微生物遗传育种论文格式及要点(最后)课件.ppt

1、高通量筛选技术高通量筛选技术High throughput screening 王 陶2013年4月 高通量筛选最初是伴随组合化学而产生的一种药物筛选方式。1990年末，组合化学的出现改变了人类获取新化合物的方式，人们可以通过较少的步骤、在短时间内同时合成大量化合物，在这样的背景下高通量筛选的技术应运而生。高通量筛选技术可以在短时间内对大量候选化合物完成筛选，经过近十年的发展，已经成为比较成熟的技术，不仅仅应用于对组合化组合化学库学库的化合物筛选，还更多地应用于对现有化合物库现有化合物库的筛选。目前世界各大药物生产商都建立有自己的化合物库和高通量筛选机构，对有潜力形成药物的化合物进行篦梳式的筛

2、选。我国药物高通量筛选起步较晚，且不规范，仅有十多年的研究历史。1996年中国医学科学院引进国内第一台Bionek2000型实验自动化工作站；1998年又引进全国第一台Topcount微量闪烁计数器，使放射配基实验、放射免疫实验等技术微量化、自动化。上海药物研究所、北京军事医学科学院分别成立了药物筛选专门机构，开始从事大规模筛选工作。西安交通大学药学院贺浪冲教授首创的细胞膜色谱细胞膜色谱（CMC）为化合物的体外高通量筛选提供了高选择性、高特异性、高效率的筛选手段。CMC已成功用于钙离子拮抗剂受体配体结合反应钙离子拮抗剂受体配体结合反应的研究，目前正在进行心血管化学合成药物的高通量筛选和中药有效

3、部位及有效成分的寻找。今年将建立CMC自动化筛选体系，促进我国药物高通量筛选技术的全面发展。l高通量筛选(High throughput screening，HTS)技术是指以分子水平和细胞水平的实验方法为基础，以微板形式作为实验工具载体，以自动化操作系统执行试验过程，以灵敏快速的检测仪器采集实验结果数据，以计算机对实验数据进行分析处理，同一时间对数以千万样品检测，并以相应的数据库支持整体运转的技术体系。l高通量细胞筛选技术(high-throughput cell-based screening technology)是以高通量方式研究基因功能最有效的方法之一。通常,基因功能的初步筛选在96

4、 孔或384 孔板上进行,通过基因转染将候选基因导入细胞,或直接将基因表达产物加入细胞培养液中。是20世纪80年代后期发展起来的一种筛选新技术。它集计算机控制、自动化操作、高灵敏度检测、数据结果自动采集和处理于一体，实现了筛选的快速、微量、灵敏和大规律，日筛选量达到数万甚至数十万样品次，是筛选技术和方法的一大进步。l筛选测定方法基于要研究的生物学或医学问题,例如,要研究抗血管生成活性,选用内皮细胞进行细胞生长、分化、迁移和粘附等分析测定;研究免疫调节活性,可选择淋巴细胞或造血细胞进行细胞生长和分化的分析测定;研究神经营养因子活性,可选用神经细胞进行细胞存活、突起生长测定。除上述与细胞表型或形态

5、学相关的检测指标外,细胞信号转导通路、糖代谢、能量产生和代谢产物分析(metabolic control analysis)等代谢通路也是基因功能重要的研究内容。l结合抗体芯片技术、多路测定技术(multiplexing)等新的检测方法,高通量细胞筛选的应用更为广泛。另外,随着荧光成像读板仪(fluorescence image plate reader,FLIPR)、定量PCR、高通量荧光激活细胞分类器(HT-FACS)等检测方法和技术的不断发展和应用,灵敏度和重现性这两个高通量细胞筛选的关键问题也逐步得以解决。Whatman过滤型做孔板是种多孔形状物体，便于快速和批量处理样品。板上刻有号码

