一微生物群体，同时不断将它们进行移种传代，生物群体，同时不断将它们进行移种传代，以达到累积和选

13、择合适的自发突变体。以达到累积和选择合适的自发突变体。环境工程中常用这种方法培育新菌种。环境工程中常用这种方法培育新菌种。第三节第三节 基因重组基因重组 基因重组基因重组：两个不同性状的个体细胞的两个不同性状的个体细胞的DNA融合，使基因重新组合，从而发生遗传变异，产融合，使基因重新组合，从而发生遗传变异，产生新品种的过程。生新品种的过程。基因重组包括基因重组包括杂交杂交、转化转化和和转导转导等方法。等方法。一、杂交一、杂交（hybridization）通过双亲细胞的融合，使整套染色体的基因重组，或是通通过双亲细胞的融合，使整套染色体的基因重组，或是通过双亲细胞的部分沟通，使部分染色体基因重组

14、的现象。过双亲细胞的部分沟通，使部分染色体基因重组的现象。二、转化二、转化（Transformation）受体细胞直接吸收供体细胞的受体细胞直接吸收供体细胞的DNA片段，并把它整合到自片段，并把它整合到自己的基因组里，从而获得供体细胞部分遗传性状的现象。己的基因组里，从而获得供体细胞部分遗传性状的现象。通过温和噬菌体的媒介作用，把供体细胞内特定的基因通过温和噬菌体的媒介作用，把供体细胞内特定的基因（DNA片段）携带至受体细胞中，使后者获得前者部分片段）携带至受体细胞中，使后者获得前者部分遗传性状的现象。遗传性状的现象。三、转导三、转导（Transduction）转导是转导是1952年年ND津德

15、和津德和J莱德伯格在研究莱德伯格在研究鼠沙门氏伤鼠沙门氏伤寒杆菌寒杆菌重组时发现的。重组时发现的。LA-2A-B+LA-22A+B-LA-2是是能能合合成色氨酸成色氨酸（B+）但）但 不不能能合成组氨合成组氨酸酸（A-）的）的沙门氏伤寒沙门氏伤寒杆菌杆菌 指导色氨指导色氨酸合成的基酸合成的基因因超微烧结玻璃板细菌不能通过，细菌不能通过，噬菌体可以通过LA-22 是是 合成合成色氨酸色氨酸（B-）但）但 能能合成组氨酸合成组氨酸（A+）的的沙门氏伤寒杆菌沙门氏伤寒杆菌一些细胞中含有繁一些细胞中含有繁殖速度较慢的殖速度较慢的 温和温和噬菌体噬菌体 P-22 不能不能第四节第四节 突变体的检测与筛选

16、突变体的检测与筛选一、突变体的检测一、突变体的检测 1、直接检测表现型、直接检测表现型2、间接检测法、间接检测法通过控制培养条件获得突通过控制培养条件获得突变体（如变体（如Ames实验）。实验）。二、突变体的筛选二、突变体的筛选 筛选方法：筛选方法：创造一种只允许突变体生长，创造一种只允许突变体生长，抑制原养型菌生长的培养基或生长环境条抑制原养型菌生长的培养基或生长环境条件。件。第五节第五节 分子遗传学技术在环境工程和分子遗传学技术在环境工程和环境保护中的应用环境保护中的应用一、遗传工程在环境一、遗传工程在环境保护中的应用保护中的应用 遗传工程是遗传工程是70年代初发展起来的生物技术。年代初发

17、展起来的生物技术。定义：定义：对遗传物质进行改造（人工干预下的杂对遗传物质进行改造（人工干预下的杂交、转化、接合、转导）的技术。交、转化、接合、转导）的技术。特点特点：类似工程设计那样有很高的：类似工程设计那样有很高的预见性、精预见性、精确性与严密性确性与严密性。应用：应用：质粒育种质粒育种（一）质粒育种简介（一）质粒育种简介1、质粒：、质粒：原核微生物中，游离于核基因组外，原核微生物中，游离于核基因组外，具有独立复制能力的小型共价闭合环状具有独立复制能力的小型共价闭合环状DNA分子。分子。2、质粒的类型、质粒的类型接合性质粒接合性质粒抗药性质粒抗药性质粒产细菌素和抗生素质粒产细菌素和抗生素质

18、粒具生理功能的质粒（如降解质粒）具生理功能的质粒（如降解质粒）产毒质粒产毒质粒3、质粒育种、质粒育种 将两种或多种微生物通过细胞结合或融将两种或多种微生物通过细胞结合或融合技术，使供体菌的质粒转移到受体菌内，合技术，使供体菌的质粒转移到受体菌内，使受体菌保留自身功能质粒，同时获得供体使受体菌保留自身功能质粒，同时获得供体菌的功能质粒，即培育具有两种或多种功能菌的功能质粒，即培育具有两种或多种功能质料的新品种的过程。质料的新品种的过程。（二）质粒育种技术在环境保护中的应用（二）质粒育种技术在环境保护中的应用（1）多功能超级细菌的构建多功能超级细菌的构建F降解芳烃、萜烃、多环芳烃和脂烃降解芳烃、萜

