基因组数据注释和功能分析课件.ppt

1、基因组数据注释和功能分基因组数据注释和功能分析析陈启昀陈 辰丁文超 张增明浙江加州国际纳米技术研究院（浙江加州国际纳米技术研究院（ZCNI）实习一基因组数据注释和功能分析实习二核苷酸序列分析实习三芯片的基本数据处理和分析实习四蛋白质结构与功能分析实习五蛋白质组学数据分析实习六系统生物学软件实习课程内容课程内容基因组学基因组学转录物组学转录物组学蛋白质组学蛋白质组学系统生物学系统生物学1.通过序列比对工具通过序列比对工具BLAST学习，了解学习，了解蛋白编码基因的功能注释原理蛋白编码基因的功能注释原理2.介绍多序列联配工具介绍多序列联配工具ClustalX3.分子进化分析软件分子进化分析软件ME

2、GA4的基本知的基本知识，掌握系统发生树绘制的基本方法识，掌握系统发生树绘制的基本方法课程提纲课程提纲序列比对的进化基础序列比对的进化基础什么是序列比对：什么是序列比对：将两个或多个序列按照最佳匹配方式排列在一起。对应的相同或相似的符号排列在同一列上。错配与突变相应，空位与插入或缺失对应。序列比对的目的：序列比对的目的：从核酸以及氨基酸的层次去分析序列的相同点和不同点，以推测他们的结构、功能以及进化上的联系通过判断两个序列之间的相似性来判定两者是否具有同源性 相似性：可以被数量化，如：序列之间相似部分的百分比 同源性：质的判断，两个基因在进化上是否曾有共同祖先的推断BLAST 基本局部比对搜索

3、工具基本局部比对搜索工具(Basic Local Alignment Search Tool)NCBI上上BLAST服务的网址服务的网址：http:/www.ncbi.nlm.nih.gov/blast/NCBI上上BLAST程序的下载：程序的下载：ftp:/ftp.ncbi.nlm.nih.gov/blast/executables/release/NCBI的的BLAST数据库下载网址：数据库下载网址：ftp:/ftp.ncbi.nlm.nih.gov/blast/db/选择物种选择物种选择选择blast程序程序QuerySequenceAminoacidSequenceDNASequenc

4、etBLASTxBLASTxBLASTntBLASTnBLASTpNucleotideDatabaseProteinDatabaseNucleotideDatabaseNucleotideDatabaseProteinDatabaseTranslatedTranslatedTranslated程序名搜索序列数据库内容备注blastpProteinProtein比较氨基酸序列与蛋白比较氨基酸序列与蛋白质数据库质数据库使用取代矩阵寻找较使用取代矩阵寻找较远的关系，进行远的关系，进行SEG过滤过滤blastnNucleotideNucleotide比较核酸序列与核酸数比较核酸序列与核酸数据库据库寻找

5、较高分值的匹配，寻找较高分值的匹配，对较远的关系不太适对较远的关系不太适用用blastxNucleotideProtein比较核酸序列理论上的比较核酸序列理论上的六个读码框的所有转换六个读码框的所有转换结果和蛋白质数据库结果和蛋白质数据库用于新的用于新的DNA序列和序列和ESTs的分析，可转的分析，可转译搜索序列译搜索序列tblastnProteinNucleotide比较蛋白质序列和核酸比较蛋白质序列和核酸序列数据库，动态转换序列数据库，动态转换为六个读码框的结果为六个读码框的结果用于寻找数据库中没用于寻找数据库中没有标注的编码区，可有标注的编码区，可转译数据库序列转译数据库序列tblast

6、xNucleotideNucleotide比较核酸序列和核酸序比较核酸序列和核酸序列数据库，经过两次动列数据库，经过两次动态转换为六个读码框的态转换为六个读码框的结果结果转译搜索序列与数据转译搜索序列与数据库序列库序列以以Blastx为例：为例：目标序列为目标序列为ATG AGT ACC GCT AAA TTA GTT AAA TCA AAA GCG ACC AAT CTG CTT TAT ACC CGC6个读码框翻译5端到端到3端端第一位起始：第一位起始：ATG AGT ACC GCT AAA TTA GTT AAA TCA AAA GCG ACC AAT CTG CTT TAT ACC C

