分子生物学常用技术上课件.ppt

1、分子生物学常用技术分子生物学常用技术PCR产物产物A-T克隆克隆测序测序重组表达载体重组表达载体重重 组组 蛋蛋 白白制备抗体制备抗体转转 染染 细细 胞胞原核表达载体原核表达载体真核表达载体真核表达载体病毒表达载体病毒表达载体昆虫表达载体昆虫表达载体酵母表达载体酵母表达载体检测活性检测活性体内、体外体内、体外作用机制作用机制应用应用 (1)PCR (2)核酸的纯化：凝胶回收核酸的纯化：凝胶回收Kit (3)连接反应：连接反应：16过夜过夜/22 2h (4)CaCl2法制备感受态细胞：法制备感受态细胞：Kit (5)宿主菌的转化及蓝白筛选宿主菌的转化及蓝白筛选 (6)挑克隆：挑克隆：2ml

2、含抗生素的含抗生素的LB (7)提质粒：提质粒：Kit (8)重组质粒的鉴定：双酶切反应重组质粒的鉴定：双酶切反应、菌落、菌落PCR (9)测序：生物技术服务公司测序：生物技术服务公司 (10)菌种保存菌种保存:2030%甘油甘油-LB，-20/-70 步骤：步骤：(11)外源基因在哺乳动物细胞中的表达：质粒转染、电转染外源基因在哺乳动物细胞中的表达：质粒转染、电转染(12)目的基因表达的鉴定：目的基因表达的鉴定：RT-PCR、Northern Blot、原位杂交、原位杂交、Southern Blot(13)目的蛋白表达的检测：目的蛋白表达的检测：原核表达原核表达：SDS-PAGE(重组蛋白诱

3、导表达的重组蛋白诱导表达的诱导剂浓度诱导剂浓度、诱导时间和温度、诱导时间和温度、重组蛋白表达的形式重组蛋白表达的形式)、WB 真核表达：真核表达：Western Blot、ELISA、免疫组化、免疫组化(14)重组蛋白的纯化：亲和层析，重组蛋白的纯化：亲和层析，His-tag/GST-tag(15)制备抗体：多抗和单抗制备抗体：多抗和单抗(16)基因功能检测：提高基因功能检测：提高/降低表达水平降低表达水平 细胞周期检测：流式细胞仪细胞周期检测：流式细胞仪 细胞增殖检测：细胞增殖检测：MTT 细胞凋亡检测细胞凋亡检测:流式细胞仪、流式细胞仪、TUNEL、DNA Ladder 抑瘤活性检测：体外

4、、体内抑瘤活性检测：体外、体内 对血管化的影响对血管化的影响 。(17)作用机制作用机制1.PCR：Pfu,加加A尾；尾；1208/8:002.Agarose电泳：电泳：Goldview染色染色;12083.核酸纯化：凝胶回收核酸纯化：凝胶回收Kit;12084.Agarose电泳：检测回收条带电泳：检测回收条带;12084.连接反应：连接反应：pGMT,22 2h;12085.转化：转化：Top10,热激法热激法，蓝白筛选。，蓝白筛选。1208实验一实验一1.挑克隆：挑克隆：2ml 含抗生素的含抗生素的LB+1个克隆；个克隆；1209/9:002.提质粒：提质粒：Kit；1210/8:003

5、.重组质粒的鉴定：双酶切反应，重组质粒的鉴定：双酶切反应，37 2h；12104.Agarose电泳：电泳：Goldview染色；染色；12105.测序和序列比对：生物技术服务公司；测序和序列比对：生物技术服务公司；12136.菌种保存菌种保存:2030%甘油甘油-LB，-20/-70。1215实验二实验二实验三实验三1.转化：转化：BL21,热激法；热激法；12082.挑克隆：挑克隆：2ml 含抗生素的含抗生素的LB+1个克隆；个克隆；1209/9:003.转接：转接：1%过夜菌过夜菌+2ml 含抗生素的含抗生素的LB,2管管;1210/8:004.诱导：诱导：0.5mM和和0.1mM的的I

6、PTG（终浓度）（终浓度）;12105.碎菌：超声处理碎菌：超声处理;1215/8:006.SDS-PAGE：10%分离胶分离胶，考兰染色，脱色。，考兰染色，脱色。1215实验四实验四1.SDS-PAGE：10%分离胶分离胶；12152.转膜：湿转；转膜：湿转；12153.封闭：封闭：RT 1h；12154.Ab1：4 过夜过夜；12155.Ab2：RT 40min；1216/8:006.ECL：RT 5min；1216实验实验 XXX1.设备：设备：加样器加样器2.耗材耗材3.试剂和配制方法：详细试剂和配制方法：详细4.步骤：详细步骤：详细1.核酸的分离纯化和鉴定核酸的分离纯化和鉴定:基因组

