细胞生物学研究方法(同名545)课件.ppt

1、1第三章第三章 细胞生物学细胞生物学研究方法研究方法进行初步观察进行初步观察形成可验证的假说形成可验证的假说设计对照试验设计对照试验收集资料收集资料解释结果解释结果作出合理结论作出合理结论查阅已查阅已有知识有知识生物学研究模式生物生物学研究模式生物不同物种享有共同分子机制不同物种享有共同分子机制2如何学习细胞生物学？如何学习细胞生物学？抽象思维抽象思维与与动态观点动态观点 结构与功能统一的观点结构与功能统一的观点 同一性同一性(unity)和多样性和多样性(diversity)的问题的问题 细胞生物学的主要内容：细胞生物学的主要内容：结构与功能（动态特征）；结构与功能（动态特征）；细胞的生命活

2、动细胞的生命活动；实验科学与实验技术实验科学与实验技术细胞真知源于实验室细胞真知源于实验室 What we know/How we know.3第三章第三章 细胞生物学研究方法细胞生物学研究方法 细胞形态结构的观察方法细胞形态结构的观察方法 细胞组分的分析方法细胞组分的分析方法 细胞培养、细胞工程与显微操作技术细胞培养、细胞工程与显微操作技术 用于细胞生物学研究的模式生物用于细胞生物学研究的模式生物4第一节第一节 细胞形态结构的观察方法细胞形态结构的观察方法 光学显微镜技术光学显微镜技术（light microscopy）电子显微镜技术 (Electro microscopy)扫描探针显微镜（

3、扫描探针显微镜（Scanning Probe Microscope）扫描遂道显微镜扫描遂道显微镜 (scanning tunneling microscope)5显微成像技术 光学和电子显微镜成像原理光学和电子显微镜成像原理三个基本要素:照明系统，被观察的样品，聚焦和成像的透镜系统 常用的光学显微镜常用的光学显微镜 普通双筒显微镜(binocular microscope)荧光显微镜(fluorescence microscope)相差显微镜(phase contrast microscope)暗视野显微镜(dark field microscope)倒置显微镜 6光学和电子显微镜的基本结构

4、7r=0.61/n sin 其中：其中：n=聚光镜和物镜之间介质的折射率聚光镜和物镜之间介质的折射率,空气为空气为1,油为油为1.5;=样品对物镜角孔径的半角样品对物镜角孔径的半角=照明光源的波长。照明光源的波长。0.61是一个恒定的参数是一个恒定的参数分辨率分辨率(resolution,r)：显微镜或人眼在显微镜或人眼在25 cm明视距离处，明视距离处，能清楚分辨被检物体细微结构最小间隔的能力能清楚分辨被检物体细微结构最小间隔的能力。r值越小，分辨能力越高。值越小，分辨能力越高。波长越短，分辨能力越高。波长越短，分辨能力越高。8分辨极限分辨极限(limit resolution)一般地说，一

5、定波长的射线不能用以探查比它本身波长一般地说，一定波长的射线不能用以探查比它本身波长短得多的结构细节，这是一切显微镜的一个基本限度。短得多的结构细节，这是一切显微镜的一个基本限度。对可见光（对可见光（0.40.7 m）来说，能清楚地分辨出相邻）来说，能清楚地分辨出相邻两点之间的最小间隔是两点之间的最小间隔是0.2 m。放大率放大率(magnification)最终成像的大小与原物体大小的比值称为最终成像的大小与原物体大小的比值称为放大率放大率。9 2.1.2 常用光学显微镜常用光学显微镜 普通双筒显微镜普通双筒显微镜 (binocular microscope)荧光显微镜荧光显微镜(fluor

