植物种质资源离体超低温保存课件.ppt

1、植物种质资源离体超低温保存第一节 概 述n植物种质资源保存主要有原地保存、异地保存和设施保存3种方式.设施保存是当前最有效、最安全的保存方式,它包括种子低温保存、超低温保存及种质离体保存等方法.第一节 概 述n原地保存是指在植物资源丰富的地区建立自然保护区、原地保存林等，以保护植物种质资源及其生境；n异地保存是指当天然群体的遗传组成发生严重的变化，或存在潜在破坏威胁的物种，在植物种的非本地群体中收集种子或繁殖材料，营建异地保存林(圃)进行集中保存。第一节 概 述n设施保存，也叫设备保存、离体保存，就是利用种质资源库(冷藏库、超低温库、组织培养室)等保存设施长期保存种子、配子体、器官、组织、细胞

2、等种质材料，来达到保存植物种质资源的目的，它也可以被看作是异地保存中的一种形式。设施保存可以大批量贮藏种质材料于一个较小的可以人工控制的空间，并能安全地保存种质30-50年以上，具有种质不易丢失、便于交换和利用等特点，是一种行之有效的保存方式。第一节 概 述n世 界 自 然保护联盟(IUCN)在1978年出版的植物红皮书一书中指出:在全世界分布的约25万种维管束植物中，估计约有2万一万种(占整个区系成分的10%)处于很稀少或受严重威胁的状况，这意味着人类赖以生存的植物资源陷人了生存危机。第一节 概 述n我国是一个植物资源丰富的国家，约有高等植物3万多种，占世界第三位，位居北半球之首，并且特有程

3、度高，生物区系起源古老，是世界上屈指可数的植物遗传资源起源中心之一，但其物种流失的态势也不容乐观。据估计，我国有高等植物万种，受到灭绝威胁的约有4 000-5000种，占总数的12%一15%左右。第一节 概 述n 早在上个世纪中叶，世界各国就已经开始进行植物(包括作物和森林植物)种质资源的收集和保存工作。联合国粮农组织(FAO)在1947-1948年成立了“动植物遗传资源委员会”，1967年成立了森林遗传资源专家组。FAO/IBPGR支持和协调国家与地区的遗传资源的调查、保存和利用，负责咨询有关提案和计划，并在利用有限资金保存作物种质资源。第一节 概 述n 目前，发 达国家的种质资源研究已进人

4、到常规方法与分子技术相结合的研究阶段，分子标记技术的利用大大加快了种质资源鉴定的速度和准确性。美国田间种植圃保存的10万份无性繁殖生物种质资源，已有56%进行了同功酶,RAPD,AFLP和SSR等分子标记的种质学评价，33%的资源圃建立了核心种质资源。第一节 概 述n 保存种 子、配子、器官或组织等，在人工条件下使植物的基因(载体)能得到延续，为未来的植物利用、培育计划服务，这是当前世界各国生物多样性保护工作的重点之一。第一节 概 述 全世界到1996年已建成1300多座植物种质资源保存库，共保存各类植物种质610万份(含重复)，其中低温库保存550万份，田间种植保存库52.7万份，试管苗保存

5、万份。1958年建成的美国国家种质库是世界上第一座现代化种质库，该库于1992年扩建成库容100万份的现代化国家种质库，已保存各类植物种质资源55万份，在科罗拉多Fort Collins的种子库则在一196保存了26万份含水量6%的植物种子。第一节 概 述n 发展中国家印度也于1976年成立国家植物种质资源局(NBPGR)，下设30个单位组成全印植物种质资源保存体系，已保存20万份种质，每年用于植物种质资源保存维护费110万美元；1997年建成库容100万份的国家植物种质资源库，成为世界植物种质资源大国。第一节 概 述n 英国 皇 家 植物园邱园的千年种子库工程(ms-BP)，是目前世界上最大

6、的种质设施保存库。该库于2001年建成并投人使用，MSBP计划到2010年使得全世界干早地区2.4万种以上(约10%)的植物种子得到收集和保存，目前已收集保存了全英国95%的植物种质资源，并与澳大利亚、埃及、肯尼亚、南非等12个国家开展了合作，收集以干早地区为主的植物种质资源，计划到2025年完成收集保存全球万种植物(约占1000)种质资源的目标。第一节 概 述n 我国是植物种质资源丰富的国家，植物种质设施保存工作近几年也有较大的发展，我国也已有一些科研单位建立了一批大、中、小型种质基因库。特别是在农作物品种资源保存方面已初步形成体系，中国农科院在1984年和1986年分两期在北京建立了一座较