7、基因组DNA、总、总RNA、质粒、质粒2.基因的克隆与鉴定方法基因的克隆与鉴定方法3.外源基因转移技术和表达体系外源基因转移技术和表达体系4.检测方法：电泳技术：检测方法：电泳技术：agarose、SDS-PAGE 分子杂交分子杂交:SB、NB、WB、基因芯片技术、基因芯片技术 DNA序列测定序列测定 生物信息学分析技术生物信息学分析技术5.基因功能研究的方法基因功能研究的方法6.组学研究技术：基因组学、蛋白质组学组学研究技术：基因组学、蛋白质组学内容内容核酸的基本组成核酸的基本组成 Albrecht Kossel 1910年诺贝尔生理或医学奖年诺贝尔生理或医学奖揭示核酸的化学成分揭示核酸的化

8、学成分“其对蛋白质，包括核物其对蛋白质，包括核物质的研究工作为我们了解质的研究工作为我们了解细胞化学作出了贡献细胞化学作出了贡献”Lord(Alexander R.)Todd 核苷酸的基本结构核苷酸的基本结构1957年诺贝尔化学奖年诺贝尔化学奖“核苷和核苷辅酶核苷和核苷辅酶”1962年诺贝尔生理或医学奖年诺贝尔生理或医学奖Francis Harry Compton Crick James Dewey Watson Maurice Hugh Frederick Wilkins“发现核酸的分子结构及其对于生命物质信息传递的重要意义发现核酸的分子结构及其对于生命物质信息传递的重要意义”DNA分子的二

9、级结构分子的二级结构 5末端末端(游离磷酸基游离磷酸基)3末端末端(游离羟基游离羟基)数量庞大数量庞大dNTP(dATP,dCTP,dGTP,dTTP)3，5-磷酸二酯键磷酸二酯键(共价键共价键)直线形多聚体直线形多聚体方向方向:5-3，5 CAG.3特点特点DNA半保留复制半保留复制变性与复性变性与复性变性：指核酸双螺旋区的氢键断裂，变成单链，变性：指核酸双螺旋区的氢键断裂，变成单链，不涉及共价键断裂，不引起分子量降低。不涉及共价键断裂，不引起分子量降低。一、核酸的分离、纯化和鉴定一、核酸的分离、纯化和鉴定1.基因组基因组DNA的分离、纯化：的分离、纯化：PCR、Southern-blot、

10、构建基因组文库、构建基因组文库实验材料：哺乳动物组织实验材料：哺乳动物组织(50100mg)哺乳动物细胞哺乳动物细胞(5x105107)六孔板六孔板/T25实验步骤：实验步骤：RT 匀浆：匀浆：TE pH8.0 组织组织(液氮冻存、研磨液氮冻存、研磨)消化：消化：EDTA、SDS、蛋白酶、蛋白酶K、RNase、37/55 抽提：酚、氯仿、异戊醇抽提：酚、氯仿、异戊醇 沉淀：异丙醇沉淀：异丙醇/NaAc+无水乙醇无水乙醇 洗涤：洗涤：75乙醇乙醇 干燥：风干干燥：风干 溶解：溶解：TE/H2O 注意事项：注意事项：(1)试剂：试剂：pH值准确值准确 (2)蛋白酶蛋白酶K：20mg/ml，分装，分

11、装，-20，避免反复冻融，避免反复冻融 (3)抽提：完全，不要触及蛋白层抽提：完全，不要触及蛋白层 (4)干燥：避免过分干燥：避免过分 (5)操作操作：小心，机械小心，机械剪剪切作用，切作用，80100kb 2.总总RNA的分离纯化的分离纯化:略略3.质粒：质粒：细菌等微生物细胞细菌等微生物细胞染色体以外染色体以外，能，能独立独立进行进行 复制和遗传，赋予宿主细胞一定生物学复制和遗传，赋予宿主细胞一定生物学性状性状 的共价的共价闭环双链闭环双链DNA分子。分子。合格质粒的组成要素合格质粒的组成要素复制起始位点：原核复制起始位点：原核1 1个，真核多个个，真核多个抗性基因抗性基因多克隆位点多克隆

12、位点启动子启动子增强子增强子终止信号终止信号加加polyApolyA信号信号第二步：筛选标记：如抗性，决定使用什么筛选标记：第二步：筛选标记：如抗性，决定使用什么筛选标记：（1）Ampr：水解：水解-内酰胺环，解除氨苄的毒性。内酰胺环，解除氨苄的毒性。（2）tetr：可以阻止四环素进入细胞。：可以阻止四环素进入细胞。（3）camr：生成氯霉素羟乙酰基衍生物，使之失去毒性。：生成氯霉素羟乙酰基衍生物，使之失去毒性。（4）neor：氨基糖苷磷酸转移酶：氨基糖苷磷酸转移酶 使使G418（长那霉素衍生物）失活。（长那霉素衍生物）失活。（5）hygr：使潮霉素使潮霉素失活。失活。如何阅读质粒？如何阅读质

