溶血性贫血n课件.pptx

1、第九章 溶血性贫血第九章 溶血性贫血第九章 溶血性贫血1溶血性贫血的定义和临床表现2溶血性贫血的分类、发病机制、实验室检查和过筛试验3红细胞膜缺陷疾病的实验室检查及应用4红细胞酶缺陷的实验室检查及应用5血红蛋白的实验室检查及应用编辑制作杨晓斌第九章 溶血性贫血第九章 溶血性贫血第一节概述第一节概述由于某种原因使红细胞寿命缩短、破坏增加，超过骨髓造血代偿能力所致的一类贫血。溶血性贫血溶血性贫血若红细胞寿命缩短、破坏增加，但尚未超过骨髓造血的代偿能力时，临床上不表现贫血代偿性溶血性疾病代偿性溶血性疾病第九章 溶血性贫血第九章 溶血性贫血一、溶血性贫血的类型溶血性贫血按溶血的场所分类血管内溶血：RB

2、C多在血液循环中被破坏血管外溶血：RBC多在单核巨噬细胞中被破坏按溶血的急缓分类急性溶血性贫血慢性溶血性贫血按病因和发病机制分类遗传性溶血性贫血：多为RBC内在缺陷获得性溶血性贫血：多为RBC外在缺陷第九章 溶血性贫血第九章 溶血性贫血二、溶血性贫血的发病机制红细胞过早地被破坏可以发生在血管外或血管红细胞过早地被破坏可以发生在血管外或血管内。内。血管外溶血即红细胞被血管外溶血即红细胞被脾、肝的单核脾、肝的单核-巨噬细胞巨噬细胞系统系统吞噬后破坏。吞噬后破坏。血管内溶血是红细胞直接在血管内溶血是红细胞直接在血循环血循环中破裂，红中破裂，红细胞的内容物血红蛋白直接被释放入血浆。细胞的内容物血红蛋白

3、直接被释放入血浆。第九章 溶血性贫血第九章 溶血性贫血二、溶血性贫血的发病机制红细胞在单核-巨噬细胞中破环在血管内破环血管外溶血血管内溶血第九章 溶血性贫血第九章 溶血性贫血三、溶血性贫血的诊断方法第九章 溶血性贫血第九章 溶血性贫血血管内溶血和血管外溶血的鉴别特征特征血管内溶血血管内溶血血管外溶血血管外溶血病因获得性多见遗传性多见红细胞主要破坏场所 血管内单核-吞噬细胞系统病程多为急性常为慢性，急性加重贫血、黄疸常见常见肝、脾大少见常见红细胞形态异常正常或轻微异常明显异常红细胞脆性改变变化小多有改变血浆游离血红蛋白增加正常或轻度增高高铁血红素白蛋白增加正常血红蛋白尿常见无或轻度尿含铁血黄素慢

4、性可见一般阴性骨髓再障危象少见急性溶血加重时可见LDH增高轻度增高冷凝集素综合征（1：1 000）。间接抗人球蛋白（IAGT）操作步骤示意图1血象 有轻重不等的贫血，隐匿型可表现正常。2红细胞悬液制备 被检者和正常人的红细胞洗涤3次配成50%的红细胞悬液备用。骨髓有核细胞增生，以幼红细胞增生为主，粒/红比例倒置，幼红细胞可呈巨幼样变，但血清叶酸及维生素B12测定都在正常范围。本试验是目前诊断PNH特异性和敏感性最高且可定量的检测方法。血红素是铁原子和原卟啉的复合物，是含铁卟啉衍生物，铁原子位于原卟啉的卟啉环中心。二、溶血性贫血的发病机制【温抗体型AIHA实验室检查分析】被检血清ml 0.4流式

5、细胞术检测发现GPI锚连接蛋白（CD55或CD59）低表达的异常细胞群，支持PNH诊断。正常血红蛋白由两对珠蛋白肽链和4个亚铁血红素构成的4个亚基组成的四聚体，形状近似球形的结合蛋白。人民卫生出版社，2006.多为正细胞性贫血，红细胞大小不均，有异形和碎片，有时可见靶形红细胞，网织红细胞增高。二、溶血性贫血的发病机制85的甘油缓冲液中比正常红细胞溶解速度快，导致红细胞悬液的吸光度降至50%的时间（AGLT50）明显缩短。G-6-PD-CNSHAHbE病是出现血红蛋白E的常染色体不完全显性遗传性血红蛋白病，为我国最常见的血红蛋白病。直接抗人球蛋白试验阳性，主要为抗IgG型；冷凝集素综合征是冷诱导

6、因素导致的冷凝集素IgM抗体引起的自身免疫性慢性溶血性贫血和微循环阻塞为特征的一组疾病，又叫“冷血凝集素病”。部位部位溶血性贫血疾病名称溶血性贫血疾病名称筛选筛选/排除试验排除试验确诊试验确诊试验血管外溶血 遗传性球形红细胞增多症红细胞形态检查高渗冷溶血试验遗传性椭圆形红细胞增多症 渗透脆性试验、酸化甘油溶血试验膜蛋白电泳分析、膜脂质分析遗传性口形红细胞增多症自身溶血试验、红细胞腺苷三磷酸活性、Coombs试验膜蛋白基因分析、家系调查G-6-PD-CNSHA高铁血红蛋白还原试验、G-6-PD荧光斑点试验、硝基四氮唑蓝试验、Heinz小体生成试验红细胞G-6-PD活性测定基因分析丙酮酸激酶缺乏症

