法医学与DNA图谱技术及应用课件.ppt

1、第十一章法醫學與DNA圖譜技術及應用前言自年代後期，蛋白質的多型性已被用來偵測個體之間的遺傳差異。使用這些蛋白質標誌最主要的問題是這些標誌因其有限的變異性，故有使用上的極限。當這些蛋白質標誌被用在法醫學上的判斷時，主要是用以排除某位疑犯的可能性，而非確認其有犯罪。因為，確認二個檢體相異的機率遠高於確認二個檢體是來自同一個人的機率。衛星DNAv重 複 序 列 D N Av微衛星體v迷你衛星體v巨衛星體圖重複序列DNA二種主要重複序列DNA已被鑑定：縱排重複序列的衛星DNA約佔人類基因體的散佈性重複序列DNA約佔人類基因體的衛星DNA只存於真核生物，功能是在減數分裂時，染色體可經由這些同源互補的序

2、列，配對在一起以及造成DNA重組的位置。變數縱排重複序列依長度分為：微衛星體(microsatellite)、迷你衛星體(minisatellites)、巨衛星體(macrosatellite)。表微衛星體微衛星體是簡單重複序列或短縱向重複片段(STR)，在個體間存在著極大重複次數的差異。FBI就是利用13組充分了解的短縱向重複片段來進行DNA指紋圖譜鑑定。現今短縱向重複片段檢測幾乎已包含在所有法醫學的檢測當中。迷你衛星體迷你衛星基因座共計約數千個，每個基因座有一明顯的重複單位。這些序列被使用發現散佈在整個基因體的迷你衛星體長度多型性，用於產生DNA指紋。巨衛星體這些DNA序列是非常大的，長度

3、約百萬氮鹼基，其長度使這些DNAs易被破壞或斷裂，因為大部分法醫學檢體之DNA都有斷裂的現象，因些巨衛星體不能在法醫工作中使用。族群遺傳學與對偶基因族群裏的對偶基因多型性是由隨機遺傳漂移或自然選擇所維持。當帶有基因多型性DNA圖譜組合存在之頻率被評估超過在族群中發現之頻率的時候，DNA圖譜是個人化且具壓倒性的鑑別工具。多重基因座迷你衛星體之變數縱排重複序列多基因座指紋圖譜的特色為：通常有大量的DNA條帶產生 DNA不完全切割檢體DNA分解 DNA萃取回收率低檢體有時會混雜到其他人的DNA圖圖圖單一基因座微衛星體之變數縱排重複序列現今大多用聚合酶連鎖反應(PCR)來分析變數縱排重複序列圖譜。為了

4、要產生帶有一個多基因座探針的差異性圖譜，至少需四或五個單一基因座PCR引子被使用。圖圖表限制片段長度多形性若對偶基因為異時，稱該基因為異型合子(heterozygous)。有時變異會影響限制酶切割的部位，即原有的切割序列，因為變異而消失，或新的限制酶切割位置可能產生。因此基於序列上的不同而導致有不同的切割點，造成不同大小的限制酶切割片斷，即稱限制片段長度多形性RFLPs(restriction fragment length polymorphisms)。DNA圖譜分析法DNA圖譜的作用是排除特別的嫌疑犯或決定從犯罪現場所收集之樣本和自嫌犯身上收集之樣本之間的匹配機率。DNA圖譜技術之考量重點

5、需要標準化的程序來確保DNA圖譜的再現性：保護DNA完整性是必要的直到完全被限制酶分解標準化雜交法選擇已經被證明有用的適當探針有那些錯誤可能會產生：樣本污染DNA降解位於光軟片上那些困難解釋的條帶與人 為誤差條帶會提供錯誤的訊息比對統計上的錯誤解釋圖圖圖DNA思考重點思考重點qDNA的品質q樣品的量q污染q檢體採集q檢體保存DNA限制酶分解思考重點思考重點vDNA限制酶分解不完全v甲基化DNAv不是最佳的限制酶分解條件凝膠電泳思考重點思考重點v電泳膠體的選擇v瓊脂及聚丙烯硫胺凝膠的濃度v電泳分離時的電壓選擇v緩衝液種類及濃度的選擇v膠體的厚度v注入樣品槽在膠體的位置v施放DNA時是否溢出vDN