13、粒？第一步：质粒类型：第一步：质粒类型：OriOri位置，原核位置，原核/真核真核/穿梭质粒；穿梭质粒；第三步：多克隆位点，内切酶位点第三步：多克隆位点，内切酶位点第四步：外源基因插入片段大小，第四步：外源基因插入片段大小，10kb，大选大小找小大选大小找小第五步：表达系统元件：启动子第五步：表达系统元件：启动子-核糖体结合位点核糖体结合位点-克隆位点克隆位点-转录终止信号。转录终止信号。克隆载体克隆载体/表达载体表达载体 碱裂解法碱裂解法收菌收菌重悬：重悬：T E-葡萄糖葡萄糖裂解：变性，裂解：变性，NaOH-SDS 5min中和：复性，中和：复性，KAc抽提：酚抽提：酚:氯仿氯仿:异戊醇异

14、戊醇(25:24:1)沉淀：异丙醇沉淀：异丙醇洗涤：洗涤：70乙醇乙醇溶解：溶解：TE-RNase AKit:DNA介质介质(硅胶、玻璃奶硅胶、玻璃奶)Omega：Plasmid Mini KitI D6943-01？纯化：纯化：氯化铯氯化铯-溴化乙锭梯度平衡离心溴化乙锭梯度平衡离心 聚乙二醇分级沉淀法聚乙二醇分级沉淀法 4、核酸纯度的鉴定、核酸纯度的鉴定OD260和和OD280应大于应大于0.05OD260：DNA,RNA;OD280：蛋白质：蛋白质浓度：浓度：1OD260：50g/ml 双链双链 DNA 40g/ml 单链单链 DNA，总，总RNA 35g/ml 单链单链RNA 20g/m

15、l 单链寡核苷酸单链寡核苷酸纯度纯度:OD260/OD280 ：蛋白质污染程度，：蛋白质污染程度，DNA 1.8，RNA 1.72.1 OD260/OD230：碳水化合物污染程度，：碳水化合物污染程度，2.0 二、基因的克隆与鉴定方法二、基因的克隆与鉴定方法1.基因的化学合成基因的化学合成2.目的基因的克隆策略目的基因的克隆策略 (1)根据已知碱基或氨基酸序列克隆基因根据已知碱基或氨基酸序列克隆基因 (2)根据表型变异克隆基因根据表型变异克隆基因 (3)基于图谱的基因克隆方法基于图谱的基因克隆方法3.文库的构建与目的基因的克隆文库的构建与目的基因的克隆 4.PCR反应与目的基因的克隆反应与目的

16、基因的克隆5.目的基因克隆的鉴别与分析目的基因克隆的鉴别与分析 1.基因的化学合成基因的化学合成前提条件：已知基因的核苷酸序列或蛋白质的氨基酸序列前提条件：已知基因的核苷酸序列或蛋白质的氨基酸序列适用：分子量较小、价值极高的目的基因适用：分子量较小、价值极高的目的基因历史：历史：1979年，年，Khorana等首次合成等首次合成E coli酪氨酸酪氨酸tRNA基因基因方法：磷酸二酯法、磷酸三酯法、亚磷酸三酯法方法：磷酸二酯法、磷酸三酯法、亚磷酸三酯法方式：固相合成法和自动合成法方式：固相合成法和自动合成法2.目的基因的克隆策略目的基因的克隆策略(1)根据已知碱基或氨基酸序列克隆基因根据已知碱基

17、或氨基酸序列克隆基因 a.一个基因的序列已知：一个基因的序列已知：PCR技术，目的技术，目的DNA片段片段b.一个基因的一段碱基序列已知：一个基因的一段碱基序列已知：反向反向PCR/RACE，cDNA全长；全长；探针：筛选探针：筛选cDNA文库，文库，cDNA全长全长c.一个或多个物种的某种基因序列已知：同源性比较，一个或多个物种的某种基因序列已知：同源性比较，保守序列，探针保守序列，探针/引物，文库筛选引物，文库筛选/PCR，从新物种中，从新物种中 分离功能相似的基因分离功能相似的基因d.已知蛋白质的氨基酸序列：密码子的兼并性，可能的已知蛋白质的氨基酸序列：密码子的兼并性，可能的 核苷酸序列

18、，探针，筛选基因组核苷酸序列，探针，筛选基因组/cDNA文库，基因序列文库，基因序列 (2)根据表型变异克隆基因：未知序列基因的克隆根据表型变异克隆基因：未知序列基因的克隆转座子示踪技术：又称转座子标签法，酵母和植物转座子示踪技术：又称转座子标签法，酵母和植物转座子转座子DNA显性目的基因的纯合亲本显性目的基因的纯合亲本隐性纯合亲本隐性纯合亲本F1：理论上全部为目的基因编码的显性特征：理论上全部为目的基因编码的显性特征筛选因转座子插入而表现出隐性性状的个体筛选因转座子插入而表现出隐性性状的个体构建基因组文库构建基因组文库带有目的基因的阳性克隆带有目的基因的阳性克隆探针：转座子探针：转座子DNA