7、红细胞形态检查、PK荧光斑点试验PK活性定量测定嘧啶-核苷酶缺乏症红细胞形态检查、Ret、嘧啶核苷酸比率中间代谢产物测定、嘧啶-核苷酶活性测定珠蛋白生成障碍性贫血、血红蛋白病红细胞形态检查、红细胞包涵体试验、异丙醇沉淀试验、热变性试验、Heinz小体生成试验红细胞镰变试验、血红蛋白电泳、珠蛋白肽链分析、基因分析、吸收光谱测定温抗体型自身免疫性溶贫红细胞形态检查Coombs试验冷凝集素综合征红细胞形态检查、Coombs试验冷凝集素试验药物致免疫性溶血性贫血红细胞形态检查、Coombs试验加药后IAGT新生儿同种免疫性溶血症红细胞形态检查、Ret、胆红素代谢检查、血型鉴定Coombs试验、孕妇产前

8、免疫性抗体检查迟发性溶血性输血反应红细胞形态检查、Ret、血型鉴定Coombs试验、凝聚胺试验血管内溶血PNHRous试验、尿隐血试验、蔗糖溶血试验Ham试验、蛇毒溶血因子试验、补体敏感性试验蚕豆病高铁血红蛋白还原试验、G-6-PD荧光斑点试验、硝基四氮唑蓝试验、Heinz小体生成试验红细胞G-6-PD活性测定、基因分析阵发性冷性血红蛋白尿症Rous试验、Coombs试验冷热溶血试验药物致免疫性溶血性贫血Coombs试验IAGT及加药后的IAGT急发性溶血性输血反应Coombs试验血型鉴定及不同方法的交叉配血试验微血管病性溶血性贫血红细胞形态检查、Ret、血小板计数、血浆游离血红蛋白测定等止血

9、与血栓实验室检查及其他相关检查不同类型溶血性贫血试验选择不同类型溶血性贫血试验选择第九章 溶血性贫血第九章 溶血性贫血四、溶血性贫血的过筛试验常用的溶血性贫血的过筛试验游离血红蛋白血清结合珠蛋白尿含铁血黄素高铁血红素蛋白以鉴别溶血的部位是血管内溶血还是血管外溶血？第九章 溶血性贫血第九章 溶血性贫血（一）血浆游离血红蛋白测定常用邻-甲苯胺法检测，血红蛋白结构中的亚铁血红素有类似过氧化物酶的作用，催化过氧化氢释放新生态氧，使无色的邻-联甲苯胺氧化为蓝色。根据显色深浅，即可测出血浆游离血红蛋白的量。血红蛋白结构中的亚铁血红素有类似过氧化物酶的作用H2O2新生态O无色的邻-联甲苯胺氧化为蓝色【参考区

10、间】040mg/L第九章 溶血性贫血第九章 溶血性贫血【应用评价】正常情况，血浆中血红蛋白大部分与结合珠蛋白结合，仅有微量游离血红蛋白。测定血浆游离血红蛋白可判断红细胞的破坏程度。增高是判断血管内溶血的指征。蚕豆病、PNH、阵发性寒冷性血红蛋白尿、冷凝集素综合征、溶血性输血反应等明显增高；自身免疫性溶血性贫血、珠蛋白生成障碍性贫血可轻到中度增高。不增高 血管外溶血、红细胞膜缺陷不增高。（一）血浆游离血红蛋白测定第九章 溶血性贫血第九章 溶血性贫血（二）血清结合珠蛋白测定结合珠蛋白（Hp）是由肝脏合成的一种2糖蛋白，合成速度较慢；Hp具有结合游离血红蛋白的能力，在血红蛋白降解为胆红素的代谢过程中

11、具有重要的作用，在此过程中Hp本身也被分解，溶血性贫血时Hp因消耗而降低。用醋酸纤维薄膜电泳法检测，由于Hp具有结合游离血红蛋白的能力，故在测定血清Hp时，于待测血清中加入一定量的血红蛋白液，使之与待测血清中的Hp形成Hp-Hb复合物；再通过电泳法将结合的Hp-Hb复合物与未结合的Hb分开，测定Hp-Hb复合物的量，可测得血清中Hp的含量。【参考区间】0.51.5gHb/L第九章 溶血性贫血第九章 溶血性贫血【应用评价】正常情况下，血浆中的血红蛋白与结合珠蛋白结合形成复合物，在单核-巨噬细胞系统和肝内清除。溶血时血浆中的血红蛋白与Hp结合增多，使血清中结合珠蛋白减少，测定血清中结合珠蛋白的含量

12、可反映溶血的情况。减低常见于各种溶血，尤其是血管内溶血。但严重肝病、先天性无珠蛋白血症、传染性单核细胞增多症等Hp也明显减低，故注意鉴别增高常见于感染、创伤、SLE、恶性肿瘤、类固醇治疗、妊娠、胆道阻塞等（Hp为急性时相反应蛋白）。此时如Hp正常，不能排除合并溶血的可能。（二）血清结合珠蛋白测定第九章 溶血性贫血第九章 溶血性贫血（三）尿含铁血黄素试验当游离血红蛋白在血液中增多时，血红蛋白通过肾脏滤过形成血红蛋白尿；在此过程中，血红蛋白被肾小管上皮细胞部分或全部吸收，部分铁离子以含铁血黄素的形式沉积于上皮细胞，并随尿液排出。【参考区间】正常人为阴性含铁血黄素是不稳定的铁蛋白聚合体，为含铁质的棕

