黄曲霉毒素的检测教材课件.pptx

1、真菌毒素简介真菌毒素简介1黄曲霉毒素的检测意义黄曲霉毒素的检测意义2黄曲霉毒素的种类及性质黄曲霉毒素的种类及性质3现有检测方法介绍现有检测方法介绍4中药黄曲霉毒素检测药典收载状况中药黄曲霉毒素检测药典收载状况5药典检测方法详解药典检测方法详解6 安全防护措施安全防护措施7中药中黄曲霉毒素检测方法研究中药中黄曲霉毒素检测方法研究真菌毒素简介真菌毒素简介n是真菌在适宜的环境条件下，在食品或饲料里生长所产生的代谢产物，对人类和动物都有害真菌毒素简介真菌毒素简介毒素名称毒素名称 毒素来源毒素来源 毒性毒性 黄曲霉毒素（常见毒素）黄曲霉、寄生曲霉等肝毒性黄绿青霉毒素 黄绿青霉 神经毒性橘青霉毒素橘青霉肾

2、毒性黄天精和环氯素岛青霉肝毒性T2毒素拟分枝镰刀菌和梨孢镰刀菌心衰、出血黄曲霉毒素的起源黄曲霉毒素的起源 第一次发现黄曲霉毒素的起源事件：第一次发现黄曲霉毒素的起源事件：1960年，英国发现有10万只火鸡死于一种以前没见过的病，被称为“火鸡X病”，主要症状为食欲减退，羽翼下垂，染病后昏睡死亡，死时头脚向后伸。解剖可见肝出血、坏死，肾肿大。再后来鸭子也被波及。追根溯源，最大的嫌疑是饲料。这些可怜的火鸡和鸭子吃的是花生饼。花生饼是花生榨油之后剩下的残渣，富含蛋白质，是很好的禽畜饲料。科学家们很快从花生饼中找到了罪魁祸首，一种真菌产生的毒素。它被命名为“aflatoxin”，就是现在所说的黄曲霉毒素

3、。黄曲霉毒素黄曲霉毒素点击录入内容点击录入内容点击录入内容点击录入内容显微镜下的黄曲霉黄曲霉毒素的检测意义黄曲霉毒素的检测意义 n毒性极强毒性极强1993年黄曲霉毒素被世界卫生组织（WHO）的癌症研究机构划定为类致癌物，是一种毒性极强的剧毒物质，仅次肉毒霉素，是目前已知霉菌中毒性最强的。黄曲霉毒素的检测意义黄曲霉毒素的检测意义 n毒性极强毒性极强急性毒性急性毒性：比氰化钾大10倍，比砒霜大68倍。慢性毒性慢性毒性：肝脏损害，呈急性肝炎、出血性坏死、肝细胞脂肪变性和胆管增生。脾脏和胰脏也有轻度的病变。基本结构：二呋喃环和香豆素,B1是二氢呋喃氧杂萘邻酮的衍生物.假阳性及假阴性的排除：多种方法比较

4、，随行空白，液质联用，关闭衍生器黄曲霉毒素的检测意义黄曲霉毒素化学结构式即含有一个双呋喃环和一个氧杂萘邻酮（香豆素）.未查到具体品种规定是否有变化中药样品种类多，基质各异，成分复杂，提取困难注意点：澄清、含醇量、pH、流速、脱水黄曲霉毒素化学结构式3 ug/ml）梯度稀释500倍。黄曲霉毒素危害极大，应引起重视这些可怜的火鸡和鸭子吃的是花生饼。历年中国药典标准收载状况增订了另一种衍生方法：即光化学衍生法黄曲霉毒素的种类及性质基本结构：二呋喃环和香豆素,B1是二氢呋喃氧杂萘邻酮的衍生物.黄曲霉毒素的种类及性质液相条件：C18，甲醇-乙腈-水（40:18:42）液相条件：C18，甲醇-乙腈-水（4