7、大型的国家农作物种质库，包括一座长期库和一座中期库，而于90年代初又在青海建立了一个“复份库”，至2000年，已保存了33万份材料。第一节 概 述n 但是，我国的林木及野生植物种质资源设施保存仍处于起步阶段，中科院于1996年在西双版纳热带植物园建立了一个小型的热带濒危植物种质库，其实施保存的种质范围仅限于热带地区的濒危植物;中国林科院于2001年建成了一座小型低温库，目前保存了我国部分主要造林树种的种质资源，尚未完成抢救保存任务，离全面保存我国森林植物的种质资源目标相去甚远。目前，中国林科院牵头的国家森林植物种质低温库正处于筹建当中，该库能够容纳30万份以上的林木种质，该库的建成将完成抢救保

8、存林木种质资源的任务。第一节 概 述 n一、植物种质资源低温保存意义n防止资源灭绝n节约人力物力n便于交流第一节 概 述n二、超低温保存的概念n一般来说，低温所涉及的温度范围是不确定的。习惯上，人们将80以下的低温称为超低温，干冰温度（70）称为极低温，低温则从4往下推（李广武等，1998）。对植物而言，低温常常是指那些比常温稍低一些的温度。如果低温超过细胞原生质所能忍受的临界温度，就会致使植物细胞遭受冻害而死亡。如甜橙树发生冻害的临界温度通常在6.5，枳壳通常在20左右（沈德绪等，1986）。第一节 概 述n目前常用的超低温保存方法可分为两类，即冷冻诱导保护性脱水的超低温保存和玻璃化处理的超

9、低温保存。在超低温条件下，生物的代谢和衰老过程大大减慢，甚至完全停止，因此可以长期保存植物材料。第一节 概 述n三、超低温保存的研究概况n1超低温保存技术的发展种质材料的超低温保存，传统的技术有干冻法、预冻法和两步法，上世纪80年代末和90个代初玻璃化法和包埋脱水法开始应用于植物材料的超低温保存。第一节 概 述n2用于离体超低温保存的植物材料超低温保存技术在保存植物花粉、种子和胚、芽、茎尖、胚状体、原生质体、愈伤组织和悬浮细胞等方面有应用和报道。第一节 概 述n3超低温保存的植物种类目前主要应用在作物、果树和园林花卉种质资源保存方面，林木种质资源的超低温保存也有少量报道。超低温保存已涉及到不同

10、的植物种类，如野生及人工创造的谷类、豆类、薯类、油类、糖类、纤维类、蔬菜类、果树、树木、药用植物和藻类等。第二节 植物材料超低温冻存的细胞学基础 n一、细胞内外水的冻结状态是细胞冻存技术的关键植物细胞中含有大量的水分，约占细胞总重量的6090。细胞中的水是由游离水和束缚水组成，其中游离水约占90，很容易冻结。由于细胞内含有复杂的化合物，细胞内的溶液并不象纯水那样在0左右结冰。第二节 植物材料超低温冻存的细胞学基础n理论上讲，细胞外水的冻结温度为515，细胞内游离水的冻结在25。30 时，细胞几乎没有非冻结状态的游离水存在，而结合水在100温度下也不冻结。根据Luyet的冻结理论（Luyet 1

11、937），细胞游离水的冻结温度（30）可被认为是细胞冻存的安全温度，因而细胞冻存的两步冻结法是以30为基础的。n控制细胞内外水的冻结状态是细胞冻存技术的关键。第二节 植物材料超低温冻存的细胞学基础n二、植物细胞超低温保存过程中的致死损伤n细胞超低温保存有三个重要操作步骤：一是细胞预冻；n二是细胞在196下长期贮存；n三是细胞解冻。第二节 植物材料超低温冻存的细胞学基础n植物超低温保存技术建立在生物细胞冻害和抗冻机理的基础之上。种质超低温保存成功的关键，在于降温冰冻过程中避免细胞内结冰。为此，针对不同种类的植物材料，筛选适合的冰冻保护剂，采用适当的降温冰冻速度和化冻方式，可能使细胞不受损伤或使损