13、色色素，其中的高铁离子与亚铁氰化钾作用，在酸性环境下产生蓝色的亚铁氰化铁沉淀，此反应称为普鲁士蓝反应。用显微镜检查尿沉渣，细胞内外可见直径13的蓝色颗粒。第九章 溶血性贫血第九章 溶血性贫血【应用评价】尿含铁血黄素试验阳性提示慢性血管内溶血。无论有无血红蛋白尿，只要存在慢性血管内溶血如PNH，本试验即呈阳性，并可持续数周。但在溶血初期，虽然有血红蛋白尿，上皮细胞内尚未形成可检出的含铁血黄素，此时本试验可呈阴性反应。（三）尿含铁血黄素试验第九章 溶血性贫血第九章 溶血性贫血血红蛋白与Hp结合成Hb-Hp肝脏降解清除过剩的Hb珠蛋白血红素与白蛋白结合与血红素结合蛋白结合高铁血红素与血红蛋白结合Hb

14、消耗完后与白蛋白结合高铁血红素白蛋白与硫化铵形成铵血色原比色测定血红蛋白尿【参考区间】正常人呈阴性（四）高铁血红素白蛋白试验第九章 溶血性贫血第九章 溶血性贫血【应用评价】血管内溶血时，血浆中游离血红蛋白大量增加，血浆中可检测出高铁血红素白蛋白。只有在严重溶血时，Hp与Hx均被耗尽，高铁血红素方与白蛋白结合成高铁血红素白蛋白；故血清中出现高铁血红素白蛋白是溶血严重的指标。（四）高铁血红素白蛋白试验第九章 溶血性贫血第九章 溶血性贫血第二节第二节 红细胞膜缺陷检查及其应用红细胞膜缺陷检查及其应用红细胞携带氧气和二氧化碳，为体内重要的气体交换单元。膜的功能有：细胞变形性能，调节细胞内离子平衡，维持

15、细胞容积，稳定内环境红细胞和韧性和变形能力，对正常的微循环血流有重要的作用。红细胞膜参与细胞运输、信息传递、血型抗原、免疫反应、免疫调节及出、凝血调节等反应。红细胞直径为69m，呈双层凹面的圆盘状第九章 溶血性贫血第九章 溶血性贫血2珠蛋白生成障碍性贫血钙-ATP酶受抑制，钙沉积膜上，膜的柔韧性降低利用此实验可对高发区域人群或疑诊的新生儿进行筛查。当G-6-PD缺乏症时，由于NADPH生成减少或缺乏，高铁血红蛋白不被还原或还原速度减慢，高铁血红蛋白还原率下降。在孵育时，加入葡萄糖和ATP作为纠正物，观察溶血可否有一定的纠正，称为纠正试验。（一）珠蛋白生成障碍性贫血Rous试验、尿隐血试验、蔗糖

16、溶血试验中间代谢产物测定、嘧啶-核苷酶活性测定PNH患者因红细胞膜有缺陷而对补体敏感合成：65%合成于有核红细胞期，35%合成于网织红细胞期正常人高铁血红蛋白还原率75%（脐带血77%）。某些血红蛋白病骨架蛋白等可明显异常。3G-6-PD活性正常时，红细胞通过磷酸戊糖旁路形成NADPH使MHb还原成亚铁血红蛋白，因而含变性珠蛋白小体的红细胞减少，而G-6-PD活性减低时，NADPH减少，MHb增多，导致含变性珠蛋白小体的红细胞增多，不稳定血红蛋白由于血红蛋白分子结构发生改变，稳定性减低易被氧化，含变性珠蛋白小体的红细胞可增多，伯氨喹啉型溶血性贫血，含变性珠蛋白小体的红细胞也可增多。2HbA2增

17、多，见于珠蛋白生成障碍性贫血，为杂合子的重要实验室诊断指标。2变性珠蛋白小体，主要是、珠蛋白链的病变而引起的溶解度和稳定性降低所致；NADPH的吸收峰在波长340nm处，可通过单位时间生成的NADPH的量来测定G-6-PD活性。红细胞对低渗的抵抗能力与其表面积与容积的比值有关，比值小，说明红细胞容积已胀大，对低渗抵抗力小，渗透脆性增加；【参考区间】正常血片含HbF的着色红细胞0.出现细胞膜对自身补体（C3）敏感性增高的异常红细胞，引起慢性血管内溶血。实验室检查酸化血清溶血试验（Ham试验）为阳性。一、概述低渗溶液中，血红蛋白逸出，红细胞残留的完整的红细胞膜，称为影细胞红细胞膜蛋白质占49.3、

18、脂质42、糖类8蛋白质与脂质的比例约为1:1；比值变化与膜的功能相关，两者在很大程度上决定着膜的理化特征任何原因引起的溶血都必然有红细胞膜的缺陷或损伤第九章 溶血性贫血第九章 溶血性贫血红细胞膜膜蛋白膜脂质膜糖类与膜脂质形成糖脂与膜蛋白形成糖蛋白糖链裸露膜外，有受体、抗原性、信息传递功能，称之细胞天线磷脂糖脂胆固醇甘油磷脂鞘磷脂胆固醇脂游离胆固醇鞘糖脂与膜脂质形成脂蛋白与糖类形成糖蛋白外周蛋白内在蛋白胆固醇/磷脂（C/P）比值约为0.81.0一、概述第九章 溶血性贫血第九章 溶血性贫血红细胞膜为脂质双层结构，蛋白质镶嵌在脂质双层内又相互连续形成膜的骨架。电镜下观察红细胞膜呈三层暗-亮-暗区带，

19、外层含糖脂、糖蛋白和蛋白质，具亲和水性；中间层含磷脂、胆固醇、蛋白质为疏水性；内层主要包含蛋白质，呈亲水性。红细胞膜结构液态镶嵌模型带3带4.2锚蛋白膜收缩蛋白膜收缩蛋白肌动蛋白带4.1血型蛋白C膜脂质双层第九章 溶血性贫血第九章 溶血性贫血红细胞膜结构的两个基本的特征膜的不对称性膜的流动性膜的内外两层的组分和功能有明显的差异，称为膜的不对称性红细胞膜结构第九章 溶血性贫血第九章 溶血性贫血红细胞膜的功能运输物质运输物质变形性变形性免疫功能免疫功能抗原性抗原性血型抗原老化抗原影响变形性因素：膜骨架蛋白组分和功能状态膜脂质流动性大有利于变形细胞表面积与体积比值血红蛋白的质和量膜的离子通透性第九章