6、escence microscope)相差显微镜相差显微镜(phase contrast microscope)暗视野显微镜暗视野显微镜(dark field microscope)倒置显微镜倒置显微镜(inverted microscope)10普普通通光光学学显显微微镜镜11荧光显微镜荧光显微镜(fluorescence microscope)荧光显微镜以荧光显微镜以紫外线紫外线为光源照射被检物体，为光源照射被检物体，使之使之发出发出荧光荧光，然后在显微镜下观察物体的形态及其，然后在显微镜下观察物体的形态及其所在位置所在位置。要求要求：被检物体发荧光（自发荧光、诱发荧光）：被检物体发荧光（

7、自发荧光、诱发荧光）用途：用途：用于研究细胞内物质的吸收、运输及化学用于研究细胞内物质的吸收、运输及化学物质的分布和定位等。物质的分布和定位等。12荧光显微镜技术荧光显微镜技术（Fluorescence Microscopy）原理与应用原理与应用 直接荧光标记技术直接荧光标记技术 间接免疫荧光标记技术间接免疫荧光标记技术 在光镜水平用于特异蛋白质在光镜水平用于特异蛋白质 等生物大分子的定性定位：等生物大分子的定性定位：如绿色荧光蛋白如绿色荧光蛋白(GFP)的应用的应用 13荧光显微镜照片（荧光显微镜照片（微管微管呈绿色、呈绿色、微丝微丝红色、红色、核核蓝色）蓝色）图片来自http:/www.i

8、tg.uiuc.edu/14Laser scanning confocal microscope151617相差显微镜相差显微镜(phase contrast microscope)优点优点：能够观察：能够观察无色、透明、活细胞无色、透明、活细胞中的结构。中的结构。特点特点：能将物体本身的相位差（光程差）转换为振幅（光：能将物体本身的相位差（光程差）转换为振幅（光强度）变化的显微镜。强度）变化的显微镜。18倒置显微镜倒置显微镜(inverted microscope)物镜物镜与与照明系统照明系统的位置颠倒过来。的位置颠倒过来。物镜置于载物台之下，物镜置于载物台之下，光源位于载物台的上方。光源位

9、于载物台的上方。集光器与载物台之间的工作距离提高，集光器与载物台之间的工作距离提高，可以放置可以放置培养皿、培养瓶等容器培养皿、培养瓶等容器，直接对培养的细胞进行直接对培养的细胞进行照明和观察。照明和观察。19202.1.3 2.1.3 光学显微镜的样品制备光学显微镜的样品制备 1.样品的固定样品的固定(fixation)目的目的:做法做法:固定液：固定液：快速杀死细胞，稳定细胞的化学成份，并且使样品快速杀死细胞，稳定细胞的化学成份，并且使样品硬化以便在进一步的处理和切片时不会受到破坏。硬化以便在进一步的处理和切片时不会受到破坏。将样品将样品浸泡在固定液浸泡在固定液中。固定使得大分子交联而保中

10、。固定使得大分子交联而保持在一定的位置上，不致于在以后的染色等处理过持在一定的位置上，不致于在以后的染色等处理过程中移位或丢失而产生人工假象。程中移位或丢失而产生人工假象。一般用具有缓冲作用的一般用具有缓冲作用的醛类醛类固定液，用固定液，用甲醛或戊甲醛或戊二醛二醛作固定剂，能够与蛋白质的游离氨基形成共作固定剂，能够与蛋白质的游离氨基形成共价键，从而将邻近的蛋白质分子牢固地交联在一价键，从而将邻近的蛋白质分子牢固地交联在一起。起。212.2.包埋和切片包埋和切片(embedding and sectioning)(embedding and sectioning)包埋：通常用包埋：通常用液态的石

11、蜡或树脂液态的石蜡或树脂做包埋剂，使之渗入整块做包埋剂，使之渗入整块组织，使之硬化成固体的包埋块。组织，使之硬化成固体的包埋块。切片机切割包埋块，制备成薄切片。适用于光学显微镜观切片机切割包埋块，制备成薄切片。适用于光学显微镜观察的切片厚度为察的切片厚度为 l l10 m10 m。223.染色染色(staining)目的：给细胞的不同组分带上可区别的颜色特征。目的：给细胞的不同组分带上可区别的颜色特征。苏木精苏木精(hematoxylin)：核酸：核酸 伊红伊红(eosin)：细胞质：细胞质 苏丹染料苏丹染料(Sudan dyes)：脂肪：脂肪234.放射自显影放射自显影 用感光胶片测定细胞内