5、0:18:42）黄曲霉毒素的种类及性质黄曲霉毒素的检测意义黄曲霉毒素的检测意义 n存在极其广泛存在极其广泛主要存在于土壤，动植物及各种坚果中。家庭自制发酵食品等也经常发现黄曲霉毒素。一般在热带和亚热带地区，食品中黄曲霉毒素的检出率比较高。未能及时晒干或储藏不当的粮食容易产生，在农作物正常的生长期中也可以形成。黄曲霉毒素的检测意义黄曲霉毒素的检测意义n存在极其广泛存在极其广泛中药中容易产生黄曲霉毒素的有：种子、果实、粮谷类中药材或含此类药材的中成药；发酵类中药；贮存期中药材、中成药;油性成分多的中药材欧盟欧盟（g/kg）德国德国（g/kg）中国香港中国香港（g/kg）中国（中国（g/kg）黄曲霉

6、毒素黄曲霉毒素Alfatoxin B1食用花生食用花生 8，食用坚果、玉米、调味品食用坚果、玉米、调味品 5，食用干制水果及其制品食用干制水果及其制品 2，生乳、热处理牛奶，婴幼儿食生乳、热处理牛奶，婴幼儿食品品 0.1，婴幼儿奶粉婴幼儿奶粉 0.1，婴幼儿食疗食品婴幼儿食疗食品0.1.药材药材 2药材药材 5玉米、花生及其制品玉米、花生及其制品 20，大米、植物油大米、植物油 10，其他粮食、豆类、发酵食品其他粮食、豆类、发酵食品 5，婴幼儿配方食品婴幼儿配方食品 5.药材药材 5黄曲霉毒素黄曲霉毒素AlfatoxinsB1,B2,G1,G2食用坚果、玉米、调味品食用坚果、玉米、调味品 10

7、，食用干制水果及其制品食用干制水果及其制品 4.药材药材 4药材药材 10药材药材 10黄曲霉毒素的检测意义黄曲霉毒素的检测意义n国际上对中药材中黄曲霉毒素的检测越来越多国际上对中药材中黄曲霉毒素的检测越来越多黄曲霉毒素的种类及性质黄曲霉毒素的种类及性质 根据在紫外线照射下产生荧光颜色的不同，分为B族和G族两大类及其衍生物ACCD PPTB族：蓝色荧光1G族：黄绿色荧光212黄曲霉毒素的种类及性质黄曲霉毒素的种类及性质n生长温度生长温度最低6-8，最高达44-46，32时黄曲霉毒素B1的产量最高。黄曲霉毒素的种类及性质黄曲霉毒素的种类及性质n化学结构化学结构结构类似结构类似，目前发现约20余种

8、，已分离鉴定出12种：B1,B2,G1,G2,M1,M2,P1,Q,H1,GM,B2a和毒醇.基本结构基本结构：二呋喃环和香豆素,B1是二氢呋喃氧杂萘邻酮的衍生物.即含有一个双呋喃环和一个氧杂萘邻酮（香豆素）.前者为基本毒性结构，后者与致癌有关.黄曲霉毒素的种类及性质黄曲霉毒素的种类及性质n化学结构化学结构B1,B2,G1,G2,M1,M2M1是B1在体内经过羟化而衍生成的代谢产物M1、M2主要存在于牛奶中B1：最常见、毒性及致癌性最强黄曲霉毒素化学结构式 黄曲霉毒素化学结构式 黄曲霉毒素化学结构式 理化性质理化性质相对分子量为312-346难溶于水、易溶于油，甲醇、丙酮和氯仿等有机溶剂，但不

9、溶于石油醚、己烷和乙醚中中性溶液及弱酸性溶液中较稳定，强酸性溶液中稍有分解，强碱溶液中分解迅速纯品为无色结晶.在紫外光灯下，B1、B2发蓝色荧光，G1、G2发绿色荧光耐高温，一般烹调温度不能破坏，B1的分解温度为268紫外线对低浓度黄曲霉毒素有一定的破坏性黄曲霉毒素现有检测方法介绍黄曲霉毒素现有检测方法介绍n薄层层析法薄层层析法：灵敏度低，定量困难nHPLC-紫外检测法紫外检测法：不衍生，灵敏度低，采用UPLC可以增强灵敏度nHPLC-荧光检测法荧光检测法：需衍生，灵敏度高（目前药典采用此法）黄曲霉毒素现有检测方法介绍黄曲霉毒素现有检测方法介绍n免疫化学分析方法免疫化学分析方法 酶联免疫吸附法