7、GC第二位起始：第二位起始：TGA GTA CCG CTA AAT TAG TTA AAT CAA AAG CGA CCA ATC TGC TTT ATA CCC GC第三位起始：第三位起始：GAG TAC CGC TAA ATT AGT TAA ATC AAA AGC GAC CAA TCT GCT TTA TAC CCG C3端到端到5端端第一位起始：第一位起始：GCG GGT ATA AAG CAG ATT GGT CGC TTT TGA TTT AAC TAA TTT AGC GGT ACT CAT第二位起始：第二位起始：CGG GTA TAA AGC AGA TTG GTC GCT

8、TTT GAT TTA ACT AAT TTA GCG GTA CTC AT第三位起始：第三位起始：GGG TAT AAA GCA GAT TGG TCG CTT TTG ATT TAA CTA ATT TAG CGG TAC TCA T与核酸相关的数据库与核酸相关的数据库与蛋白质相关的数据库与蛋白质相关的数据库选择数据库选择数据库序列或目标序列的序列或目标序列的GI号号以文件格式上传以文件格式上传BlastN配对与错配配对与错配空位罚分空位罚分BlastP打分矩阵：打分矩阵：PAM30PAM30PAM70PAM70BLOSUM80BLOSUM80BLOSUM62BLOSUM62BLOSUM4

9、5BLOSUM45PAM模型可用于寻找蛋白质的进化起模型可用于寻找蛋白质的进化起源，而源，而BLOSUM模型则用于发现蛋模型则用于发现蛋白质的保守域。白质的保守域。选择打分矩阵（选择打分矩阵（scoring matrix）The PAM familyBased on global alignmentsThe PAM1 is the matrix calculated from comparisons of sequences with no more than 1%divergence.Other PAM matrices are extrapolated from PAM1.The BLOS

10、UM familyBased on local alignments.BLOSUM62 is a matrix calculated from comparison s of sequences with no less than 62%divergence.All BLOSUM matrices are based on observed alignments;they are not extrapolated from comparisons of closely related proteins.进行比对的数据库进行比对的数据库图形化结果图形化结果E值（值（E-value）表示仅仅因为随

11、机性造成获得这一）表示仅仅因为随机性造成获得这一 比对结果的可能性。这一数值越比对结果的可能性。这一数值越接近零，发生这一事件的可能性越小。接近零，发生这一事件的可能性越小。上机实习上机实习1：网上运行：网上运行blastx和和blastn(NCBIblastNCBIblast网址：网址：http:/www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST/）lesson.seq.screen.Contig34lesson.seq.screen.Contig34 TTTTTTTTTTTTTTTTTAGTGCCAGTTTTTTTTTTTATTTGTAAAGCTCTGCCATAAACTTCTAGCGT

12、GTGCCAATGGTCACCTGTTTTTTTTTTTTTTTTTAGTGCCAGTTTTTTTTTTTATTTGTAAAGCTCTGCCATAAACTTCTAGCGTGTGCCAATGGTCACCTGCCACACTCGCACCAGGTTGTCCGTGTAGCCAGCAAACAGAGTCTGGCCATCAGCAGACCAGGCCAGGGAGGTGCACTGGGGTGGTCCACACTCGCACCAGGTTGTCCGTGTAGCCAGCAAACAGAGTCTGGCCATCAGCAGACCAGGCCAGGGAGGTGCACTGGGGTGGTTCTGCCTTGCTGCTGGTACTGATAACTT

13、CTTGCTTCAGTTCATCTACAATGATCTTTCCCTCTAAATCCCAGATCTTGATGCTGGTCTGCCTTGCTGCTGGTACTGATAACTTCTTGCTTCAGTTCATCTACAATGATCTTTCCCTCTAAATCCCAGATCTTGATGCTGGGGCCTGTGGAGCACACAGCCAGTAGCGGTTAGGGCTGAAGCACAGGGCGTTGATGATGTCCCCACCATCTAGCGTGTAAAGGTGTGGCCTGTGGAGCACACAGCCAGTAGCGGTTAGGGCTGAAGCACAGGGCGTTGATGATGTCCCCACCATCTAGC