12、某种被放射性标记的物质在细胞固用感光胶片测定细胞内某种被放射性标记的物质在细胞固定时所在的位置。定时所在的位置。242.1.4 电子显微镜电子显微镜(electron microscope)1.透射电子显微镜透射电子显微镜(transmission electron microscope，TEM)让电子束穿透样片而成像。让电子束穿透样片而成像。25Transmission Electron Microscope 26272.扫描电子显微镜扫描电子显微镜(scanning electron microscopy，SEM)用用二次电子二次电子成像来观察样品的成像来观察样品的表面表面结构。结构。28

13、Scanning Electron Microscope 29Lymphocyte viewed through a TEM and a SEM.(a)This TEM shows a thin slice of a lymphocyte,a type of white blood cell.This type of microscopy allows one to see the internal structures present in the slice.(b)In a SEM,surface structures can be seen,as demonstrated in this

14、 view of a lymphocyte.Note the three-dimensional appearance of this cell,in contrast to the two-dimensional appearance of the cell in(a)302.1.5 电子显微镜的样品制备电子显微镜的样品制备 与光镜相比，组织固定的特殊要求：与光镜相比，组织固定的特殊要求：样品要薄，制成样品要薄，制成50100nm的超薄切片。的超薄切片。保持样品的精细结构。保持样品的精细结构。样品要具有一定的反差。样品要具有一定的反差。电子显微镜的样品切片最后被放置在电子显微镜的样品切片最后

15、被放置在载网载网上而上而不是玻片不是玻片上。上。31染色染色(Stainning)醋酸双氧铀醋酸双氧铀：可与细胞内大多数分子结合，染核可与细胞内大多数分子结合，染核酸和蛋白质，但对膜的染色效果较差。酸和蛋白质，但对膜的染色效果较差。柠檬酸铅柠檬酸铅：核蛋白及糖元结合，也可大大提高细：核蛋白及糖元结合，也可大大提高细胞膜系统与物质的反差。胞膜系统与物质的反差。321.负染色负染色(negative stainning)用重金属作染色剂，对铺展在载网上的样品进行染色，使用重金属作染色剂，对铺展在载网上的样品进行染色，使整个载网都铺上一层重金属盐，而有凸出颗粒的地方则没整个载网都铺上一层重金属盐，而

16、有凸出颗粒的地方则没有染料沉积。由于电子密度高的重金属盐包埋了样品中低有染料沉积。由于电子密度高的重金属盐包埋了样品中低电子密度的背景，增强了背景散射电子的能力以提高反差。电子密度的背景，增强了背景散射电子的能力以提高反差。这样，在图像中背景是黑暗的，而未包埋的样品颗粒则透这样，在图像中背景是黑暗的，而未包埋的样品颗粒则透明光亮，这种染色称为负染色。明光亮，这种染色称为负染色。333.冰冰冻冻蚀蚀刻刻技技术术34电镜与光镜的比较电镜与光镜的比较 显微镜显微镜分辨本领分辨本领光源光源透镜透镜真空真空成像原理成像原理LMLMTEMTEM200nm200nm100nm100nm0.1nm0.1nm可

17、见光可见光（400-700400-700）紫外光紫外光（约（约200nm)200nm)电子束电子束（0.01-0.01-0.90.9）玻璃透镜玻璃透镜石英透镜石英透镜电磁透镜电磁透镜不要求真空不要求真空不要求真空不要求真空要求真空要求真空1.33x101.33x10-5-51.33x101.33x10-3-3PaPa利用样品对光的吸收形利用样品对光的吸收形成明暗反差和颜色变化成明暗反差和颜色变化利用样品对电子的散射利用样品对电子的散射和透射形成明暗反差和透射形成明暗反差35显微结构（显微结构（microscopic structuremicroscopic structure）：）：光镜下光镜