10、：快速、简便、单一毒素、假阳性多免疫亲和柱-荧光分光光度法：高效、无毒、假阳性多微柱筛选法：半定量，测总量一步式黄曲霉毒素检测金标试纸法：快速、现场大批量初筛nHPLC/MS/MS：不衍生，灵敏度高，假阳性少，成本高LC-MS/MSLC-MS/MSHPLCHPLCTLCTLCGCGC色谱学方法色谱学方法黄曲霉毒素现有检测方法介绍黄曲霉毒素现有检测方法介绍即含有一个双呋喃环和一个氧杂萘邻酮（香豆素）.食用坚果、玉米、调味品 10，黄曲霉毒素的种类及性质黄曲霉毒素药典检测方法详解Alfatoxin B1HPLC-荧光检测法：需衍生，灵敏度高（目前药典采用此法）黄曲霉毒素标准品禁用固体黄曲霉毒素在样

11、品中分布不均匀历年中国药典标准收载状况柱后衍生、HPLC检测附录：第一次增加了黄曲霉毒素测定法慢性毒性：肝脏损害，呈急性肝炎、出血性坏死、肝细胞脂肪变性和胆管增生。黄曲霉毒素的检测意义免疫亲和柱-荧光分光光度法：高效、无毒、假阳性多衍生方式：柱后碘衍生、柱后光化学衍生。9305 中药中真菌毒素测定指导原则衍生方式：柱后碘衍生、柱后光化学衍生。正文：僵蚕、陈皮、酸枣仁、桃仁、胖大海品种项下增加了黄曲霉毒素残留量检查前者为基本毒性结构，后者与致癌有关.黄曲霉毒素检测主要设备滤过:普通滤纸有吸附，可采用玻璃纤维滤纸或离心免疫学方法免疫学方法ELISA胶体金黄曲霉毒素现有检测方法介绍黄曲霉毒素现有检测

12、方法介绍n2005年增补本年增补本附录附录：第一次增加了黄曲霉毒素测定法历年中国药典标准收载状况历年中国药典标准收载状况 n2010年版一部年版一部正文：正文：僵蚕、陈皮、酸枣仁、桃仁、胖大海品种项下增加了黄曲霉毒素残留量检查附录：附录：继续收载了黄曲霉毒素测定法历年中国药典标准收载状况历年中国药典标准收载状况 历年中国药典标准收载状况历年中国药典标准收载状况 n 2010年版一部第二增补本年版一部第二增补本：修订了附录方法 删除了流速规定 增订了另一种衍生方法：即光化学衍生法 取消了免疫亲和柱的品牌规定n2015年版总则草案年版总则草案历年中国药典标准收载状况历年中国药典标准收载状况 增加了

13、第二法：增加了第二法：高效液相色谱-串联质谱法附注附注：当测定结果超出限度时,采用第二法进行确认2351 黄曲霉毒素测定法黄曲霉毒素测定法n2015年版总则草案年版总则草案历年中国药典标准收载状况历年中国药典标准收载状况 粮谷类、种子类、油性成分多的品种应注意黄曲霉毒素的检测处方中含有易污染的药材以及生粉投料的中成药品种应注意相关真菌毒素的检测9305 中药中真菌毒素测定指导原则中药中真菌毒素测定指导原则n2015年版总则草案年版总则草案历年中国药典标准收载状况历年中国药典标准收载状况 根据具体品种和具体污染状况，参考相关品种国外药典和各国、各国际组织相关限量标准等规定，尽可能控制在最低范围内