12、伤减小到最低程度。第三节 超低温保存的方法 n超低温保存植物种质资源的程序包括下面几个步聚：n(1)前培养前培养:对培养体短期的生长锻炼处理，使其提高耐液氮保存的能力。n(2)防冻防冻:培养体放人防冻液中，使其细胞降低冰点，减少因形成冰晶可能造成的损伤。n(3)变温冷冻变温冷冻:按照不同变温模式降温冷冻，降温速度依不同种质材料采用特定的速度。第三节 超低温保存的方法n(4)超低温保存超低温保存:将冷冻材料保存到有效低温环境中，以防止冰的游移或解体。n(5)解冻解冻:一般认为快速解冻更好。从液氮环境中取出封装好的材料，与其容器一同放人+40的无菌水浴中，直到解冻后才回到室温下，未封装的材料放到2

13、0-30的液体培养基中解冻。n(6)生命力测定生命力测定:如用TTC染色法等。第三节 超低温保存的方法n一、传统的降温冰冻方法n1快速冰冻法2慢速冰冻法3两步法4逐级冰冻法第三节 超低温保存的方法n二、玻璃化保存方法n玻璃化（vitrification）是指液体转变为非晶体（玻璃态）的固化过程。使溶液玻璃化有两条途径：一是大幅度提高冷却速率；n二是增加溶液浓度。第三节 超低温保存的方法n1玻璃化法是将生物材料经极高浓度的玻璃化溶液快速脱水后，直接投入液氮，使生物材料连同玻璃化溶液发生玻璃化转变，进入玻璃态。此间水分子没有发生重排，不形成冰晶，也不产生结构和体积的改变，因而不会对材料造成伤害。保

14、存终止后，复温时要快速化冻，防止去玻璃化的发生。材料能安全度过冷却和化冻两个关口，就可保证冻存的成功。第三节 超低温保存的方法n2包埋玻璃化法是包埋脱水法和玻璃化法的结合。保存材料先用藻酸钙包埋，然后经蔗糖浓度梯度脱水和玻璃化溶液处理后直接浸入液氮保存，其材料存活率比用包埋脱水法要高，可能是藻酸钙包埋后减轻了玻璃化溶液的毒性。第三节 超低温保存的方法n三、其它超低温冻存方法n1干冻法（desiccation）利用无菌空气流、干燥硅胶或饱和溶液表面的气相等对种质材料进行脱水处理，然后快速将其投人液氮贮存。n2预培养法（pregrowth）也叫预冻法:将种质材料在添加保护剂(如蔗糖、二甲亚矾、甘油

15、等)后置于低温冰箱或液氮蒸汽箱(-10-700C)中冰冻若干小时后投人液氮贮存。第三节 超低温保存的方法n3预培养-干燥法(pregrowth-desiccation)也叫两步法，种质材料在添加保护剂后，用程序降温仪以某个速率(每分钟0.10.50C)降温至转移温度(4070 0C)，然后投人液氮中贮存，两步法较预冻法更为严格。n4包埋脱水法（encapsulation-dehydration）茎尖、分生组织和体细胞胚等种质材料用褐藻酸钙包埋后，第一阶段先在含高浓度蔗糖的培养基中脱水，第二阶段用无菌空气流或干燥硅胶脱水，然后投人液氮贮存。第四节 影响超低温保存效果的主要因素 n一、材料的基本特

16、性材料的基本特性包括植物的基因型、抗冻性及器官、组织和细胞的年龄以及生理状态。不同基因型的植物离体材料对超低温冻存的反应各不相同。第四节 影响超低温保存效果的主要因素n二、预培养和低温锻炼预处理对于调整植物离体材料的生理状态非常有效。通过预处理的植物材料，减少了细胞内自由水的含量，使细胞能经受低温胁迫，减少或避免了冷冻伤害，可大大提高材料的抗冻力。第四节 影响超低温保存效果的主要因素n三、冰冻保护剂的应用一般的生物体在没有添加冰冻保护剂的情况下经历低温后是很难存活下来的。所以，生物体的低温保存离不开冰冻保护剂（cryoprotective agent，CPA）。冰冻保护剂也称作抗冻剂，合理地选