18、下所见到的物体结构。所见到的物体结构。超微结构（超微结构（ultrastructureultrastructure）:又称为亚显微结又称为亚显微结构。是在光学显微镜下观察不到而只能在电子构。是在光学显微镜下观察不到而只能在电子显微镜下观察的结构。显微镜下观察的结构。36第二节第二节 细胞组分的分析方法细胞组分的分析方法 用超速离心技术分离细胞器与生物大分子及其复合物用超速离心技术分离细胞器与生物大分子及其复合物 细胞内核酸、蛋白质、酶、糖与脂类等的显示方法细胞内核酸、蛋白质、酶、糖与脂类等的显示方法 特异蛋白抗原的定位与定性特异蛋白抗原的定位与定性 细胞内特异核酸的定位与定性细胞内特异核酸的定

19、位与定性 放射自显影技术放射自显影技术 定量细胞化学分析技术定量细胞化学分析技术37一、一、离心分离技术离心分离技术 用途：于分离细胞器与生物大分子及其复合物用途：于分离细胞器与生物大分子及其复合物 差速离心差速离心：分离密度不同的细胞组分：分离密度不同的细胞组分 密度梯度离心密度梯度离心：精细组分或生物大分子的分离：精细组分或生物大分子的分离38第二节第二节 细胞组分的分析方法细胞组分的分析方法一、高速、超速和梯度密度离心分离各种细胞器、生物一、高速、超速和梯度密度离心分离各种细胞器、生物大分子及其复合物大分子及其复合物39二、二、细胞内核酸、蛋白质、细胞内核酸、蛋白质、酶、糖与脂类等的显示

20、方法酶、糖与脂类等的显示方法原理原理：利用一些显色剂与所检测物质中一些：利用一些显色剂与所检测物质中一些 特殊基团特异性结合的特征，通过显特殊基团特异性结合的特征，通过显 色剂在细胞中的定位及颜色的深浅来色剂在细胞中的定位及颜色的深浅来 判断某种物质在细胞中的判断某种物质在细胞中的分布和含量分布和含量。Feulgen Staining40二、细胞内核酸、蛋白质、酶、糖类、脂类的显色二、细胞内核酸、蛋白质、酶、糖类、脂类的显色DNA：福尔根（：福尔根（Feulgen）反应紫红色）反应紫红色多糖类：多糖类：PAS反应黄色反应黄色脂肪：苏丹脂肪：苏丹III红色红色蛋白质：米伦（蛋白质：米伦（Mill

21、on）红色）红色三、特异抗体技术三、特异抗体技术免疫荧光免疫荧光免疫电镜免疫电镜免疫沉淀免疫沉淀Western blotting四、特异核酸标记技术四、特异核酸标记技术In situ hybridizationNorthern blot(RNA);Southern blot(DNA)41DNA特异性的显示方法Feulgen反应：利用酸水解去除细胞中的RNA，仅保留DNA，并且除去DNA嘌呤脱氧核糖核酸的嘌呤，使脱氧核糖的醛基暴露，所暴露出的自由醛基与希夫试剂反应呈紫红色。42三、特异蛋白抗原的定位与定性三、特异蛋白抗原的定位与定性 免疫荧光技术免疫荧光技术：快速、灵敏、有特异性，但其分辨率有限