14、GTGTAAAGGTGTTTGCCTTCGTTGAGATCCCATAACATGGCCTGGCCATCCTTGCCTCCAGAAGCACAGAGGGATCCATCTGGAGAGACAGTCACCGTTGCCTTCGTTGAGATCCCATAACATGGCCTGGCCATCCTTGCCTCCAGAAGCACAGAGGGATCCATCTGGAGAGACAGTCACCGTGTTCAGATAGCCTGTGTGGCCAATGTGGTTGGTCTTCAGCTTGCAGTTAGCCAGGTTCCATACCTTGACCAGCTTGTCCCAGCCTGTTCAGATAGCCTGTGTGGCCAATGTGGTTGG

15、TCTTCAGCTTGCAGTTAGCCAGGTTCCATACCTTGACCAGCTTGTCCCAGCCACAGGAGACGATGATAGGGTTGCTGCTGTTGGGCGAGAAGCGGACACAAGACACCCACTCTGAGTGGCTCTCATCCTGGACAGTGACAGGAGACGATGATAGGGTTGCTGCTGTTGGGCGAGAAGCGGACACAAGACACCCACTCTGAGTGGCTCTCATCCTGGACAGTGTATTTGCACACACCCAGGGTATTCCATAGCTTGATGGTTTTATCTCGAGATCCAGAGACAATCTGCCGGTTGTCAGAG

16、GAGAAGGTATTTGCACACACCCAGGGTATTCCATAGCTTGATGGTTTTATCTCGAGATCCAGAGACAATCTGCCGGTTGTCAGAGGAGAAGGCCACACTCAGCACATCCTTGGTATGGCCCACAAATCGCCTCGTGGTGGTGCCCGTTGTGAGATCCCAGAAGGCGCAGGGTTCCATCCACACTCAGCACATCCTTGGTATGGCCCACAAATCGCCTCGTGGTGGTGCCCGTTGTGAGATCCCAGAAGGCGCAGGGTTCCATCCCAGGAGCCTGAGAGGGCAAACTGGCCATCTGAGGAG

17、ATAACCACATCACTAACAAAGTGGGAGTGACCCCGCAGAGCACGCTGCCCAGGAGCCTGAGAGGGCAAACTGGCCATCTGAGGAGATAACCACATCACTAACAAAGTGGGAGTGACCCCGCAGAGCACGCTGTGGAATTCCATAGTTGGTCTCATCCCTGGTCAGTTTCCACATGATGATGGTCTTATCTCGAGAGGCGGAGAGGATCATGTCCGGGTGGAATTCCATAGTTGGTCTCATCCCTGGTCAGTTTCCACATGATGATGGTCTTATCTCGAGAGGCGGAGAGGATCATGTCCG

18、GGAACTGCGGGGTAGTAGCGATCTGGGTTACCCAGCCGTTGTGGCCCTTGAGGGTGCCACGAAGGGTCATCTGCTCAGTCATGGCGGAACTGCGGGGTAGTAGCGATCTGGGTTACCCAGCCGTTGTGGCCCTTGAGGGTGCCACGAAGGGTCATCTGCTCAGTCATGGCGGCGGCGAGAGCGTGTTCGCTGCAGCGACGAGGATGGCACTGGATGGCTTAGAGAAACTAGCACCACAGTCGACCCGGCGAGAGCGTGTTCGCTGCAGCGACGAGGATGGCACTGGATGGCTTAGAGAAA

19、CTAGCACCACAGTCGACC1.1.对对contig34contig34进行网上进行网上blastnblastn（演示），（演示），2.2.blastxblastx（自行操作）比对（自行操作）比对本地运行本地运行BLASTBLAST 下载下载NCBI上上blast程序：程序：ftp:/ftp.ncbi.nlm.nih.gov/blast/executables/release/安装（安装到安装（安装到C:C:）数据库的格式化（数据库的格式化（formatdbformatdb）程序运行（程序运行（blastallblastall）登陆登陆NCBI的的FTP下载下载blast程序程序双击安