6、适合于各种微孔板配用仪器和白动控制装置。Boekel 微孔板振荡器的特点独立设定温度，振荡速度和混合时间；混匀器可以编程设定运行一定时间或者瞬时混合3秒；内置的盖可以减少污染，样品挥发或者噪音的危险。一次性吸取大量液体，然后每次按动按钮，仅仅释放小量等体积的液体。大量液体进行等体积分装1.大容量，可自动处理12个96孔反应板或480个试管的样品。2.特别适合于HPLC或LC/MS的样品处理。3.使用709软件，有易用的图示管架编辑器。4.无论开口试管或密封试管都有很高精确度。5.Micro215进样量可低至0.5ul。6.多通道215自动样品处理系统可同时处理8个样品。微孔板检测设备之一，集成

7、4大功能模块，可进行放射性/非放射性检测。C6 流式细胞仪系统是一种全功能、双激光、六探测器的流式细胞仪分析系统，C6流式细胞仪系统的探测器不但可灵敏的捕获前散射光和旁散射光，还有四个可调光学滤光片的荧光探测器。CFlow操作软件使搜集数据和分析变的简单快速。高集成度、高度自动化的主机，以及优良人机界面、操作简便的CFlow软件系统 高通量平行合成仪液相芯片检测仪微孔过滤板 条形码(barcode)是将宽度不等的多个黑条和空白，按照一定的编码规则排列，用以表达一组信息的图形标识符。常见的条形码是由反射率相差很大的黑条（简称条）和白条（简称空）排成的平行线图案。条形码可以标出物品的生产国、制造厂

8、家、商品名称、生产日期、图书分类号、邮件起止地点、类别、日期等许多信息，因而在商品流通、图书管理、邮政管理、银行系统等许多领域都得到了广泛的应用。lSAS（Statistical Analysis System，统计分析系统）是当今国际最著名的数据分析软件系统。lSAS：数据的输入输出和整理、描述性统计、假设检验、图形的制作、回归分析、多元统计分析、方差分析、协方差分析和时间序列分析等。l数据访问，数据管理，数据呈现，数据分析lSPSSlEXCELl微孔板的使用和光学检测法l工程菌株的裂解l报告基因l流式细胞技术l蛋白质芯片l化学发光指化学反应过程中发射出来的光，又称冷光；l生物发光是化学发光

9、的一种，专指由酶催化的化学反应过程中发射出的光。l化学和生物发光经常被用于测定样品中未知成分的量，并且在过去的十年里在基因表达和基因调控的研究中发挥着非常重要的作用。l通过发射光的比率可以推出未知成分的浓度，因此测定化学反应过程中的发射光是非常有用的。反应过程中产生的光与发射光的量产率是直接相关的，相应的，与发光物质的浓度成比例。l因此，反应过程中的光可以相对反映出目标样品中发光物质的量。lATP（三磷酸腺甙）检验、荧光素酶检验 l免疫及proteomics l核酸，DNA及基因组 l病毒研究（比如：SARS、禽流感病毒研究）l临床诊断研究 l染色体分析 l毒性试验 l细胞活力试验 l餐馆卫生

10、检测l环境检测l工业、农林业、畜牧业、养殖业等其它用途l最广泛的用途是对利用报告基因检测目标基因的表达以及检测细胞内 ATP 水平。l分子生物学家和细胞生物学家利用报告基因研究基因的表达和调控。l将报告基因引入细胞 DNA 使之与某一特定分子事件相关，可以为这一分子事件带来可测性。通常检测的分子事件是基因功能，具有可测性的是发光。l目前，市场上有许多发光报告基因出售。包括：萤火虫荧光素酶（firefly luciferase），半乳糖苷酶（B-galactosidase），葡萄糖苷酸酶（B-glucuronidase，GUS），碱性磷酸酶（alkaline phosphatase），和人生长激