22、快速、灵敏、有特异性，但其分辨率有限 （图图）蛋白电泳蛋白电泳(SDS-PAGE)(SDS-PAGE)与免疫印迹反应与免疫印迹反应(Western-Blot)(Western-Blot)免疫电镜技术免疫电镜技术：免疫铁蛋白技术免疫铁蛋白技术免疫酶标技术免疫酶标技术 432.2 2.2 细胞化学技术细胞化学技术 酶细胞化学技术酶细胞化学技术：通过酶的特异细胞化：通过酶的特异细胞化学反应来显示酶在细胞内的定位。学反应来显示酶在细胞内的定位。免疫细胞化学技术免疫细胞化学技术：利用免疫反应定位：利用免疫反应定位组织或细胞中抗原成分分布的一类技术组织或细胞中抗原成分分布的一类技术。免疫荧光技术免疫荧光技

23、术 免疫电镜免疫电镜44Figure 9-16.Indirect immuno-cytochemistry.This detection method is very sensitive because the primary antibody is itself recognized by many molecules of the secondary antibody.The secondary antibody is covalently coupled to a marker molecule that makes it readily detectable.Commonly used

24、 marker molecules include fluorescent dyes(for fluorescence microscopy),the enzyme horseradish peroxidase(for either conventional light microscopy or electron microscopy),colloidal gold spheres(for electron microscopy),and the enzymes alkaline phosphatase or peroxidase(for biochemical detection).45四

25、、细胞内特异核酸的定位与定性四、细胞内特异核酸的定位与定性 光镜水平的原位杂交技术光镜水平的原位杂交技术 （同位素标记或荧光素标记的探针）（同位素标记或荧光素标记的探针）电镜水平的原位杂交技术电镜水平的原位杂交技术（生物素标记的探针与抗生物素抗体相连的胶体金标记结合）（生物素标记的探针与抗生物素抗体相连的胶体金标记结合）PCR技术技术 46原位杂交技术原位杂交技术472.3 细胞分选技术细胞分选技术(cell sorting)细胞分选：细胞分选：用用流式细胞仪流式细胞仪（flow cytometerflow cytometer，FCMFCM）对）对细胞或染色体进行分选，并进行定量分析。细胞或染

26、色体进行分选，并进行定量分析。48流式细胞术流式细胞术49细细胞胞标标记记50染染色色体体标标记记51染染色色体体分分选选流式细胞仪流式细胞仪52第三节第三节 细胞培养、细胞工程与显微操作技术细胞培养、细胞工程与显微操作技术一、细胞培养一、细胞培养 1，植物细胞，植物细胞 （原代细胞培养，永生细胞系）（原代细胞培养，永生细胞系）2，动物细胞，动物细胞 （单倍体细胞培养，原生质体培养，体细胞培养）（单倍体细胞培养，原生质体培养，体细胞培养）3，非细胞体系，非细胞体系 （DNA复制，复制，RNA转录，蛋白质合成，高尔基体的膜泡转录，蛋白质合成，高尔基体的膜泡 运输，细胞核装配等）运输，细胞核装配等

27、）细胞提取物，细胞核提取物细胞提取物，细胞核提取物53原代培养原代培养：从机体取出后立即进行的细胞培养。传代培养传代培养：原代培养的细胞在生长一定时间以后，就会由于营养成分的消耗、代谢产物的积累以及接触抑制等因素而停止生长，因此必需将细胞传到新的培养瓶中去使其继续生长。54细胞株细胞株：原代培养的细胞一般传至10代左右就不易传下去了，细胞生长出现停滞，但有极少数细胞可能渡过危机而传下去，这些细胞一般又可顺利传代40-50代，并且保持染色体的二倍体数量及接触抑制的行为。这种传代细胞称为细胞株。细胞系细胞系：由细胞株传至50代后又出现危机不能再传下去，但是如果有部分细胞发生了遗传突变就有可能在体外

28、培养的条件下无限制地传下去。这些细胞具有癌细胞的特点，这种传代细胞称为细胞系。细胞系的特点是染色体发生明显变化，失去接触抑制的特性。实验室中常用的细胞系55 动物细胞培养动物细胞培养 类型：原代培养细胞（类型：原代培养细胞（primary culture cellprimary culture cell）继代培养细胞（继代培养细胞（sub-culture cellsub-culture cell）细胞株（细胞株（cell straincell strain）正常二倍体，接触抑制正常二倍体，接触抑制 细胞系细胞系（cell linecell line）亚二倍体，接触抑制丧失亚二倍体，接触抑制丧失