20、装到双击安装到C盘盘产生三个文件夹产生三个文件夹bindatadoc将数据库文件将数据库文件(db)及目标序及目标序列文件列文件(in)保存在保存在Blast/bin文件夹下文件夹下bin含可执行程序含可执行程序(将数据库及需要比将数据库及需要比对操作的数据放入该文件对操作的数据放入该文件)；data文件夹含打分矩阵及演示例子的文件夹含打分矩阵及演示例子的序列数据信息；序列数据信息；doc文件夹含关于各子程序的说明文文件夹含关于各子程序的说明文档。档。本地数据库的构建本地数据库的构建查看查看db文件文件由由fasta格式的序列组成格式的序列组成数据库的格式化数据库的格式化formatdbfor

21、matdb命令用于数据库的格式化：命令用于数据库的格式化：formatdb option1 option2 option3formatdb option1 option2 option3formatdbformatdb常用参数常用参数-i database_name i database_name 需要格式化的数据库名称需要格式化的数据库名称-p TF-p TF 待格式化数据库的序列类型待格式化数据库的序列类型（核苷酸选（核苷酸选F F；蛋白质选；蛋白质选T T；默认值为；默认值为T)T)例：例：formatdb-i db-p T对对蛋白质蛋白质数据库数据库“db”进行格式化进行格式化程序运行

22、程序运行blastallblastall命令用于运行五个命令用于运行五个blastblast子程序子程序:blastall option1 option2 option3blastall option1 option2 option3*可在可在dos下输入下输入blastall查看各个参数的意义及使用查看各个参数的意义及使用blastallblastall常用参数常用参数 四个必需参数-p program_name,程序名，根据数据库及搜索文件序列性质进行选择；程序名，根据数据库及搜索文件序列性质进行选择；-d database_name,数据库名称数据库名称,比对完成格式化的数据库；比对完成

23、格式化的数据库；-i input_file,搜索文件名称；搜索文件名称；-o output_file,BLASTBLAST结果文件名称；结果文件名称；两个常用参数-e expectation，期待值，期待值,默认值为默认值为10.010.0，可采用科学计数法来表示，如，可采用科学计数法来表示，如2e-52e-5；-m alignment view options:比对显示选项，其具体的说明可以用以下的比对实例比对显示选项，其具体的说明可以用以下的比对实例说明说明例：blastall-p blastx-d db-i in-o out-e 2e-5-m 9(表格显示比对结果表格显示比对结果)采用b

24、lastx程序，将in中的序列到数据库bd中进行比对，结果以表格形式输入到out文件上机实习上机实习2:本地运行本地运行blastx 进入进入DOS命令行提示符状态（命令行提示符状态（“运行运行”cmd）进入进入C盘盘“cd”进入包含序列数据的进入包含序列数据的bin目录下目录下“cd blastbin”察看目录下内容察看目录下内容“dir”格式化数据库格式化数据库db“formatdb-i db-p T”运行运行blastx “blastall-p blastx-i in-d db-o out-e 2e-5-m 9”察看结果察看结果“more out”或在或在 windows下双击打开下双击

25、打开输入输入数据库类型：数据库类型：F/TBlast程序程序 序列输入序列输入 数据库数据库 结果输出结果输出输入输入“cd”-回车回车回到安装目录回到安装目录C盘盘输入输入“cd blastbin”-回车回车到达到达blast程序下程序下bin文件夹文件夹输入输入“dir”-回车回车察看察看bin文件夹下内容文件夹下内容bin文件夹下包含文件夹下包含以以.exe为后缀的程序为后缀的程序文件以及这次实习文件以及这次实习需要用到的数据可需要用到的数据可文件文件“bd”和目标序和目标序列文件列文件“in”输入输入“more db”-回车察看回车察看db文件内容文件内容空格键翻页输入“q”跳出输入输