20、 溶血性贫血第九章 溶血性贫血二、实验室检查红细胞渗透脆性试验红细胞膜蛋白电泳分析血细胞表型分析红细胞孵育渗透脆性试验酸化血清溶血试验蔗糖溶血试验红细胞自身溶血试验及其纠正试验常见实验常见实验室检查室检查酸化甘油溶血试验第九章 溶血性贫血第九章 溶血性贫血（一）红细胞渗透脆性试验红细胞在不同浓度的低渗盐溶液中，水分通过红细胞膜进入细胞内，当水渗透达一定程度时，红细胞发生膨胀破裂。根据不同浓度的低渗盐溶液中红细胞溶血的情况，反映红细胞对低渗盐溶液的抵抗能力。低渗盐低渗盐红细胞对低渗的抵抗能力与其表面积与容积的比值有关，比值小，说明红细胞容积已胀大，对低渗抵抗力小，渗透脆性增加；反之抵抗力增大，渗

21、透脆性降低。第九章 溶血性贫血第九章 溶血性贫血【参考区间】简易半定量法：开始溶血：3.84.6g/L完全溶血：2.83.2g/L增加主要见遗传性球形红细胞增多症、椭圆形红细胞增多症和部分自身免疫性溶血性贫血。降低主要见于珠蛋白生成障碍性贫血、血红蛋白C、D、E病，低色素性贫血、阻塞性黄胆、脾切除术后等。（一）红细胞渗透脆性试验第九章 溶血性贫血第九章 溶血性贫血（二）红细胞孵育渗透脆性试验血液置于37温箱孵育24h葡萄糖的消耗，贮备的ATP减少膜对阳离子的主动传递受阻，Na在红细胞内聚集红细胞膨胀，孵育渗透脆性增加正常人的红细胞经孵育处理后，其渗透脆性变化不明显，而有细胞膜缺陷或某些酶缺陷的

22、红细胞，由于其内的葡萄糖和ATP很快被消耗，孵育后脆性明显增加。第九章 溶血性贫血第九章 溶血性贫血【参考区间】未孵育50%溶血：4.004.45g NaCL/L；37孵育24h 50%溶血：4.655.90g NaCL/L增加见于轻型遗传性红细胞增多症，遗传性非球形红细胞溶血性贫血。降低见于珠蛋白生成障碍性贫血、缺铁性贫血、镰状细胞性贫血、脾切除手术后。本试验用于轻型遗传性红细胞增多症，遗传性非球形红细胞溶血性贫血的诊断和鉴别诊断。（二）红细胞孵育渗透脆性试验第九章 溶血性贫血第九章 溶血性贫血抗IgG血清2滴 抗IgG血清2滴 抗IgG血清2滴 生理盐水2滴【免疫复合型实验室检查】根据不同

23、的血红蛋白带有不同的电荷，等电点不同，在一定的pH缓冲液中，缓冲液的pH大于Hb的等电点时其带负电荷，电泳时在电场中向阳极泳动；【参考区间】成人2%，新生儿40%（2）PNH-再障：指原有肯定的PNH（而非下述的第4类），转为明确的再障，PNH的表现已不明显。G-6-PD缺陷者的荧光很弱或无荧光；本病的特征是血片中出现较多的口形红细胞，有轻重不一的溶血阳性家族史。再障-PNH综合症再分为四种情况：PK基因缺陷，常染色体隐性遗传，仅次于G-6-PD缺陷症遗传性球形红细胞增多症在G-6-PD和NADP+存在下，G-6-PD能使NADP+还原成NADPH，后者在紫外线照射下会发出荧光。红细胞酶缺陷是

24、指参与红细胞代谢（主要是糖代谢）的酶由于基因突变导致的酶活性或性质改变所引起的溶血及（或）其他表现的疾病。所用红细胞必须洗涤，未洗涤红细胞不能用于本试验。59）U/gHb（37）（ICSH推荐的Glock与McLean法）红细胞、血红蛋白低于正常值。遗传性椭圆形红细胞增多症骨髓象 骨髓增生活跃，幼红细胞增生显著。温抗体型AIHA，是由于抗体附着在红细胞表面，导致红细胞呈球形，故应注意与遗传性球形红细胞增多症(HS)相鉴别，HS可有阳性家族史，但无抗自身红细胞的温抗体。自身免疫性溶血性贫血杂合子形式，即红细胞镰状细胞性状；根据显色深浅，即可测出血浆游离血红蛋白的量。【PCH的鉴别诊断】使对补体敏

25、感的红细胞膜造成缺损，红细胞溶解破损370C水浴1h离心弃去上清液洗涤3次分别配成5%红细胞悬液。试管号 1 2 3 4 5 6 16 17红细胞酶缺陷是指参与红细胞代谢（主要是糖代谢）的酶由于基因突变导致的酶活性或性质改变所引起的溶血及（或）其他表现的疾病。干细胞型又称干细胞增多症或脱水型细胞增多症，由于细胞脱水致红细胞边缘皱褶或不规则，有时可呈靶形；正常人各管均为阴性，无溶血。出现细胞膜对自身补体（C3）敏感性增高的异常红细胞，引起慢性血管内溶血。根据显色深浅，即可测出血浆游离血红蛋白的量。某些病毒感染可阳性，但此时的PCH一般是短暂的。注意与自身免疫性溶血性贫血所致继发性球形红细胞增多症