29、56名称类型来源3T3成纤维细胞小鼠Hela宫颈癌上皮细胞Henrittal LacksBHK21成纤维细胞叙利亚仓鼠PtK1上皮细胞袋鼠L6成肌细胞大鼠PCI2嗜铬细胞大鼠SP2浆细胞小鼠SP2/0骨髓瘤浆细胞小鼠CHO卵巢细胞中国地鼠实验室中几种常用的细胞系57植物组织培养植物组织培养动物细胞培养动物细胞培养细胞的克隆细胞的克隆58Hela细胞（左）、CHO细胞（右）的培养592.4 细胞工程技术细胞工程技术细胞工程：细胞工程：应用细胞生物学的原理和方法，结合工应用细胞生物学的原理和方法，结合工程学的技术手段，按照人们的设计，改变细胞内遗传物程学的技术手段，按照人们的设计，改变细胞内遗传物

30、质以获得新型生物或特种细胞的一门综合性科学技术。质以获得新型生物或特种细胞的一门综合性科学技术。细胞培养：细胞培养：在体外模拟体内的生理环境，培养从机在体外模拟体内的生理环境，培养从机体中取出的细胞，并使之生存和生长的技术。体中取出的细胞，并使之生存和生长的技术。正常细胞一般可培养正常细胞一般可培养4050代。代。60细胞融合细胞融合(cell fusion)指指自发自发或或人工人工诱导下，两诱导下，两个不同基因型的细胞或原个不同基因型的细胞或原生质体融合形成一个杂种生质体融合形成一个杂种细胞。细胞。灭活的仙台病毒灭活的仙台病毒 或或聚乙二醇聚乙二醇61单克隆抗体技术单克隆抗体技术(monoc

31、lonal antibody technique)将产生抗体的单个将产生抗体的单个B淋巴细胞淋巴细胞和和肿瘤细胞肿瘤细胞杂交的技术。杂交的技术。HAT培养基包含：培养基包含：次黄嘌呤（次黄嘌呤（H）胸腺嘧啶（胸腺嘧啶（T）氨基蝶呤（氨基蝶呤（A）62 显微操作术显微操作术(micromanipulation)用显微操作装置对细胞进行解剖手术和微量注射用显微操作装置对细胞进行解剖手术和微量注射的技术的技术。63 动物细胞核移植克隆技术动物细胞核移植克隆技术 ABCD64Caenorhabditis elegansDrosophila melanogasterArabidopsis thalian

32、a65一、名词解释一、名词解释 分辨率、显微结构、超微结构分辨率、显微结构、超微结构二、简要说明电子显微镜和光学显微镜的主要区别二、简要说明电子显微镜和光学显微镜的主要区别三、光学显微镜（三、光学显微镜（荧光显微镜荧光显微镜 、相差显微镜、暗、相差显微镜、暗视野显微镜、倒置显微镜）和电子显微镜（扫描电视野显微镜、倒置显微镜）和电子显微镜（扫描电子显微镜和透射电子显微镜）的原理与应用范围。子显微镜和透射电子显微镜）的原理与应用范围。661、关于电子显微镜，下列哪项有误A.观察组织或细胞的结构均需超薄切片B.镜筒需要真空在荧光屏上成像利用电子束作为照明源 光学显微镜能够分辩出其详细结构的是A.细胞B.线粒体C.有被小泡 D.叶绿体、要探知细胞内某一蛋白质的表达水平，可以通过（）技术实现。A.Southern印迹B.Northern 印迹C.Western 印迹D.原位杂交 67 4 Feulgen 反应可用来测定下列物质中的（）蛋白质 B.脂肪.多糖.DNA