17、择冰冻保护剂，对低温保存至关重要。第四节 影响超低温保存效果的主要因素n冰冻保护剂应具有以下特点：易溶于水，对细胞无毒，容易从组织细胞中清除。冰冻保护剂的作用主要表现在增加膜透性，加速细胞内的水流到细胞外结冰，稳定细胞膜结构，阻止低温伤害，降低冰点，提高溶液的粘滞性，阻止冰晶生长。第四节 影响超低温保存效果的主要因素n渗透型冰冻保护剂：多属低分子中性物质，在溶液中易结合水分子，发生水合作用，使溶液的粘性增加，从而弱化了水的结晶过程，达到保护的目的。常用的渗透型冰冻保护剂有：甘油、二甲亚砜（DMSO）、乙二醇（EG）、乙酰胺、丙二醇（PG）等。但渗透型冰冻保护剂使用浓度、渗入细胞的能力、对水分子

18、活性的影响等各不相同，如甘油适宜于慢速冷却，而DMSO却易于渗入细胞，并在常温下稍有毒性。第四节 影响超低温保存效果的主要因素n非渗透型冰冻保护剂：能溶于水，但不能进入细胞，它使溶液呈过冷状态，可在特定温度下降低溶质（电解质）浓度，从而起到保护作用。非渗透型冰冻保护剂主要有：聚乙烯吡咯烷酮（polyvingyl pyrollidone，PVP）、蔗糖（sucrose）、葡聚糖（右旋糖酐，dextrane）、聚乙二醇（polyethylene glycol，PEG）、白蛋白（albumin）、羟乙基淀粉（hydroxyethyl starch，HES）等。此类冰冻保护剂对快速、慢速冷却均有保护效

19、果。第四节 影响超低温保存效果的主要因素n四、化冻方法n液泡小、含水量少的细胞（如茎尖分生组织），可采用快速化冻的方法。液泡大、含水量高的细胞则一般需要采用慢速化冻法。n生长季节中的材料，一般在3740温水浴中快速化冻比在室温下慢速化冻要好。n木本植物的冬芽，在超低温保存后，必须在0低温下进行慢速化冻才能达到良好的效果。n玻璃化冻存的材料在保存终止后，要求快速化冻，以防止由于次生结冰对组织细胞造成的伤害。第四节 影响超低温保存效果的主要因素n五、再培养经冻存的材料会不可避免地受到不同程度的伤害。为了减少再培养中的光抑制，利于离体材料恢复生长，冻存的材料一般在黑暗或弱光下培养12周，再转入正常光

20、下培养。再培养所用的培养基一般是与保存前的相同，但有时需将大量元素或琼脂含量减半，有时则在培养基中附加一定量的PVP、水解酪蛋白等成分以利于生长的恢复。第五节 超低温保存过程中的遗传变异及其检测技术n无论哪种种质资源的保存方法都是以保持物种原有的遗传特性为出发点。在超低温保存过程中，植物材料是否发生变异是育种工作者十分关心的问题。在超低温保存之前，外植体材料、培养继代时间、培养基成分以及自然突变等因素都可能影响到保存材料的遗传稳定性。第五节 超低温保存过程中的遗传变异及其检测技术n为了掌握超低温保存材料的遗传变异情况，有必要在保存材料的恢复和再生阶段建立有效的检测体系。目前，形态学观察、细胞学

21、方法、同功酶、分子标记如RFLP和RAPD等检测方法常常单独或结合起来用于遗传变异分析。小结与展望n自从人们认识到植物种质资源保存的重要意义之后，已从不同的角度，不同的层次对此问题展开了研究。近几十年来取得了不少进展，但均因其本身的局限性或技术上的不成熟，而在实际应用中受到极大的限制。传统的建立种质库、常规的低温保存或利用组织培养技术保存植物体的某一部分，均因其保存过程繁杂、保存下来的材料不稳定、需耗费大量的人力物力等原因而受到限制。小结与展望n相对而言，超低温保存却显示了其广阔前景。超低温保存材料的生理代谢可以得到最有效的控制，生活力下降和基因特异性丧失的可能性可降至最低限度，病原微生物的活动可受到足够抑制。超低温保存技术可以保护重要而稀有的基因型，保存无病材料，保持愈伤组织和细胞系的特殊生化能力，降低代谢、延迟衰老，保持形态发生潜能等。小结与展望n作为一种新颖的种质资源保存方法，它克服了其它保存方法的很多不足，但也存在涉及的试验材料面窄，长期连续使用冻存材料的再生能力衰退，组织培养后代遗传稳定性仍未解决(茎尖生长点有可能解决这一问题)等问题。