26、相鉴别，后者Coombs（+）。直接抗人球蛋白（DAGT）结果观察示意图注：表中“”表示混匀后并吸出液体ml数；在单核-巨噬细胞中破环遗传性球形红细胞增多症的红细胞膜脂质减少，表面积/体积的比值降低、细胞球形化，膜蛋白及膜脂质有缺陷红细胞镰变试验、血红蛋白电泳、珠蛋白肽链分析、基因分析、吸收光谱测定温抗体型AIHA外周血象红细胞事先要经酶处理，才能引起凝集或溶血反应成熟红细胞内的主要蛋白质是血红蛋白（Hb），占细胞干重的96%，占细胞容积的35%。是一组由于红细胞膜蛋白异常引起的异质性家族遗传性溶血病，其共同特点是外周血中存在大量的椭圆形成熟红细胞。遗传性球形红细胞增多症（三）红细胞自身溶血试

27、验及其纠正试验血液置于37温箱孵育24h葡萄糖的消耗，贮备的ATP减少膜对阳离子的主动传递受阻，Na在红细胞内聚集红细胞膨胀，孵育渗透脆性增加在孵育时，加入葡萄糖和ATP作为纠正物，观察溶血可否有一定的纠正，称为纠正试验。【参考区间】正常人红细胞孵育48小时，不加纠正物的溶血率4.0%，加葡萄糖的溶血率1.0%，加ATP纠正物的溶血率290s【应用评价】遗传性球形红细胞增多症AGLT50明显缩短（1525s）。自身免疫性溶血性贫血、肾功能衰竭、妊娠等AGLT50也可缩短。第九章 溶血性贫血第九章 溶血性贫血（五）酸化血清溶血试验正常人的血清，在pH6.4pH6.6条件下酸化，补体被激活PNH患

28、者体内存在对补体敏感的红细胞，在此条件下发生溶血。而正常人的红细胞不被溶解。将血清加热5630min灭活补体后，血清失去溶血作用。本实验是PNH的确证实验；其假阳性和假阴性较少见，但如患者多次输血而使其补体敏感红细胞相对减少时，可呈弱阳性或阴性。某些自身免疫性溶血性贫血患者溶血发作严重时也偶呈阳性，此时，如果血清加热破坏补体后，试验结果由阳性转变为阴性，那么更支持PNH的诊断。第九章 溶血性贫血第九章 溶血性贫血（六）蔗糖溶血试验PNH患者因红细胞膜有缺陷而对补体敏感在离低子强度的蔗糖溶液中，补体与细胞膜的结合加强使对补体敏感的红细胞膜造成缺损，红细胞溶解破损【参考区间】正常人为阴性【应用评价

29、】本试验比酸溶血试验敏感，但特异性较差，是PNH简易过筛试验。再生障碍性贫血、巨幼红细胞性贫血和自身免疫性溶血性贫血患者也可出现阳性，故必要时需做酸化血清溶血试验加以鉴别。第九章 溶血性贫血第九章 溶血性贫血（七）血细胞表型分析血细胞表型分析PNH是一种获得性基因突变导致的克隆性疾病，其异常的血细胞膜糖化肌醇磷脂锚（GPI-anchor）连接蛋白如CD59,CD55等表达明显减低或缺乏，细胞膜对补体的敏感性增强而引起溶血性贫血。用GPI连接蛋白如CD59的单克隆抗体作分子探针，流式细胞术分析红细胞和白细胞膜CD59等分子的表达量和计数其缺乏表达（阴性）细胞的数量。【参考范围】PNH诊断的临界值

30、：CD59阴性的红细胞大于5%和CD59阴性的中性粒细胞大于10%，非PNH者均小于5%；PNH患者CD59阴性的红细胞大于9%，多数患者大于20%；CD59阴性的中性粒细胞均大于16%。【应用评价】该实验的灵敏度和特异性可达100，而Ham实验的灵敏度为50左右，但实验需要的流式细胞仪其价格比较贵，实验价格也较高。第九章 溶血性贫血第九章 溶血性贫血（八）红细胞膜蛋白电泳分析将制备的红细胞膜样品进行SDS-PAGE电泳，根据样品中各种蛋白相对分子质量的不同，分离得到红细胞膜蛋白的电泳图谱，从而可见各膜蛋白组分百分率。红细胞各种膜蛋白组分百分率变化较大，与正常红细胞膜蛋白电泳图谱作比较。或以带

31、3蛋白为基准，各膜蛋白含量与带3蛋白的比例表示。许多先天性和后天性溶血性贫血都伴有红细胞膜蛋白异常，各种膜缺陷疾病如遗传球形红细胞增多症有收缩蛋白等含量减低或结构异常。某些血红蛋白病骨架蛋白等可明显异常。第九章 溶血性贫血第九章 溶血性贫血三、红细胞膜缺陷检查的应用红细胞膜缺陷原发性先天性遗传性球形细胞增多症遗传性椭圆形红细胞增多症遗传性口形红细胞增多症后天获得性继发性红细胞酶或血红蛋白缺陷外在因素影响第九章 溶血性贫血第九章 溶血性贫血（一）遗传性球形红细胞增多症遗传性球形红细胞增多症是一种红细胞膜蛋白结构异常所致的遗传性溶血病，其特点是外周血中出现较多小球形红细胞。多呈常染色体显性遗传，少