19、构建基因组文库构建基因组文库转座子两侧的目的基因序列转座子两侧的目的基因序列筛选筛选编码显性特征编码显性特征的目的基因的目的基因 a.提总提总RNA:具有对比意义的两组具有对比意义的两组，注意痕量注意痕量DNA的污染的污染 b.反转录：得到细胞内所有基因的反转录：得到细胞内所有基因的cDNA库库 下游引物：下游引物：12组，组，T12MN(M:A、C、G;N:A、C、G、T)c.PCR扩增：扩增：32P，35S 上游引物：上游引物：2426组，组，10mer 下游引物：同反转录下游引物：同反转录 共计共计288312种种PCR反应反应mRNA 差异显示：差异显示：DD-PCR，1992，只能分

20、离与某种，只能分离与某种 处理或特征有关的基因处理或特征有关的基因步骤：步骤：d.电泳：测序胶或非变性聚丙烯酰胺凝胶，放射自显影电泳：测序胶或非变性聚丙烯酰胺凝胶，放射自显影e.克隆：克隆：PCR差异带的回收、扩增和克隆差异带的回收、扩增和克隆 f.Northern blotting鉴定：排除假阳性鉴定：排除假阳性g.序列分析：序列分析：Blast，递交新序列，递交新序列h.全长基因：全长基因：RACE或或筛选筛选cDNA文库文库i.基因功能研究：生物信息学基因功能研究：生物信息学扩增条件：扩增条件：前前14个循环采用不严格扩增条件个循环采用不严格扩增条件(降低退火温度，降低退火温度，增加引物

21、与增加引物与Mg2+浓度浓度)，促使引物与模板的错配；，促使引物与模板的错配；后续后续PCR循环则采用严格的扩增条件。循环则采用严格的扩增条件。基因片段的开放读框基因片段的开放读框http:/www.ncbi.nlm.nih.gov/gorf/gorf.html氨基酸序列的功能结构域分析氨基酸序列的功能结构域分析http:/www.smart.embl-heidelberg.dehttp:/www.ebi.ac.uk/interproscan/ipsearch.html注意：注意：a.与常规与常规PCR不同，该方法可以保持样品中不同模板的相对比例不同，该方法可以保持样品中不同模板的相对比例;b

22、.由于某一刺激因素常常影响数十由于某一刺激因素常常影响数十、甚至数百基因的表达变化，甚至数百基因的表达变化，但并不是每个基因的表达变化在此过程都起着重要的作用但并不是每个基因的表达变化在此过程都起着重要的作用;c.电泳显示的单一扩增带并不表明它只含有单一的基因。电泳显示的单一扩增带并不表明它只含有单一的基因。优点：操作简单、敏感、快速、重复性好、要求的起始优点：操作简单、敏感、快速、重复性好、要求的起始RNA量量 少、可同时检测某因素作用下表达升高与降低的基因。少、可同时检测某因素作用下表达升高与降低的基因。缺点：缺点：大规模地筛选，假阳性率高，得到的多为短片段，大规模地筛选，假阳性率高，得到

23、的多为短片段，且都靠近且都靠近3 端端发展：发展：EDD、ODD、GDD、LDD、FDD(增强、有序、基因组、长程、荧光增强、有序、基因组、长程、荧光)消减杂交：又称扣除杂交，克隆差异表达的基因消减杂交：又称扣除杂交，克隆差异表达的基因(3)基于图谱的基因克隆方法：依赖于遗传图谱和物理图谱，基于图谱的基因克隆方法：依赖于遗传图谱和物理图谱，可以用来分离与已知分子标记紧密连锁的基因。可以用来分离与已知分子标记紧密连锁的基因。方法：染色体跳查：速度快，方法：染色体跳查：速度快，200kb片段片段 染色体步查：染色体步查：40kb片段片段举例：囊性纤维化跨膜传导调节蛋白举例：囊性纤维化跨膜传导调节蛋

24、白(CFTR)-囊性纤维化囊性纤维化(常隐常隐)亨廷顿病基因亨廷顿病基因(HD)-亨廷顿病亨廷顿病(常显常显)肌营养不良基因肌营养不良基因(MD)-肌营养不良症肌营养不良症(X隐隐)3.文库的构建与目的基因的克隆文库的构建与目的基因的克隆分类：按组成基因文库的重组分类：按组成基因文库的重组DNA片段的供体来源分为两类片段的供体来源分为两类 cDNA文库：重组文库：重组DNA片段来源于细胞表达出的片段来源于细胞表达出的mRNA，用于某类特定细胞中基因组的表达状态以及用于某类特定细胞中基因组的表达状态以及 表达基因的功能鉴定的研究。表达基因的功能鉴定的研究。基因组文库：重组片段供体是某种特定生物个