14、B1 限量和 B1、B2、G1、G2 总和的限量9302 中药有害残留物限量制定中药有害残留物限量制定 指导原则指导原则即含有一个双呋喃环和一个氧杂萘邻酮（香豆素）.贮存期中药材、中成药;油性成分多的中药材微柱筛选法：半定量，测总量急性毒性：比氰化钾大10倍，比砒霜大68倍。黄曲霉毒素的检测意义黄曲霉毒素的种类及性质它被命名为“aflatoxin”，就是现在所说的黄曲霉毒素。薄层层析法：灵敏度低，定量困难9305 中药中真菌毒素测定指导原则HPLC-荧光检测法：需衍生，灵敏度高（目前药典采用此法）基本结构：二呋喃环和香豆素,B1是二氢呋喃氧杂萘邻酮的衍生物.黄曲霉毒素的种类及性质荧光检测器，激

15、发波长=360nm(或 365nm)，发射波长=450nm采用免疫亲和柱，柱子是用大剂量的黄曲霉毒素单克隆抗体固化在水不溶性的载体上然后装柱而成提取：方式可比较后选择黄曲霉毒素的种类及性质即含有一个双呋喃环和一个氧杂萘邻酮（香豆素）.食用坚果、玉米、调味品 5，紫外线对低浓度黄曲霉毒素有一定的破坏性即含有一个双呋喃环和一个氧杂萘邻酮（香豆素）.历年中国药典标准收载状况历年中国药典标准收载状况 n2015年版正文年版正文未查到具体品种规定是否有变化黄曲霉毒素药典检测方法详解黄曲霉毒素药典检测方法详解n 液相条件：C18，甲醇-乙腈-水（40:18:42）n 衍生方式：柱后碘衍生、柱后光化学衍生。

16、n 混合对照品溶液的制备：液体标液（B1B2G1G2=10.310.3 ug/ml）梯度稀释500倍。n 供试品溶液的制备：15g粉末，3gNaCl，70%甲醇提取，免疫亲和柱纯化。n 测定：吸取混合对照品溶液5l、10l、15l、20l、25l，注入色谱仪，绘制标准曲线。吸取供试品溶液20-25l，测定。中药中黄曲霉毒素药典检测方法详解中药中黄曲霉毒素药典检测方法详解 n方法来源方法来源：中国药典2010年版第二增补本附录 V 黄曲霉毒素测定法 n基本步骤基本步骤提取过柱洗脱测定样品前处理样品前处理免疫亲和柱免疫亲和柱纯化纯化柱后衍生、柱后衍生、HPLC检测检测上样上样洗涤洗涤洗脱洗脱检测流

17、程检测流程提取提取过滤除杂过滤除杂稀释稀释黄曲霉毒素检测主要设备气孔操作架免疫亲和柱黄曲霉毒素检测主要设备气孔操作架免亲和柱急性毒性：比氰化钾大10倍，比砒霜大68倍。食用干制水果及其制品 4.清洗，将杂质冲洗干净黄曲霉毒素在样品中分布不均匀黄曲霉毒素检测主要设备修订了附录方法耐高温，一般烹调温度不能破坏，B1的分解温度为268黄曲霉毒素检测主要设备贮存期中药材、中成药;油性成分多的中药材贮存期中药材、中成药;油性成分多的中药材M1是B1在体内经过羟化而衍生成的代谢产物9305 中药中真菌毒素测定指导原则难溶于水、易溶于油，甲醇、丙酮和氯仿等有机溶剂，但不溶于石油醚、己烷和乙醚中3 ug/ml

18、）梯度稀释500倍。这些可怜的火鸡和鸭子吃的是花生饼。注意点：澄清、含醇量、pH、流速、脱水难溶于水、易溶于油，甲醇、丙酮和氯仿等有机溶剂，但不溶于石油醚、己烷和乙醚中HPLC-荧光检测法：需衍生，灵敏度高（目前药典采用此法）黄曲霉毒素检测主要设备取消了免疫亲和柱的品牌规定黄曲霉毒素检测主要设备HPLC-荧光检测器光化学衍生器黄曲霉毒素检测主要设备免疫亲和柱IAC洗脱，将结合在抗体上的待测物冲洗下来进入仪器检测 上样，载体上的抗体结合样品中的待测物清洗，将杂质冲洗干净抗待测物（半抗原）抗体待测物（半抗原）无关杂质固相载体（凝胶）免疫亲和柱的原理免疫亲和柱的原理用大剂量的黄曲霉毒素单克隆抗体固化