32、数呈常染色体隐性遗传的HS常合并新的基因突变而发病，研究显示HS有第8号染色体短臂缺失。贫血、黄疸和脾肿大，是最常见的临床表现红细胞膜收缩蛋白自身聚合位点及其结构的区域异常膜结构与功能的异常钠泵功能亢进，钠、水进入细胞增多红细胞呈球形红细胞内的ATP相对缺乏钙-ATP酶受抑制，钙沉积膜上，膜的柔韧性降低该红细胞通过脾脏被截留，于巨噬细胞内破坏破坏不能被机体代偿时出现溶血性贫血第九章 溶血性贫血第九章 溶血性贫血实验室检查遗传性球形红细胞增多症1血象 血红蛋白和红细胞量多为正常或轻度降低，血片中出现小球形红细胞为本病的血液形态学特征；网织红细胞增加，一般为5%10%，急性溶血发作时可高60%70

33、%。嗜多色性红细胞增多，外周血中可出现少数幼稚红细胞。2骨髓象 红细胞增生旺盛，粒红比值降低，红细胞系以中、晚幼红细胞为主，可占有核细胞的25%60%；当发生再障危象时，骨髓中红细胞系再生低下，有核红细胞减少。3渗透脆性试验 HS红细胞渗透脆性增高4红细胞膜电泳分析 SDS-PAGE电泳可得到红细胞膜蛋白各组分的百分率，80%的患者可发现异常。5红细胞膜蛋白定量测定 绝大多数HS有一种或多种膜蛋白缺乏6分子生物学技术应用球形红细胞较正常红细胞小、厚，且深染，大小比较均一，直径变小（6.27.0m），厚度增加（2.23.4m），染色后细胞中央淡染区消失，小球形红细胞所占的比例在不同的患者中差别较

34、大，多数患者在10%以上（正常人多5%）。第九章 溶血性贫血第九章 溶血性贫血诊断和鉴别诊断HS无特异的临床表现和实验室检查，诊断时应结合病史、临床表现和实验室检查综合分析。血涂片中小球形细胞大于10%，红细胞渗脆性增加，有阳性的家族史，本病的诊断可成立。注意与自身免疫性溶血性贫血所致继发性球形红细胞增多症相鉴别，后者Coombs（+）。对Coombs试验多次阴性者，应作红细胞膜蛋白分析和组分定量，必要时采用基因序列分析的方法，寻找诊断依据和进行家系调查以鉴别诊断。第九章 溶血性贫血第九章 溶血性贫血（二）遗传性椭圆形红细胞增多症是一组由于红细胞膜蛋白异常引起的异质性家族遗传性溶血病，其共同特

35、点是外周血中存在大量的椭圆形成熟红细胞。HE大多为常染色体显性遗传，极少数为常染色体隐性遗传。定义本病的原发病变是膜骨架蛋白异常，其膜收缩蛋白结构有缺陷，膜骨架稳定性降低。HE的红细胞在骨髓释放入血液循环后由于膜骨架蛋白的缺陷，在通过微循环时由于切变力的作用变成椭圆形后不能恢复正常，同时，红细胞由于膜骨架稳定性的降低容易破坏，大多数椭圆形红细胞在脾脏被破坏。第九章 溶血性贫血第九章 溶血性贫血诊断和鉴别诊断遗传性椭圆形红细胞增多症1血象 有轻重不等的贫血，隐匿型可表现正常。血片中椭圆形红细胞的比例大于25%。其形状呈椭圆形、卵圆形、棒状或腊肠形，椭圆形红细胞横径与纵径之比小于0.78，硬度增加

36、，中心淡染区消失。2骨髓象 骨髓红细胞系统增生活跃为增生性贫血骨髓象。3红细胞渗透脆性试验 红细胞渗透脆性试验和自身溶血试验多增高。4红细胞膜蛋白电泳分析及低离子强度非变性凝胶电泳膜收缩蛋白分析 其异常结果有助于膜分子病变的确定。5分子生物学方法 检测某些膜蛋白基因突变。依据临床表现、家族调查和相关实验室检查多数病例可确诊，无阳性家族史时若椭圆形红细胞大于50%也可明确诊断。本病应与缺铁性贫血、巨幼细胞贫血、骨髓纤维化、骨髓病性贫血、骨髓增生异常综合征、珠蛋白生成障碍性贫血等鉴别。第九章 溶血性贫血第九章 溶血性贫血（三）遗传性口形红细胞增多症是一种罕见的常染色体显性遗传性慢性溶血性贫血。本病

37、的特征是血片中出现较多的口形红细胞，有轻重不一的溶血阳性家族史。HST不是单一的疾病，而是发病机制、红细胞形态和临床表现都不同的一组综合征。定义在口形细胞中，钠离子浓度增高，钾离子浓度减低，从而使离子泵的负荷增至610倍，但仍不足以代偿钠钾的失衡状态，导致细胞水肿、肿胀，体积增大，红细胞脆性增高。根据口形红细胞内钠、钾离子和阳离子总量的多少水肿细胞型又称水肿细胞增多症，其细胞内钠、钾离子和阳离子总量明显增多，致水分进入细胞内，使红细胞肿胀表现为口形；此型细胞渗透脆性增加，变形能力减弱，在脾扣留被巨噬细胞吞噬破坏。干细胞型又称干细胞增多症或脱水型细胞增多症，由于细胞脱水致红细胞边缘皱褶或不规则，

38、有时可呈靶形；此种细胞变形能力降低，红细胞渗透脆性降低，主要在单核-巨噬细胞系统内破坏。其他细胞型第九章 溶血性贫血第九章 溶血性贫血诊断和鉴别诊断遗传性口形红细胞增多症血片中口形红细胞增多，可达10%50%。口形红细胞中心苍白区呈狭窄的裂缝，裂缝的中央较两端更为狭窄，缝的边缘清楚，类似微张的鱼口；而在湿血片中，红细胞双凹面消失而呈单面凹，形似碗状。正常人外周血中也可见到少量口形细胞，一般为小于4%。贫血一般轻微，血红蛋白很少低于80g/L，多数患者网织红细胞增多，约1020；红细胞渗透脆性试验增高，也可正常或降低；自身溶血可呈阳性，可被葡萄糖或ATP部分纠正。依据临床表现、外周血口形红细胞增