26、入“formatdb-i db-p T”-回车回车对对db数据库进行格式化数据库进行格式化输入输入“dir”-回车回车察看察看bin文件夹下内容文件夹下内容格式化以后产生的文件格式化以后产生的文件输入输入“blastall-p blastx-i in-d db-o out-e 2e-5-m 9”-回车回车运行运行blastx程序程序产生的结果文件产生的结果文件“out”用用”more out”察看结果文件察看结果文件不使用不使用-m参数时参数时比对结果显示序列两两比对比对结果显示序列两两比对用用”more out”察看结果文件察看结果文件多序列比对的目的多序列比对的目的 从物种的一些分子特性出

27、发，从而了解物种之从物种的一些分子特性出发，从而了解物种之间的生物系统发生的关系。间的生物系统发生的关系。通过序列同源性的比较进而了解基因的进化以通过序列同源性的比较进而了解基因的进化以及生物系统发生的内在规律。及生物系统发生的内在规律。多序列比对的应用：多序列比对的应用：系统发育分析系统发育分析(phylogenetic analysis)(phylogenetic analysis)结构预测结构预测(structure prediction)(structure prediction)序列基序鉴定序列基序鉴定(sequence motif(sequence motif identifica

28、tion)identification)功能预测功能预测(function prediction)(function prediction)ClustalW/ClustalXClustalW/ClustalX：一种全局的多序列比：一种全局的多序列比对程序，可以用来绘制亲缘树，分析进化关对程序，可以用来绘制亲缘树，分析进化关系。系。MEGA4MEGA4ClustalW/XClustalW/X的运行的运行 本地运行本地运行 命令行操作的命令行操作的Clustal WClustal W（linux&windows)linux&windows)窗口化操作的窗口化操作的ClustalXClustalX（

29、windowswindows）下载页面：下载页面：ftp:/ftp.ebi.ac.uk/pub/software/欧洲生物学中心（欧洲生物学中心（EBI）还提供了）还提供了Clustal W的网上的网上运行服务运行服务（http:/www.ebi.ac.uk/clustalwhttp:/www.ebi.ac.uk/clustalw)目标序列目标序列各种参数设定各种参数设定下载下载ClustalXJalview结果下载结果下载点击Start Jalview打开java程序窗口上机实习上机实习3 3：本地运行：本地运行ClustalXClustalX17-RNASE1.fasta 多序列比对多序列

30、比对（Multiple Alignment）在在C:zcni实习实习1Clustalx2文件夹下，找到文件夹下，找到clustalx.exe双击打开双击打开ClustalX窗口窗口点击点击File下拉菜单中下拉菜单中Load sequences选项，选项，打开序列文件打开序列文件17-RNASE1.fasta.txt打开后的界面打开后的界面点击进行多序列比对点击进行多序列比对可在可在Alignment下拉菜单中的下拉菜单中的Alignment Parameters中设定各个参数中设定各个参数点击点击Alignment下拉菜单中的下拉菜单中的Do Complete Alignment进行比对进行

31、比对比对结果比对结果“*”、“:”、“.”和空格依次代表改位点的序列一致性由高和空格依次代表改位点的序列一致性由高到低到低MEGA4一个关于序列分析及比较一个关于序列分析及比较统计的工具包统计的工具包包含距离建树包含距离建树,MP等建等建树法树法自动或手动进行序列比对；自动或手动进行序列比对；推断进化树；推断进化树；估算分子进化率，进行进化假设测验；估算分子进化率，进行进化假设测验；联机进行数据库搜索；联机进行数据库搜索；MEGA4MEGA4可以识别可以识别fastafasta格式文件格式文件将将17-RNASE1.fasta.txt17-RNASE1.fasta.txt重命名为重命名为17-