11、素（human growth hormone，hGH）。l高灵敏度，低成本，快速以及使用简单使得发光检测仪成为理想的基因表达研究工具。l所有活细胞都含有 ATP。ATP 可以从细胞中提取出来，用萤火虫荧光素酶检测。在这个发光反应中，ATP 是限制性反应物。l因此，到达发光检测仪光电倍增管的光与样品中 ATP 的含量成比例，相应的与提取 ATP 所用的细胞数成比例。ATP发光检测方法已经使用了几十年。lATP的发光检测方法可以检测样品中的所有微生物，因而被用于检测水中的大肠杆菌含量，包括饮用水和用于oil field injection，cooling system 以及纸加工过程的工业用水。A

12、TP的发光检测方法还可以用于药品，化妆品，牛奶以及其它食品的微生物控制。l1、样品库l2、初筛和复筛l3、活性化合物l4、深入筛选l5、获得少量先导化合物l6、确证筛选药物药理学研究l7、侯选药物l8、临床前研究第一步是选择分子靶。选择的依据是来源于国际医学生物学的新成果。目前国际常用的分子靶有以下几类：A、细胞膜受体；B、离子通道蛋白；C、酶蛋白；D、细胞核受体；E、转运蛋白。第二步是建立稳定表达分子靶的生物体系。靶是蛋白-克隆相对应的蛋白，在大肠杆菌中表达和提纯；靶是细胞受体-克隆出的基因转化到载体细胞中，建立稳定的细 胞株。第三步建立简便快速的大规模的生物检测方法。根据靶的不同分为两类：

13、1、以蛋白等分子为基础；2、以 细胞为基础 酶蛋白-测定酶活性的变化；细胞膜受体-测定配体-受体的结合；细胞核受体-测定蛋白的表达。在建立大规模生物检测方法的同时，要用组合化合物的方法合成大量不同结构的化合物库相配套。（1）、分子靶点筛选模型-细胞信号通路细胞信号通路筛选系统 外界信号从细胞表面传递到细胞内，或者直接穿过细胞膜进入到细胞质和细胞核，最终影响某些基因的转录。在这个传递过程中，某些特殊的细胞或一些病理状况下，可能是其中的一条或几条通路起作用，药物可以根据需要对这些通路进行阻断对这些通路进行阻断。使用信号通路筛选系统，可直接对药物作用的分子机制有所了解。（2 2）、细胞膜表面受体筛选

14、模型）、细胞膜表面受体筛选模型 a.Ga.G蛋白耦联受体蛋白耦联受体：受体与GTP结合的调节蛋白的耦联，在细胞内产生cAMP，从而将外界信号跨膜传递到细胞内。如趋化因子受体、-受体阻断剂等。b.催化受体催化受体：为单跨膜受体，分为胞外区，跨膜区和胞内区。当细胞因子与胞外区结合后，引起多个受体单体的聚合，每个聚合体的受体单体可以是同一类型，也可以不同。如EPO、G-CSF、GH受体2个同样的单体；IL-1，GM-CSF，IL-6受体是2个不同的单体；TNF-是3个同样的单体；IL-2是3个不同的受体。c.离子通道耦联受体离子通道耦联受体：细胞表面一些神经递质的受体，自身是一些离子通道，或者与离子

15、通道相耦联。当与配体结合时，受体构象改变，通道开放，离子进出细胞，引起电兴奋。l第四章 微生物杂交育种 1、放线菌杂交方法有哪些？简述每种方法的具体过程？l第五章 基因工程育种 1、简述基因体外定位诱变的方法。l 第六章 高通量筛选技术 1、简述表面展示技术的方法。2、什么是报告基因？作为报告基因，在遗传选择和筛选检测方面应具备哪些条件？常见报告基因有哪些？l写一篇与微生物遗传育种相关的综述。字数不低于4000字。l期末成绩=平时20%+实验20%+论文60%课程论文占课程论文占60%60%，其评分标准如下：，其评分标准如下：l1 1）选题新颖（热点问题的研究、空白问题的探索、老问题）选题新颖