19、在水不溶性的载体上然后装柱而成方法详解方法详解n操作中可能出现的问题及注意点操作中可能出现的问题及注意点对照品溶液的配制 取样：混匀，严格按要求取样，要有代表性提取：方式可比较后选择滤过:普通滤纸有吸附，可采用玻璃纤维滤纸或离心方法详解方法详解n操作中可能出现的问题及注意点操作中可能出现的问题及注意点净化和富集净化和富集采用免疫亲和柱，柱子是用大剂量的黄曲霉毒素单克隆抗体固化在水不溶性的载体上然后装柱而成原理：抗原、抗体反应，注意点：澄清、含醇量、pH、流速、脱水 n其它注意事项：其它注意事项：亲和柱储存、使用温度，接头、容器洗涤方法详解方法详解黄曲霉毒素标液supelco黄曲霉毒素的衍生化黄

20、曲霉毒素的衍生化n衍生原因衍生原因 B1、G1荧光遇水要淬灭，检测前需要衍生化n药典附录收载的两种衍生方法药典附录收载的两种衍生方法碘衍生法：碘作为衍生剂，对衍生温度有要求，试剂对仪器有腐蚀性，需要冲洗。光化学衍生法：紫外光灯（254）nm照射，操作简单，对衍生温度无要求，无需冲洗衍生原理衍生原理AFB1AFG1黄曲霉毒素的衍生化黄曲霉毒素的衍生化紫外光灯照射紫外光灯照射 增强B1、G1的荧光强度。黄曲霉毒素的衍生化黄曲霉毒素的衍生化黄曲霉毒素的检测n荧光检测器荧光检测器，激发波长=360nm(或 365nm)，发射波长=450nm n灵敏度高灵敏度高，可用于痕量检测9305 中药中真菌毒素测

21、定指导原则黄曲霉毒素化学结构式增订了另一种衍生方法：即光化学衍生法黄曲霉毒素检测主要设备黄曲霉毒素危害极大，应引起重视急性毒性：比氰化钾大10倍，比砒霜大68倍。B1、G1荧光遇水要淬灭，检测前需要衍生化洗脱，将结合在抗体上的待测物冲洗下来进入仪器检测2351 黄曲霉毒素测定法贮存期中药材、中成药;油性成分多的中药材难溶于水、易溶于油，甲醇、丙酮和氯仿等有机溶剂，但不溶于石油醚、己烷和乙醚中B1、G1荧光遇水要淬灭，检测前需要衍生化贮存期中药材、中成药;油性成分多的中药材食用坚果、玉米、调味品 10，拟分枝镰刀菌和梨孢镰刀菌相对分子量为312-346用大剂量的黄曲霉毒素单克隆抗体固化在水不溶性

22、的载体上然后装柱而成用大剂量的黄曲霉毒素单克隆抗体固化在水不溶性的载体上然后装柱而成黄曲霉毒素检测主要设备注意点：澄清、含醇量、pH、流速、脱水检测方法详解检测方法详解 n方法难点：方法难点：痕量分析：PPb级别，灵敏度高，要有质量保证体系：重复性、标准曲线、随行回收、阴性样品、阳性样品、质控样品黄曲霉毒素在样品中分布不均匀中药样品种类多，基质各异，成分复杂，提取困难假阳性及假阴性的排除：多种方法比较，随行空白，液质联用，关闭衍生器报告具体值报告具体值低于检测限（标出检测限）低于检测限（标出检测限）报告具体值报告具体值限度内限度内限度外限度外结果报告黄曲霉毒素检测安全防护措施黄曲霉毒素检测安全

23、防护措施 n应有相应的安全、防护措施，并不得污染环境应有相应的安全、防护措施，并不得污染环境n黄曲霉毒素标准品禁用固体黄曲霉毒素标准品禁用固体n实验全程佩戴手套实验全程佩戴手套n残留有黄曲霉毒素的废液或废渣的玻璃器皿，残留有黄曲霉毒素的废液或废渣的玻璃器皿，应泡在专用贮存容器（装有应泡在专用贮存容器（装有10%次氯酸钠溶次氯酸钠溶液内，浸泡液内，浸泡24小时以上小时以上，再用清水将玻璃器，再用清水将玻璃器皿冲洗干净。皿冲洗干净。n流动相单独收集，先用次氯酸钠灭毒，再按常流动相单独收集，先用次氯酸钠灭毒，再按常规处理。规处理。总结总结n黄曲霉毒素危害极大，应引起重视n检测前先多了解被检测物质和成

