多聚酶链式反应扩增DNA片段课件.ppt

1、多聚酶链式反应多聚酶链式反应(polymerase chain reaction,PCR技术技术)，是一种在体外，是一种在体外快速扩增特定基因或快速扩增特定基因或DNA序列的方序列的方法，故又称为法，故又称为DNA体外扩增技术体外扩增技术。脱氧脱氧核糖核糖含氮碱基含氮碱基磷酸磷酸A G C T1 1、DNADNA的基本单位的基本单位分子的结构分子的结构12345O鸟嘌呤脱氧核苷酸鸟嘌呤脱氧核苷酸胞嘧啶脱氧核苷酸胞嘧啶脱氧核苷酸 胸腺嘧啶脱氧核苷酸胸腺嘧啶脱氧核苷酸A腺嘌呤脱氧核苷酸腺嘌呤脱氧核苷酸GCTATGCAGCT5端端3端端5端端3端端4、DNA的立体结构的立体结构 双螺旋结构双螺旋结构

2、2 2、时间：、时间：细胞分裂细胞分裂间期间期（有丝（有丝分裂间期分裂间期，减数第一次分裂的间期）减数第一次分裂的间期）1 1、概念：、概念：以亲代以亲代DNA为模板，根据碱基为模板，根据碱基互补配对合成子代在互补配对合成子代在DNA的过程。的过程。3 3、场所：、场所：主要是细胞核主要是细胞核 （其次是线粒体、叶绿体）（其次是线粒体、叶绿体）二细胞内二细胞内DNADNA复制的过程复制的过程4 4、条件：条件：模板：模板：亲代亲代DNADNA的两条母链的两条母链 原料：原料：游离的四种脱氧核苷酸游离的四种脱氧核苷酸 能量：能量：ATPATP 酶：酶：解旋酶解旋酶 、DNADNA聚合酶聚合酶 引

3、物：一小段引物：一小段RNARNA，能与，能与DNADNA母链的一段碱基序母链的一段碱基序列互补配对列互补配对5 5、过程、过程（1）解旋：解旋酶）解旋：解旋酶、ATP（2）以）以DNA的两条母链为模板，根据碱基的两条母链为模板，根据碱基互补配对规则，合成子链。互补配对规则，合成子链。（3）子链、母链螺旋构成子代）子链、母链螺旋构成子代DNADNA体内复制（示意）体内复制（示意）6、复制特点半保留复制，边解旋边复制，多起点复制。半保留复制，边解旋边复制，多起点复制。7、DNA复制的方向DNA的合成方向总是从子链的的合成方向总是从子链的5端向端向3端延伸端延伸条件条件组分组分作用作用模板模板DN

4、ADNA的两条单链的两条单链提供复制的模板提供复制的模板原料原料四种脱氧核苷酸四种脱氧核苷酸合成合成DNADNA子链的原料子链的原料酶酶解旋酶解旋酶TaqDNA聚合酶聚合酶不需要不需要催化合成催化合成DNADNA子链子链能量能量ATPATP不需要不需要引物引物一般是一小段一般是一小段DNADNA使使DNADNA聚合酶能够从引物的聚合酶能够从引物的33端开始连接脱氧核苷酸端开始连接脱氧核苷酸 1 1、PCRPCR的技术（的技术（DNADNA体外复制）的条件体外复制）的条件DNADNA双链双链单链单链变性（加热变性（加热80-10080-100）复性（缓慢冷却）复性（缓慢冷却）一、一、PCRPCR

5、的原理的原理（PCRPCR的技术原理）的技术原理）一、一、PCRPCR的原理的原理（PCRPCR的技术原理）的技术原理）1234522557294时间（时间（minmin）温度（）适温延伸高温变性低温复性重复13步30轮3、DNA复制的方向DNA的合成方向总是从子链的的合成方向总是从子链的5端向端向3端延伸端延伸2 2、步骤：、步骤：变性变性 复性复性延伸延伸PCRPCR技术的原理总结技术的原理总结利用利用DNA分子的分子的热变性热变性原理，通过控制原理，通过控制温温度度来控制双链的来控制双链的解旋解旋与与结合，结合，从而完成从而完成体外体外DAN分子的扩增。分子的扩增。体外体外DNADNA复

6、制的条件：复制的条件：四种脱氧核苷酸、四种脱氧核苷酸、耐高温的耐高温的DNADNA聚合酶、引物、聚合酶、引物、模板；缓冲模板；缓冲溶液和严格控制温度的温控设备。溶液和严格控制温度的温控设备。复制的方向：复制的方向：子链的子链的5端向端向 3端延伸。端延伸。二、二、PCR的反应过程的反应过程 5/3/3/5/5/3/引物引物5/3/引物引物变性变性95oC复性复性55oC延伸延伸72oC5/3/3/5/5 引物引物15 引物引物2第二次复制第二次复制第一次复制第一次复制5 5 5 5 5 5 模板模板DNA5 5 5 5 5 5 5 5 每个循环包括：每个循环包括：变性变性 复性复性延伸延伸从第