25、体的基因组基因组文库：重组片段供体是某种特定生物个体的基因组DNA，主要用于基因组物理图谱构建、基因组序列分析、主要用于基因组物理图谱构建、基因组序列分析、基因在染色体上的定位、基因组中基因的结构和基因在染色体上的定位、基因组中基因的结构和 组织形式分析等方面的研究。组织形式分析等方面的研究。基因文库：指采用体外克隆技术得到的一个重组基因文库：指采用体外克隆技术得到的一个重组DNA分子群体。分子群体。噬菌体载体系统：最早使用，装载容量大，适合于全长噬菌体载体系统：最早使用，装载容量大，适合于全长cDNA克隆，克隆，易于长期保存，可采用的文库筛选的方法有限。易于长期保存，可采用的文库筛选的方法有

26、限。质粒载体系统：体外操作简便，载体的可塑性强，可进行功能性筛选，质粒载体系统：体外操作简便，载体的可塑性强，可进行功能性筛选，插入片段的载体容量小，含有长片段的重组克隆易丢失，插入片段的载体容量小，含有长片段的重组克隆易丢失，保存条件严格。保存条件严格。噬菌体载体系统：可进行功能性筛选噬菌体载体系统：可进行功能性筛选哺乳类细胞表达载体：反转录病毒载体是最常用的系统哺乳类细胞表达载体：反转录病毒载体是最常用的系统类型：表达型：采用表达型载体，插入的类型：表达型：采用表达型载体，插入的cDNA片段可表达片段可表达 成融合蛋白，具有抗原或生物学活性，可用成融合蛋白，具有抗原或生物学活性，可用 抗体

27、或某种化合物作为探针进行筛选。抗体或某种化合物作为探针进行筛选。非表达型：只能用核酸探针筛选包含目的基因的克隆。非表达型：只能用核酸探针筛选包含目的基因的克隆。(1)cDNA文库文库步骤：步骤：cDNA合成，连接到质粒合成，连接到质粒/噬菌体载体上，噬菌体载体上，转化或感染大肠杆菌，产生转化或感染大肠杆菌，产生cDNA文库。文库。cDNA =copy DNAcDNA文库的筛选：文库的筛选：a.基于核酸相互杂交分离目的基因基于核酸相互杂交分离目的基因 同源探针：同源探针：mRNA差异显示差异显示 利用种属间基因同源性，从利用种属间基因同源性，从EST数据库中搜寻数据库中搜寻 兼并性寡核苷酸探针兼

28、并性寡核苷酸探针 cDNA探针探针b.基于基因编码蛋白的检测筛选基于基因编码蛋白的检测筛选cDNA表达文库表达文库 噬菌体表面展示系统噬菌体表面展示系统 酵母双杂交系统酵母双杂交系统 酵母单杂交系统酵母单杂交系统(2)基因组文库基因组文库概念：是由大量独立克隆形成的群体，指能够代表某种概念：是由大量独立克隆形成的群体，指能够代表某种 有机体整个基因组的一套克隆。有机体整个基因组的一套克隆。步骤：步骤：DNA样品的制备用限制性内切酶酶切基因组样品的制备用限制性内切酶酶切基因组DNA 电泳分离回收约电泳分离回收约20kb的大片段与限制性内切酶处理的大片段与限制性内切酶处理 的载体连接在体外包装成噬

29、菌体颗粒，侵染大肠杆的载体连接在体外包装成噬菌体颗粒，侵染大肠杆 菌文库的扩增菌文库的扩增载体：载体：噬菌体载体：可容纳噬菌体载体：可容纳20kb的插入片段，易于操作，的插入片段，易于操作，筛选体系完整，容量偏小。筛选体系完整，容量偏小。黏粒载体：载体容量大，可容纳黏粒载体：载体容量大，可容纳45kb的的DNA片段，片段，不易操作。不易操作。4.PCR反应与目的基因的克隆反应与目的基因的克隆发展历史发展历史基本原理基本原理反应体系反应体系常见类型常见类型建立建立PCR实验室实验室 Kary B.Mullis Michael Smith PCR和定点突变突变和定点突变突变1993年诺贝尔化学奖年

30、诺贝尔化学奖“发明了聚合酶链反应发明了聚合酶链反应(PCR)的方法的方法”“开创了基于寡聚核苷酸的定点突变开创了基于寡聚核苷酸的定点突变 方法及其在蛋白质研究中的发展方法及其在蛋白质研究中的发展”(1)PCR发展史发展史1.1983年春，年春，Mullis提出提出PCR的概念；的概念；2.1983年年9月，月，Mullis用大肠杆菌用大肠杆菌DNA聚合酶做第一个聚合酶做第一个PCR实验，只一个循环；实验，只一个循环；3.1983年年12月，同位素标记的月，同位素标记的10个循环后的个循环后的49 bp长度的第一个长度的第一个PCR片断；片断；4.1985年年12月月20日，日，Mullis的同