24、分的性质，了解检测方法的原理及实验中每一步操作的目的，避免不必要的差错n检测过程中大家一定要注意安全措施的防护，保护好自己、保护好环境 黄曲霉毒素黄曲霉毒素点击录入内容点击录入内容点击录入内容点击录入内容显微镜下的黄曲霉黄曲霉毒素的检测意义黄曲霉毒素的检测意义 n毒性极强毒性极强急性毒性急性毒性：比氰化钾大10倍，比砒霜大68倍。慢性毒性慢性毒性：肝脏损害，呈急性肝炎、出血性坏死、肝细胞脂肪变性和胆管增生。脾脏和胰脏也有轻度的病变。黄曲霉毒素的检测意义黄曲霉毒素的检测意义n存在极其广泛存在极其广泛中药中容易产生黄曲霉毒素的有：种子、果实、粮谷类中药材或含此类药材的中成药；发酵类中药；贮存期中药

25、材、中成药;油性成分多的中药材黄曲霉毒素的种类及性质黄曲霉毒素的种类及性质n化学结构化学结构结构类似结构类似，目前发现约20余种，已分离鉴定出12种：B1,B2,G1,G2,M1,M2,P1,Q,H1,GM,B2a和毒醇.基本结构基本结构：二呋喃环和香豆素,B1是二氢呋喃氧杂萘邻酮的衍生物.即含有一个双呋喃环和一个氧杂萘邻酮（香豆素）.前者为基本毒性结构，后者与致癌有关.方法详解方法详解n操作中可能出现的问题及注意点操作中可能出现的问题及注意点净化和富集净化和富集采用免疫亲和柱，柱子是用大剂量的黄曲霉毒素单克隆抗体固化在水不溶性的载体上然后装柱而成原理：抗原、抗体反应，注意点：澄清、含醇量、p

26、H、流速、脱水 n其它注意事项：其它注意事项：亲和柱储存、使用温度，接头、容器洗涤方法详解方法详解黄曲霉毒素标液supelco检测方法详解检测方法详解 n方法难点：方法难点：痕量分析：PPb级别，灵敏度高，要有质量保证体系：重复性、标准曲线、随行回收、阴性样品、阳性样品、质控样品黄曲霉毒素在样品中分布不均匀中药样品种类多，基质各异，成分复杂，提取困难假阳性及假阴性的排除：多种方法比较，随行空白，液质联用，关闭衍生器婴幼儿配方食品 5.衍生方式：柱后碘衍生、柱后光化学衍生。中药黄曲霉毒素检测药典收载状况上样，载体上的抗体结合样品中的待测物拟分枝镰刀菌和梨孢镰刀菌黄曲霉毒素危害极大，应引起重视修订

27、了附录方法贮存期中药材、中成药;油性成分多的中药材黄曲霉毒素检测主要设备洗脱，将结合在抗体上的待测物冲洗下来进入仪器检测中药中黄曲霉毒素药典检测方法详解贮存期中药材、中成药;油性成分多的中药材前者为基本毒性结构，后者与致癌有关.M1、M2主要存在于牛奶中荧光检测器，激发波长=360nm(或 365nm)，发射波长=450nm修订了附录方法注意点：澄清、含醇量、pH、流速、脱水结构类似，目前发现约20余种，已分离鉴定出12种：B1,B2,G1,G2,M1,M2,P1,Q,H1,GM,B2a和毒醇.黄曲霉毒素的种类及性质黄曲霉毒素检测主要设备增强B1、G1的荧光强度。总结n黄曲霉毒素危害极大，应引起重视n检测前先多了解被检测物质和成分的性质，了解检测方法的原理及实验中每一步操作的目的，避免不必要的差错n检测过程中大家一定要注意安全措施的防护，保护好自己、保护好环境