6、A注入樣品槽時的濃度探針選擇思考重點思考重點v探 針 核 酸 序 列 的 專 一 性v檢體DNA的品質聚合酶連鎖反應PCR的極端靈敏度使交叉污染成為一個非常嚴重的問題。極微小量的污染DNA，可能來自組織、液體、細菌和實驗室設備。在某些條件下，法院收集樣品時易造成交叉污染。污染的附加條帶將會是可見且可能混淆、毀壞結果的。因此小心選擇適當的操作條件及步驟、使用污染防治控制，將使報告書中的交叉污染被識別出來。數位化DNA分型迷你衛星體重複序列是很適合進行數位化資料的DNA型式。迷你衛星重複序列或圖譜，不以特定基因座的重複單位之數目為基礎，而以基因座裏面的限制酶作用序列上的變化為基礎。族群分析法醫學分

7、析的最大挑戰包括：藉著與一個參考族群計算比較其一致性的分配率。適當參考族群的組成有爭論，如何決定用哪些計算標準，來組成一個有用的參考族群。法庭上科學證據的認定及許可DNA圖譜證據必須通過Frye或Daubert準則驗證才能使用，包含了分析DNA的操作步驟及可能性的評估。辯方律師通常會要求開庭前聽證會，來確認進行DNA分析之公司分析能力的正確性及可靠性。DNA分析技術本身已經無數次驗證，目前能拒絕DNA證據的因素只有：採集DNA證物的方法及合法性是否有污染的可能性在統計學上配對機率的高低弗萊準則當法院決定要認可一個專家的證據時，其必來自於一個充分了解及已建立的科學理論或發現。而這個科學性的理論或

8、發現必須在它的專業領域中被普遍的接受及認可普遍的接受及認可。弗萊準則測試是用來避免陪審團，因不可靠的實驗程序或證據的呈現而誤導。道伯爾特準則科學專家所提出的假說是否可被試驗？這個理論或方法是否已經有提供給同等地位的科學家覆審及公開發表？這個方法的已知或潛在錯誤比率為何？有多高？這些專家的地位及品質如何？他們的才能在這個專業科學社群中是如何？是否這個方法須要仰賴特殊的技能或儀器設備，以及是否這個結果可以由其他的專業人士重複進行？是否這個方法或結果能解釋給法官及陪審團充分了解，進而評估這個結果？DNA資料庫DNA資料庫收集了什麼？鑑別資料庫包括描述個人訊息，例如：物理特性（眼睛顏色、身高、體重）、

9、指紋、牙齒紀錄和遺傳特色，如血型和主要組織相容性複合體等資料。政府已使用這個訊息鑑定失蹤人口或甚至罪犯。其他的DNA圖譜分析法及其應用q逢 機 增 幅 多 形 性 D N Aq增 幅 片 段 長 度 多 型 性 技 術q單股構象多形性q單一核苷酸多形性q粒 線 體 D N A 及 Y 染 色 體圖圖單股構象多形性單股構象多形性(SSCP)的特點如下：單股DNA的移動，取決於同一分子間鹼基配對而定。確切的DNA多型性序列或位置可能不清楚，但可由單股構象多形性(SSCP)中分子移動位置的不同來反映出DNA的多型性。大多數SSCP分析法是用來分析單一基因座(Loci)。SSCP是很有用的技術用來偵測

10、族群中個體基因上的多樣性、染色體DNA上的突變及尋找基因的分子標記(Molecular Markers)。單一核苷酸多形性可應用於：在族群中基因型的變異是如何對疾病表現型造成差異、生態研究的應用、演化生物學、利用生物資訊學中資訊探索分析而發展的單一核苷酸多形性資料庫、藥物基因體學。粒線體DNA及Y染色體由粒線體DNA的資料顯示，所有不同的粒線體DNA序列在171,500年前都歸屬於同一個原始女性，這個拼湊而成的被稱為粒線體的夏娃。代表男性的染色體記錄了父系遺傳的演化史，如同粒線體的夏娃般，染色體亞當也可以追溯到35,00090,000年前的某個原始人男性。法醫考古學用來鑑定未知個體的身份研究人類或動物的演化追蹤人類或動物的遷移追蹤全球不同民族群落的起源及親緣相關性鑑別古老遺骸中個體之家族親緣相關性