19、烃、多环芳烃和脂烃（2）解烷抗汞质粒菌的构建解烷抗汞质粒菌的构建F降解辛烷、乙烷、癸烷和耐高浓度汞降解辛烷、乙烷、癸烷和耐高浓度汞（3）脱色工程菌的构建脱色工程菌的构建F分解两种偶氮染料分解两种偶氮染料（4）Q5T工程菌的构建工程菌的构建F在低温下降解甲苯和二甲苯在低温下降解甲苯和二甲苯二、基因工程技术二、基因工程技术1、基因工程（、基因工程（gene engineering）的概念）的概念 是根据人们的科研或生产需要，在分子水平上，是根据人们的科研或生产需要，在分子水平上，用人工方法提取或合成不同生物的遗传物质（用人工方法提取或合成不同生物的遗传物质（DNA片段），在体外切割，拼接形成重组片

20、段），在体外切割，拼接形成重组DNA，然后将，然后将重组重组DNA与载体的遗传物质重新组合，再将其引入与载体的遗传物质重新组合，再将其引入到没有该到没有该DNA的受体细胞中，进行复制和表达，生的受体细胞中，进行复制和表达，生产出符合人类需要的产品或创造出生物的新性状，产出符合人类需要的产品或创造出生物的新性状，并使之稳定地遗传给下一代。并使之稳定地遗传给下一代。从供体细胞选择获取含目的基因的从供体细胞选择获取含目的基因的DNA片段片段 将目的将目的DNA片段和质粒在体外重组片段和质粒在体外重组 将重组体转入受体细胞将重组体转入受体细胞 重组体克隆的筛选与鉴定重组体克隆的筛选与鉴定 外源基因表达

21、产物的分离与提纯外源基因表达产物的分离与提纯2、基因工程的操作步骤、基因工程的操作步骤3、基因工程在环境保护中的应用、基因工程在环境保护中的应用F超级细菌的构建超级细菌的构建F在原核微生物与动物之间、动物与在原核微生物与动物之间、动物与植物之间的转基因工程，有利于环境植物之间的转基因工程，有利于环境保护。保护。1、PCR技术简介技术简介l PCRDNA多聚酶链式反应技术。多聚酶链式反应技术。l PCR的原理的原理：利用适宜的引物、利用适宜的引物、DNA聚合聚合酶、酶、4种脱氧核苷酸（种脱氧核苷酸（dNTP）以及合适的反）以及合适的反应条件使靶应条件使靶DNA的拷贝数在短时间内（几小的拷贝数在短

22、时间内（几小时）在体外增加百万倍以上，从而容易对靶时）在体外增加百万倍以上，从而容易对靶DNA序列进行分析。序列进行分析。三、三、PCR技术技术 加热变性加热变性将双链将双链DNADNA加热（加热（94949595）变性为两条单链变性为两条单链DNADNA，作为扩增模板；，作为扩增模板；退火退火单链单链DNADNA溶液温度下降至溶液温度下降至5555，引，引物物DNADNA碱基与单链模板碱基与单链模板DNADNA碱基互补配对；碱基互补配对；延伸延伸72 72 温度下，由合成酶（温度下，由合成酶（DNA DNA 高高温多聚酶）催化，从引物开始合成目的基因；温多聚酶）催化，从引物开始合成目的基因；

23、电泳电泳将扩增产物进行琼脂糖凝胶电泳观将扩增产物进行琼脂糖凝胶电泳观察察 2、PCR的操作步骤的操作步骤P C R操作流程95 0 0 C55 0 0 C72 0 0 CDNA互补双链复制起点DNA合成研究特定环境中微生物区系的组成、研究特定环境中微生物区系的组成、结构，分析种群动态；结构，分析种群动态；环境中特定微生物的监测（分类、环境中特定微生物的监测（分类、鉴定）。鉴定）。3、PCR技术在环境保护中的应用技术在环境保护中的应用四四.分子遗传学综合技术分子遗传学综合技术在环境微生物中的应用在环境微生物中的应用 16SRNA序列分析技术：序列分析技术：从微生物样品中提取16SRNA的基因片段，通过克隆、测序或酶切、探针杂交，获得16SRNA序列信息，再与16SRNA数据库中的序列数据或其它数据进行对照比较，确定其在进化树中的位置，从而鉴定样品中可能存在的微生物种类。