39、多和家族史一般可作出诊断。但需要与继发性口形红细胞增多症相鉴别，继发性口形红细胞增多症除口形红细胞增多外，一般无溶血，缺乏家族史，并具有相应疾病的特征。第九章 溶血性贫血第九章 溶血性贫血诊断依据是红细胞G-6-PD活性的实验室检查，临床表现及阳性家族史2HbF相对增多 某些血液疾病【原理】自身免疫性溶血性贫血的自身抗体（IgG），是不完全抗体，结合在红细胞表面，使其致敏。抗 C3型多为阴性，仅17%弱阳性温抗体型自身免疫性溶血性贫血因有冷凝集素的作用，故试验必须在37条件下进行，在试验前红细胞应先用温盐水洗涤过。或定量测定G-6-PD活性较正常平均值降低40%以上，均可确诊。血红蛋白的合成受

40、铁的供应、原卟啉和珠蛋白合成的影响。第四节 血红蛋白病检查（一）温抗体型自身免疫性溶血性贫血（温抗体型AIHA）红细胞各种膜蛋白组分百分率变化较大，与正常红细胞膜蛋白电泳图谱作比较。IgG是引起该贫血的主抗体，与红细胞的最适反应温度为3540的自身抗体称为温抗体。是一种变性血红蛋白颗粒，一般附着在细胞膜上，故又称血红蛋白包涵体，变性珠蛋白小体可被碱性染料着色。3冷藏与水浴 将以上试管混匀冷藏（25）2h取出观察结果记录凝集管最高稀释度再将所有试管放入37水浴2h取出观察凝集是否消失。2骨髓象 骨髓红细胞系统增生活跃为增生性贫血骨髓象。遗传性球形红细胞增多症的红细胞膜脂质减少，表面积/体积的比值

41、降低、细胞球形化，膜蛋白及膜脂质有缺陷使对补体敏感的红细胞膜造成缺损，红细胞溶解破损膜骨架蛋白组分和功能状态【DAGT 与IAGT临床意义】参与核苷酸代谢或转变为3-磷酸甘油醛后参与糖酵解测定管凝集 阳性对照管凝集 阴性对照管不凝集 盐水对照管不凝集（四）阵发性冷性血红蛋白尿症 PCH（四）阵发性睡眠性血红蛋白尿症是一种获得性造血干细胞基因突变引起红细胞膜缺陷所致的溶血病。出现细胞膜对自身补体（C3）敏感性增高的异常红细胞，引起慢性血管内溶血。睡眠时加重，可伴发作性血红蛋白尿和全血细胞减少症。定义骨髓造血组织受到损伤，而引起多能造血干细胞的基因突变，产生膜异常的干细胞克隆，异常造血干细胞不断增

42、生、分化，形成具有PNH缺陷的细胞群；这种缺陷不仅累及红细胞，也累及患者的粒细胞、淋巴细胞和血小板。患者体内红细胞分三型型对补体的敏感性正常；型对补体中度敏感；型对补体高度敏感。与睡眠有关的间歇溶血发作，以血红蛋白尿为主要特征，多为慢性血管内溶血，伴有全血细胞减少和反复血栓形成。临床表现发病机制第九章 溶血性贫血第九章 溶血性贫血实验室检查阵发性睡眠性血红蛋白尿症1血象 贫血，呈正色素性或低色素性贫血，网织红细胞常增高，可见有核红细胞及红细胞碎片。白细胞和血小板多减少，半数患者呈全血细胞减少。2骨髓象 半数以上的患者三系增生活跃，尤以红系造血旺盛。随病情变化表现不一，不同穿刺部位增生程度可明显

43、差异。3特殊溶血试验（1）溶血存在的依据：尿隐血试验或尿含铁血黄素试验阳性。（2）补体敏感的红细胞存在的依据：蔗糖溶血试验、热溶血试验、酸化血清溶血试验。4流式细胞术检测发现GPI锚连接蛋白（CD55或CD59）低表达的异常细胞群，支持PNH诊断。本试验是目前诊断PNH特异性和敏感性最高且可定量的检测方法。第九章 溶血性贫血第九章 溶血性贫血诊断和鉴别诊断阵发性睡眠性血红蛋白尿症1诊断标准临床表现符合PNH或上述必须考虑为PNH的表现情况；有肯定的血红蛋白尿发作或血管内溶血的直接、间接证据；实验室检查证明有补体敏感的红细胞群存在和检测CD55及CD59这两种常见的血细胞表面锚蛋白相关抗原的表达

44、情况是确诊试验。2鉴别诊断 排除其他溶血病，全血细胞减少还应与再障鉴别。3再障-PNH综合症的诊断 凡再障转化为PNH，或PNH转化为再障，或兼有两病特征者，均属再障PNH综合征。再障-PNH综合症再分为四种情况：（1）再障-PNH：指原有肯定的再障（而非未能诊断的PNH早期表现），转为可确定的PNH，再障的表现已不明显。（2）PNH-再障：指原有肯定的PNH（而非下述的第4类），转为明确的再障，PNH的表现已不明显。（3）PNH伴有再障特征：指临床及实验室检查所见均说明病情仍以PNH为主，但伴有一个或一个以上部位骨髓增生低下、巨核细胞减少、网织红细胞不增高等再障表现者。（4）再障伴有PNH特