31、事的同事Saiki在在Science上发了一篇论文，方法中用了上发了一篇论文，方法中用了PCR技术，导致技术，导致Mullis的文章到处被拒；的文章到处被拒；5.1985年年10月月25日申请日申请PCR专利，专利，1987年年7月月28日批准日批准(专利号专利号 4,683,202），这次），这次Mullis是第一发明人。是第一发明人。6.1986年年5月，月，Mullis在冷泉港实验室做专题报告，全世界开始学习在冷泉港实验室做专题报告，全世界开始学习PCR方法；方法；7.1986年年6月，月，Cetus公司纯化了第一种高温菌公司纯化了第一种高温菌DNA聚合酶，聚合酶，Taq DNA pol

32、ymerase，这是这是1985年春天年春天Mullis建议做的；建议做的；8.1988年，第一台年，第一台PCR仪问世；仪问世；9.1991年，年，Hoffman LaRoche以以3亿美元代价从亿美元代价从Cetus公司获得全权开发权。公司获得全权开发权。10.1993年，年，Mullis获得诺贝尔化学奖，获得诺贝尔化学奖，PCR和和DNA重组技术一样意义深远。重组技术一样意义深远。PCR仪的变迁仪的变迁1.三个水浴锅，三个水浴锅，用手移动（用手移动（Mullis等人当时用的）等人当时用的）2.电加热块电加热块 自来水冷却自来水冷却（PE，1988）3.电加热块电加热块 内置循环液冷却（内

33、置循环液冷却（PE，1989）4.三个加热块三个加热块 机械手（机械手（Stratagene，1994）5.半导体制冷和加热（半导体制冷和加热（MJ,PE,BioMetra,Eppendrof）6.温度梯度温度梯度,荧光检测荧光检测(如如 Roche的的Lightcycler)7.风加热风加热8.Lab-on-chip式的式的PCR仪仪(所谓的芯片所谓的芯片PCR)中国的状况中国的状况 1.1991年出现三个水浴锅年出现三个水浴锅+机械手原始机械手原始PCR仪仪(华美，复日等华美，复日等)；2.现在以半导体（现在以半导体（Peltier板）制冷式为主（杭州博日板）制冷式为主（杭州博日,上海天呈

34、上海天呈,厦门安普利等）。厦门安普利等）。PCR相关的术语和产品相关的术语和产品 T-vector HotStart Taq RT-PCR RAPD-PCR DDRT-PCR LM-PCR Inverse PCR Nested PCR Real-time PCR RACE Flow chip PCR TAS Multiplex PCR Immuno PCR Asymmetric PCR LP-PCR NASBA Recombinant PCR AFLP SSCP In situ PCR TaqMan/SYBR green(2)原理原理:模板变性、引物退火、模板变性、引物退火、DNA 聚合酶进行

35、聚合酶进行DNA链延伸链延伸第二轮扩增第二轮扩增第一轮扩增第一轮扩增引物与模板结合引物与模板结合模板模板第三轮扩增第三轮扩增PCR产物呈指数方式增加产物呈指数方式增加，2530个循环，理论个循环，理论109 分子，实际分子，实际105107上游引物上游引物下游引物下游引物logDNACyclesPCR琼脂糖凝胶电泳琼脂糖凝胶电泳最终产物最终产物3-4 小时小时紫外灯观察紫外灯观察特点：特异性、有效性、忠实性特点：特异性、有效性、忠实性1.操作简便省时；操作简便省时；2.灵敏度高；灵敏度高；3.特异性较强，但有一定的假阳性率。提高退火温度可特异性较强，但有一定的假阳性率。提高退火温度可以提高特异

36、性；以提高特异性；4.对原始材料的质量要求较低；对原始材料的质量要求较低；5.有一定程度的单核苷酸错误掺入。因为有一定程度的单核苷酸错误掺入。因为Taq DNA聚合聚合酶缺乏酶缺乏35核酸外切酶活性，不能纠正反应中发生的核酸外切酶活性，不能纠正反应中发生的错误核苷酸掺入。错误核苷酸掺入。a.模板模板DNA：单链或双链单链或双链DNA,避免避免DNA聚合酶抑制剂和能结合聚合酶抑制剂和能结合 DNA的蛋白质污染。的蛋白质污染。b.引物：引物：人工合成的两段与待扩增靶人工合成的两段与待扩增靶DNA侧翼片段互补的寡核苷酸。侧翼片段互补的寡核苷酸。0.10.5 mol/L c.Mg2+的浓度的浓度：反应