16、（热点问题的研究、空白问题的探索、老问题的新视野）（的新视野）（10 10分）分）l2 2）结构合理、行文流畅、逻辑严谨、学术语言规范（）结构合理、行文流畅、逻辑严谨、学术语言规范（2020分分）l3 3）观点鲜明、资料翔实、立论深刻、有所创新（）观点鲜明、资料翔实、立论深刻、有所创新（3030分）分）l4 4）注释与参考文献（文献数量、种类、外文文献）（）注释与参考文献（文献数量、种类、外文文献）（10 10分分）l5 5）规范程度：题目、内容提要、关键词、正文、注释、参）规范程度：题目、内容提要、关键词、正文、注释、参考文献（考文献（2020分）分）l6 6）总结全文的主要论点和发展方向，

17、指出目前研究中尚需）总结全文的主要论点和发展方向，指出目前研究中尚需解决的问题及研究成果的意义和价值。（解决的问题及研究成果的意义和价值。（10 10分）分）l7 7）字数不少于）字数不少于40004000字，每少字，每少100100字扣字扣1 1分。分。l1 1、题名（、题名（黑体，小三，居中黑体，小三，居中）l2 2、姓名、班级、学号（、姓名、班级、学号（仿宋、小四、居中仿宋、小四、居中）l3 3、摘要：对全文进行概括，提出研究目的与意义、摘要：对全文进行概括，提出研究目的与意义，论文主要内容，论文主要内容，150150字左右（字左右（五号，楷体，首行五号，楷体，首行缩进缩进2 2字符，行

18、距固定值字符，行距固定值2020磅。磅。“摘要摘要”二字加粗二字加粗）l4 4、关键词：、关键词：3838个（个（五号，楷体，首行缩进五号，楷体，首行缩进2 2字符字符，各关键词之间加分号；最后一词之后不加标点符，各关键词之间加分号；最后一词之后不加标点符号。号。“关键词关键词”三字加粗三字加粗）l5 5、正文、正文五号宋体（全文所有西文字体均采用五号宋体（全文所有西文字体均采用Times New RomanTimes New Roman），首行缩进），首行缩进2 2字符，行距固定字符，行距固定值值2020磅。磅。l6 6、前言：简要介绍研究背景，研究现状（不要与、前言：简要介绍研究背景，研究

19、现状（不要与摘要重复）摘要重复）l7、正文标题采用编码格式，、正文标题采用编码格式，一级标题加粗一级标题加粗，示例，示例如下：如下：1 1 空间诱发微生物突变的作用机制研究空间诱发微生物突变的作用机制研究 2 2 微生物空间诱变的研究与进展微生物空间诱变的研究与进展 2.12.1空间诱变对微生物产酶活性的影响空间诱变对微生物产酶活性的影响 2.22.2空间诱变对微生物产次级代谢产物活性的影响空间诱变对微生物产次级代谢产物活性的影响 2.3 3 3 问题和展望问题和展望 3.1 l9 9、正文最后要有结语（或展望）。对全文作总结，、正文最后要有结语（或展望）。对全文作总结，可指出目前研究中存在的

20、问题，今后发展的方向。可指出目前研究中存在的问题，今后发展的方向。l1010、参考文献格式按照国标、参考文献格式按照国标GB7714-2005GB7714-2005参考文献参考文献著录规则著录规则要求。参考文献不少于要求。参考文献不少于1010篇。篇。1 刘某，张某，王某，等企业文化与核心竞争力刘某，张某，王某，等企业文化与核心竞争力J 经经济管理，济管理，2002，(17)：6-92 Cochran J K,Qual B K PA microcomputer system for qualitativfe simulationJ.Simulation,1990,58(11):300-308.3 张某企业组织创新研究张某企业组织创新研究M 北京：科学出版社，北京：科学出版社，2000：88-1184 张某地质力学系统理论张某地质力学系统理论D 武汉：中国地质大学，武汉：中国地质大学，2001