45、征：指临床及实验室检查所见均说明病情仍以再障为主，但伴有PNH的实验诊断结果阳性者。第九章 溶血性贫血第九章 溶血性贫血PNH与再障的鉴别临床症状与实验室检查临床症状与实验室检查PNH再生障碍性贫再生障碍性贫血血出血较少，且程度较轻常有，程度较重感染较少较多巩膜黄染部分病例有无肝脾肿大部分病例有偶见全血细胞减少约半数病例有所有病例有血小板波动约半数病例有，可达正常少有波动感染时白细胞升高反应无少有网织红细胞常增高常减少骨髓增生活跃或明显活跃约90.5%约40.7%中性粒细胞碱性磷酸酶积分明显降低增高血清胆红素明显增高可轻度增高蔗糖溶血试验阳性阴性尿含铁血黄素试验均有罕见酸化血清溶血试验阳性阴性

46、第九章 溶血性贫血第九章 溶血性贫血最常见的为葡萄糖6-磷酸脱氢酶缺陷症、丙酮酸激酶缺陷症。第三节第三节 红细胞酶缺陷检查红细胞酶缺陷检查定义红细胞酶缺陷是指参与红细胞代谢（主要是糖代谢）的酶由于基因突变导致的酶活性或性质改变所引起的溶血及（或）其他表现的疾病。按细胞内代谢作用不同糖酵解途径的酶缺乏己糖激酶（HK）葡萄糖磷酸异构酶（GPI）丙酮酸激酶（PK）磷酸果糖激酶（PFK）戊糖磷酸旁路代谢的酶缺乏葡萄糖-6-磷酸脱氢酶（G-6-PD）6-磷酸葡萄糖酸脱氢酶（6PGD）核苷酸代谢的酶缺陷嘧啶5核苷酸酶（P5N）腺苷酸激酶（AK）第九章 溶血性贫血第九章 溶血性贫血一、红细胞的糖代谢乳酸脱氢

47、酶葡萄糖6-磷酸葡萄糖磷酸烯醇式丙酮酸丙酮酸乳酸5-磷酸核酮糖6-磷酸葡萄糖酸ADPATPNADHNAD-丙酮酸激酶NADPH+H+NADP+NADP+G-6-PD6PGD谷胱甘肽还原酶NADPH+H+氧化型谷胱甘肽谷胱甘肽还原型谷胱甘肽谷胱甘肽过氧化酶H2OH2O2参与核苷酸代谢或转变为3-磷酸甘油醛后参与糖酵解糖酵解途径糖酵解途径戊糖磷酸旁路途径戊糖磷酸旁路途径第九章 溶血性贫血第九章 溶血性贫血二、实验室检查（一）高铁血红蛋白还原试验G6PG-6-PDNADP还原型美蓝高铁血红蛋白（Fe3+）高铁血红蛋白还原酶6-磷酸葡萄糖酸NADPH氧化型美蓝血红蛋白（Fe2+）1.加入亚硝酸盐使红细

48、胞中的亚铁血红蛋白氧化成高铁血红蛋白，正常红细胞的G-6-PD催化戊糖旁路使NADP成NADPH，其脱下的氢通过亚甲蓝试剂的递氢作用而使高铁血红蛋白（Fe3+）还原成亚铁血红蛋白（Fe2+），比色测定。2.当G-6-PD缺乏症时，由于NADPH生成减少或缺乏，高铁血红蛋白不被还原或还原速度减慢，高铁血红蛋白还原率下降。3.正常人高铁血红蛋白还原率75%（脐带血77%）。4.G-6-PD缺乏时，高铁血红蛋白还原率下降。中间缺乏（杂合子）为31%74%，严重缺乏（半合子或纯合子）30%。第九章 溶血性贫血第九章 溶血性贫血（二）变性珠蛋白小体生成试验G-6-PD缺乏的病人血样加入乙酰苯肼于37孵育

49、24小时，使血红蛋白变性，用煌焦油蓝等碱性染料染色观察红细胞珠蛋白小体的生成情况，计算含5个及以上珠蛋白小体的红细胞的百分率。正常人含5个及以上珠蛋白小体的红细胞一般30%。二、实验室检查第九章 溶血性贫血第九章 溶血性贫血应用评价1G-6-PD缺乏症常高于45%，可作G-6-PD缺乏的筛检试验。但还原型谷胱甘肽缺乏症也增高；不稳定血红蛋白病含小体的细胞百分率为75%84%，HbH病和化学物质中毒时也增高。2变性珠蛋白小体，主要是、珠蛋白链的病变而引起的溶解度和稳定性降低所致；是一种变性血红蛋白颗粒，一般附着在细胞膜上，故又称血红蛋白包涵体，变性珠蛋白小体可被碱性染料着色。该实验与异丙醇试验和

50、热不稳定实验一样可作为不稳定血红蛋白存在的一种证据。3G-6-PD活性正常时，红细胞通过磷酸戊糖旁路形成NADPH使MHb还原成亚铁血红蛋白，因而含变性珠蛋白小体的红细胞减少，而G-6-PD活性减低时，NADPH减少，MHb增多，导致含变性珠蛋白小体的红细胞增多，不稳定血红蛋白由于血红蛋白分子结构发生改变，稳定性减低易被氧化，含变性珠蛋白小体的红细胞可增多，伯氨喹啉型溶血性贫血，含变性珠蛋白小体的红细胞也可增多。（二）变性珠蛋白小体生成试验第九章 溶血性贫血第九章 溶血性贫血在G-6-PD和NADP+存在下，G-6-PD能使NADP+还原成NADPH，后者在紫外线照射下会发出荧光。NADPH的