37、产物的特异性和产量，反应产物的特异性和产量，1.5mmol/L。d.dNTP：50200mol/L，四种，四种dNTP浓度相同。浓度相同。e.Taq 酶酶：Klenow/Taq酶酶/高保真高保真Taq酶酶,2.5U/100l。f.参数：参数：94 5min-30(94 30sec-55 30sec-721 min)-72 7min(3)组成组成10Taq Buffer 2.5l引物引物(10mol/L)21l H2O：管内总：管内总nmol数数/10(ml)dNTP(2.5mmol/L)2.0lH2O 16.2lTaq酶酶(0.5U/l)1.3l 4模板模板 1l25l PCR体系体系PCR

38、mix:：存于存于-20 2.5mM dNTP 80l10Taq buffer 100lH2O 648l25l体系：体系：20l反应反应15l体系：体系：12l反应反应55 调整温度调整温度(23)温度高，特异性高温度高，特异性高2XMaster Mix=dNTP+Taq酶酶+Taq buffer+loading buffer H2O 7l引物引物(10mol/L)21lMaster Mix 10ul模板模板 1lKit:天根生化，天根生化，2XPfu Master Mix，加，加A尾？尾？影响因素影响因素模板：模板：ng级的质粒级的质粒DNA，g级基因组级基因组DNA。引物：引物浓度不宜偏高

39、，否则易形成引物二聚体。特异性引物：引物浓度不宜偏高，否则易形成引物二聚体。特异性Mg2+浓度：特异性及产量浓度：特异性及产量dNTPs浓度：正确性和产量浓度：正确性和产量 Taq酶用量：非特异性酶用量：非特异性循环参数：常规为循环参数：常规为2530个循环个循环底物：四种底物：四种dNTP模板：模板：DNA引物：引物：DNA/RNA方向：新生链方向：新生链5 3产物：与模板性质相同产物：与模板性质相同DNA聚合酶催化聚合酶催化DNA链的延伸链的延伸DNA聚合酶的活性聚合酶的活性5 3聚合作用：将聚合作用：将dNTP加到加到DNA单链单链3端，延长端，延长DNA链链；5 3外切酶活性：催化外切

40、酶活性：催化DNA双链从双链从5端水解，切除修复。端水解，切除修复。3 5外切酶活性：催化单链外切酶活性：催化单链DNA从从3端水解，复制校正；端水解，复制校正；大肠杆菌的大肠杆菌的 DNA聚合酶聚合酶聚合酶聚合酶：5 3外切酶活性，切除外切酶活性，切除RNA引物；引物；5 3聚合酶活性，填补引物切除后形成的空隙聚合酶活性，填补引物切除后形成的空隙 3 5外切酶活性，校正作用外切酶活性，校正作用聚合酶聚合酶：修复合成，不参与修复合成，不参与DNA复制复制聚合酶聚合酶：5 3聚合酶活性，聚合酶活性，DNA链的延长链的延长 3 5外切酶活性，校正作用外切酶活性，校正作用真核细胞的真核细胞的 DNA

41、聚合酶：聚合酶：DNA聚合酶聚合酶、mtKlenow片段：指片段：指DNA聚合酶聚合酶被蛋白酶有限水解所被蛋白酶有限水解所 得到的得到的68kD的大片段，具有的大片段，具有3 5核核 酸外切酶活性和酸外切酶活性和5 3 聚合酶活性聚合酶活性。应用：双链应用：双链DNA的的3末端标记末端标记5 3核酸外切酶核酸外切酶3 5核酸外切酶核酸外切酶聚合酶聚合酶NC35kD,小片段小片段68kD,大片段大片段(Klenow片段片段)Taq DNA聚合酶聚合酶(Thermus aquaticus，Cetus/Roche)Tth DNA聚合酶聚合酶 (Thermus thermophilus，Toyobo)

42、Pfu DNA聚合酶聚合酶 (Pyrococcus furiosus，Stratagene)Deep Vent DNA聚合酶聚合酶(Bio-labs)Tfl DNA聚合酶聚合酶 (Thermus flavus，Promega)Tli DNA聚合酶聚合酶 (Thermococcus litoralis，Promega)Vent DNA聚合酶聚合酶(Bio-labs）Pwo DNA聚合酶聚合酶 (Pyrococcus woesei，Roche)Pfx DNA聚合酶聚合酶 (Thermococcus kodakaraensis,Invitrogen)Dynazyme DNA聚合酶聚合酶（Thermu

43、s brockianus，Finnazyme)FD DNA聚合酶聚合酶 (Thermus sterophilus？，复旦大学？，复旦大学)Tma,Tne,KOD,耐高温耐高温DNA聚合酶种类聚合酶种类1)长度一般为长度一般为18-25个碱基；个碱基；2)尽可能择碱基随机分布的序列；尽可能择碱基随机分布的序列；3)两条引物的两条引物的G+C的百分比应尽量相似，多为的百分比应尽量相似，多为4555%；4)避免引物内部形成二级结构；避免引物内部形成二级结构；5)两引物之间不应发生互补，特别是在两引物之间不应发生互补，特别是在3端端;6)引物引物3 末端碱基可以影响末端碱基可以影响Taq酶酶的延伸效率