32、RNASE1.fasta17-RNASE1.fasta选择打开方式为选择打开方式为MEGA4，打开，打开17-RNASE1.fasta，自动跳，自动跳出序列窗口出序列窗口用用ClustalW做多序列联配做多序列联配ClustalW参数设置参数设置以以.meg格式保格式保存结果存结果回到回到MEGA主窗口主窗口激活所保存的文件（激活所保存的文件（.meg）编辑标注编辑标注 保守区域标注保守区域标注 不匹配的区域不匹配的区域回到回到MEGA4主窗口构建进化树主窗口构建进化树已被激活的文件已被激活的文件选择选择Bootstrap重重复次数，至少为复次数，至少为100次次四种系统进化树构建方法四种系统

33、进化树构建方法 分化程度较大的远缘序列：分化程度较大的远缘序列：邻位相连法（邻位相连法（neighbor-joining，NJ）最小进化法（最小进化法（ME）分化程度较小的近缘序列：分化程度较小的近缘序列：最大简约法（最大简约法（MP）除权配对法（除权配对法（UPGMA）进化树的可靠性分析BootstrapMethod从排列的多序列中随机有放回的抽取某一列，构成相同长度的新的排列序列重复上面的过程，得到多组新的序列对这些新的序列进行建树，再观察这些树与原始树是否有差异，以此评价建树的可靠性至少进行100次重复取样原始数据多序列比对结果对序列中每个位置重复抽样，基于原比对结果生成多个样本Orig

34、inal treeBootstrap consensus tree节点上的值为通过节点上的值为通过Bootstrap检验的次数检验的次数不同树型不同树型Tree:树型选择树型选择Branch:分支信息修改分支信息修改Label:分支名称修改分支名称修改Scale:标尺设定标尺设定Cutoff:cutoff值值软件网址说明ClustalXhttp:/bips.u-strasbg.fr/fr/Documentation/ClustalX/图形化的多序列比对工具ClustalWhttp:/www.cf.ac.uk/biosi/research/biosoft/Downloads/clustalw.h

35、tml命令行格式的多序列比对工具GeneDochttp:/www.psc.edu/biomed/genedoc/多序列比对结果的美化工具BioEdithttp:/www.mbio.ncsu.edu/BioEdit/bioedit.html序列分析的综合工具MEGAhttp:/ 最大简约法最大简约法(maximumparsimony,MP)(maximumparsimony,MP)对所有可能的拓扑结构进行计算，并计算出对所有可能的拓扑结构进行计算，并计算出所需替代数最所需替代数最小小的那个拓扑结构，作为最优树。的那个拓扑结构，作为最优树。基于距离矩阵基于距离矩阵 UPGMA(Unweighted

36、Pair-UPGMA(UnweightedPair-GroupMethodusingAnathematicAverage)GroupMethodusingAnathematicAverage)将类间距离定义为两个类成员距离的平均值，广泛应用于将类间距离定义为两个类成员距离的平均值，广泛应用于距离矩阵距离矩阵 NJNJ（Neighbor-joiningNeighbor-joining）把所有把所有n n个序列两两比对，构建个序列两两比对，构建NJNJ树（起指导作用），每树（起指导作用），每个对比后的成对序列都可以跟第三条序列或者另一个新的个对比后的成对序列都可以跟第三条序列或者另一个新的alig

37、nmentalignment比对，按照距离远近，用来决定下一个参与比对，按照距离远近，用来决定下一个参与比对的序列比对的序列最大简约法（最大简约法（MPMP）不需要处理大量核苷不需要处理大量核苷酸或者氨基酸替代酸或者氨基酸替代存在较多的回复突存在较多的回复突变或平行突变，而被变或平行突变，而被检验的序列位点数又检验的序列位点数又比较少的时候，可能比较少的时候，可能会给出一个不合理的会给出一个不合理的或者错误的进化树推或者错误的进化树推导结果导结果UPGMAUPGMA所有分支突变率相近所有分支突变率相近突变率相差较大时突变率相差较大时（现已较少使用）（现已较少使用）邻接法（邻接法（NJNJ）远源序列远源序列对相似度很低的序对相似度很低的序列，往往出现列，往往出现Long-Long-branch attractionbranch attraction（LBALBA，长枝吸引现，长枝吸引现象），严重干扰进化象），严重干扰进化树的构建树的构建