7、二轮循环开始，上一次循环的产物也可从第二轮循环开始，上一次循环的产物也可以作为模板参与反应，并且以作为模板参与反应，并且由引物由引物延伸而延伸而成的成的DNADNA单链会与引物单链会与引物结合，进行结合，进行DNADNA的延的延伸，伸，这样，这样，DNADNA聚合酶只能特异性地复制聚合酶只能特异性地复制处于处于两个引物之间的两个引物之间的DNADNA序列，序列，使这段固定长度的使这段固定长度的序列序列呈指数扩增。呈指数扩增。PCRPCR的反应过程总结的反应过程总结三、三、PCR反应的实验操作反应的实验操作三、三、PCR反应的实验操作反应的实验操作（1）按配方将所需试剂摆放在实验桌上（）按配方将

8、所需试剂摆放在实验桌上（准备准备）（2）用）用微量移液器微量移液器按配方在微量按配方在微量离心管离心管中依次加入各组分（中依次加入各组分（移液移液）（3）盖严）盖严离心管离心管口的盖子，用手指轻轻弹击管壁（口的盖子，用手指轻轻弹击管壁（混合混合）（4）将微量离心管放在）将微量离心管放在离心机离心机上（上（离心离心）（5）将离心管放入）将离心管放入PCR仪仪上，设置好上，设置好PCR仪的循环程序（仪的循环程序（反应反应）四、结果分析与评价四、结果分析与评价DNA 含量的测定：稀释含量的测定：稀释对照调零对照调零测定测定计算（公式见计算（公式见P63）波长波长260nm处读数处读数蒸馏水蒸馏水做对

9、照做对照50倍倍 测定测定并并 的含量为的含量为体内体内DNA复制与复制与PCR的技术区别：的技术区别：体内复制体内复制PCRPCR技术技术解旋解旋在解旋酶作用下，细在解旋酶作用下，细胞提供胞提供ATPATP，部分解开，部分解开加热到加热到9494o oC,C,双链全双链全部解开，不需解旋酶部解开，不需解旋酶引物引物一小段一小段RNARNA一般用一般用DNADNA片段片段DNADNA聚合酶聚合酶细胞自身的细胞自身的DNADNA聚合酶聚合酶（不耐高温）（不耐高温）TaqDNATaqDNA聚合酶聚合酶复制特点复制特点半保留复制，边解旋半保留复制，边解旋边复制，多起点复制。边复制，多起点复制。半保留

10、复制，完全解半保留复制，完全解旋后复制，从模板链旋后复制，从模板链的一端开始复制。的一端开始复制。复制的方向复制的方向 子链的子链的55端向端向 33端端延伸延伸子链的子链的55端向端向 33端延伸端延伸课堂小结课堂小结多聚酶链式反应扩增多聚酶链式反应扩增DNA片段片段PCR原理原理DNA的复制需要酶、原料、能量、引物的复制需要酶、原料、能量、引物DNA的变性和复性受温度影响的变性和复性受温度影响PCR过程过程变性变性复性复性延伸延伸操作步骤操作步骤配制配制PCR反应体系反应体系移入离心管移入离心管放入放入PCR设置工作参数设置工作参数DNA扩增扩增测定含量测定含量稀释稀释调零调零测定并读数测

11、定并读数计算计算练习巩固练习巩固1、关于、关于PCR技术的应用，错误的一项是技术的应用，错误的一项是A 古生物学、刑侦破案、古生物学、刑侦破案、DNA序列测定序列测定B 诊断遗传疾病、基因克隆、古生物学诊断遗传疾病、基因克隆、古生物学C DNA序列测定、基因克隆、刑侦破案序列测定、基因克隆、刑侦破案D 诊断遗传疾病、合成核苷酸、诊断遗传疾病、合成核苷酸、DNA序列序列测定测定2、DNA的合成方向总是从子链的哪一的合成方向总是从子链的哪一端向哪一端延伸？端向哪一端延伸？3、PCR技术最突出的优点是技术最突出的优点是A 原理简单原理简单 B 原料易找原料易找C TaqDNA聚合酶有耐热性聚合酶有耐热性D 快速、高效、灵活、易于操作快速、高效、灵活、易于操作从子链的从子链的5端向端向3端延伸端延伸4、做、做PCR使用的微量离心管、枪头、缓冲使用的微量离心管、枪头、缓冲液及蒸馏水使用前必须进行的关键步骤是液及蒸馏水使用前必须进行的关键步骤是A 反复洗涤反复洗涤 B 不怕外源不怕外源DNA污染污染C 高压灭菌高压灭菌 D 在在20 储存储存一、一、PCR的原理的原理（1、体内、体内DNA的结构的结构）T1/2/3/4/5/1/2/3/4/5/ADNA分子的分子的-OH端为端为3/;磷磷酸基团的末端为酸基团的末端为5/。