44、，最好选的延伸效率，最好选T、G 或或C，而非而非A；7)引物引物5端允许有一段序列不与模板配对端允许有一段序列不与模板配对,内切酶，保护碱基内切酶，保护碱基。引物设计引物设计原则原则软件软件/网站：？网站：？第一步：查找目的基因序列：第一步：查找目的基因序列：mRNA序列序列(NCBI,GenBank)第二步：核酸内切酶位点分析第二步：核酸内切酶位点分析http:/www.in- GST:pGEX真核表达载体：真核表达载体：pcDNA3,pcDNA3.1 myc:pCMV-myc,pcDNAmyc/His,pSecTag2 HA:pcMV-HA Flag GFP:pEGGFP-N,pEGFP

45、-C,pIRES2-EGFP RFP病毒表达载体：病毒表达载体：pAdEasy。His-tagGST-tagGGAGAA1 atg aat ttt caa cag agg ctg caa agc ctg tgg act tta gcc aga 451 M N F Q Q R L Q S L W T L A R 1546 ccc ttc tgc cct cct ttg ctg gcg aca gcc tct caa atg cag atg 9016 P F C P P L L A T A S Q M Q M 30541 gac gta gaa gca gct ctg acc aaa gcc ct

46、t ggg gaa gtg gac att 585181 D V E A A L T K A L G E V D I 195586 ctt ctg acc tgg atg cag aaa ttc tac aag ctc tga 621196 L L T W M Q K F Y K L *。5 保护碱基保护碱基+酶切位点酶切位点+起始密码起始密码+目的基因目的基因5末端序列末端序列 3 1 atg aat ttt caa cag agg ctg caa agc ctg tgg act tta gcc aga 451 M N F Q Q R L Q S L W T L A R 15上游引物上游引物

47、 5 cg gga tcc atg aat ttt caa cag agg ctg 3 BamHI上游有标签上游有标签 读框读框586 ctt ctg acc tgg atg cag aaa ttc tac aag ctc tga 621196 L L T W M Q K F Y K L *下游引物下游引物:反向互补反向互补5 保护碱基保护碱基+酶切位点酶切位点+终止密码终止密码+目的基因目的基因3末端反向互补序列末端反向互补序列 3 5 ccg ctc gag tca gag ctt gta gaa ttt ctg 3 Xho I下游有标签下游有标签 读框读框 1)T=2(A+T)+4(G+

48、C)-35 2)T=22+1.46 ln35 ln=2(G or C)+(A or T)2035nt 3)T=81.5+16.6lgJ+0.41(G+C%)-(600/l)-0.63(FA%)J+=monovalent cations l=oligonucleotide length FA=formamide 1470nt55 调整温度调整温度(23)温度高，特异性高温度高，特异性高退火温度退火温度图图PCR产物电泳结果产物电泳结果(1.5%Agarose)1.DNA相对分子质量相对分子质量DL2000;2.PCR产物产物;3.PCR空白对照。空白对照。a.样品准备区：提取核酸样品准备区：提取

49、核酸,在没有在没有DNA的干净环境中进行的干净环境中进行 PCR实验室实验室b.前前PCR区：加样区，配制所用的试剂。区：加样区，配制所用的试剂。c.后后PCR区：反应后处理样品区：反应后处理样品 这一区域的所有试剂和仪器不能用于任何前这一区域的所有试剂和仪器不能用于任何前PCR活动活动a.阴性阴性(无模板无模板)、阳性对照、阳性对照(阳性模板阳性模板)b.配制配制PCR混合物：混合物：PCR buffer+dNTP+H2Oc.控制污染控制污染:靶序列污染，气溶胶靶序列污染，气溶胶 注意事项注意事项实验室分区；实验室分区；紫外线紫外线(距离距离1m，400W/cm2)照射；照射；更换试剂；更换

50、试剂；换仪器；换仪器；换实验室；换实验室；用另一套引物；用另一套引物；用化学法修饰用化学法修饰DNA；停试验。停试验。限制性核酸内切酶：限制性核酸内切酶：识别识别DNA的特异序列的特异序列,并在识别位点或其周围并在识别位点或其周围切割双链切割双链DNA的一类核酸内切酶。的一类核酸内切酶。GGATCCCCTAGGGCCTAGGATCC GBam H命名原则命名原则EcoR I属的缩写属的缩写种的缩写种的缩写不同变种和品系的缩写不同变种和品系的缩写同一种微生物中分离多种限制酶的顺序同一种微生物中分离多种限制酶的顺序“发现限制性内切酶及其在分子遗传学方面的应用发现限制性内切酶及其在分子遗传学方面的应