分子生物学常用技术下课件.ppt

1、分子生物学常用技术分子生物学常用技术NCBI/Blast/Nucleotide blast1.核酸的分离纯化和鉴定核酸的分离纯化和鉴定:基因组基因组DNA、总、总RNA、质粒、质粒2.基因的克隆与鉴定方法基因的克隆与鉴定方法待查序列待查序列3.外源基因转移技术和表达体系外源基因转移技术和表达体系4.检测方法：电泳技术：检测方法：电泳技术：agarose、SDS-PAGE 分子杂交分子杂交:SB、NB、WB、基因芯片技术、基因芯片技术 DNA序列测定序列测定 生物信息学分析技术生物信息学分析技术5.基因功能研究的方法基因功能研究的方法6.组学研究技术：基因组学、蛋白质组学组学研究技术：基因组学、

2、蛋白质组学三、外源基因转移技术和表达体系三、外源基因转移技术和表达体系1.外源基因转入技术外源基因转入技术 细菌：细菌：热激法热激法，电转化，电转化 热激法转化热激法转化试剂配制：？试剂配制：？LB培养液培养液LB-Amp平板平板LB-Kan平板平板a.加入连接产物加入连接产物/质粒，冰浴质粒，冰浴b.42 90sec，冰浴，冰浴c.培养：培养：LB培养液培养液d.涂板涂板生物学方法：农杆菌介导的基因转导生物学方法：农杆菌介导的基因转导 花粉管通道法介导的基因转化花粉管通道法介导的基因转化 体外包装转染法体外包装转染法 共转化共转化 生殖细胞浸泡法介导的基因转化生殖细胞浸泡法介导的基因转化化学

3、方法：化学方法：PEG介导的基因转化介导的基因转化 磷酸钙沉淀法磷酸钙沉淀法真核细胞真核细胞生物化学方法：生物化学方法：脂质体法：脂质体法：Kit生物物理方法：胚胎干细胞法生物物理方法：胚胎干细胞法 电转化法：电转仪电转化法：电转仪物理学方法：基因枪法物理学方法：基因枪法 显微注射介导基因转化显微注射介导基因转化 胚囊、子房注射法介导基因转化胚囊、子房注射法介导基因转化 激光微束介导基因转化激光微束介导基因转化 超声波介导基因转化超声波介导基因转化 碳化硅纤维介导法碳化硅纤维介导法2.原核细胞表达体系：大肠杆菌原核细胞表达体系：大肠杆菌优点：遗传背景清楚、繁殖快、成本低、表达量高、优点：遗传背

4、景清楚、繁殖快、成本低、表达量高、表达产物容易纯化、稳定性好、表达产物容易纯化、稳定性好、抗污染能力强和适用范围广。抗污染能力强和适用范围广。缺点：表达的蛋白质产物不能进行翻译后修饰、缺点：表达的蛋白质产物不能进行翻译后修饰、高表达时容易发生折叠错误、高表达时容易发生折叠错误、E coli本身内毒素和毒性蛋白可能混杂在终产物中。本身内毒素和毒性蛋白可能混杂在终产物中。成功例子：成功例子：-干扰素干扰素组成组成 启动子：启动子：lac、trp、tac、PL启动子启动子 目的基因编码序列目的基因编码序列 终止子：终止子：受体细胞受体细胞表达载体表达载体表达方式表达方式非融合蛋白：非融合蛋白：pBV

5、220融合蛋白融合蛋白分泌表达分泌表达:含有信号肽序列，含有信号肽序列，OmpA等等带纯化标签的表达：带纯化标签的表达：GST、His6表面呈现表达表面呈现表达带伴侣的表达：带伴侣的表达：GroEL、GroES等等分离纯化：亲和层析分离纯化：亲和层析重组蛋白的制备：细菌重组蛋白的制备：细菌重组表达载体重组表达载体Ni-亲和胶亲和胶GST-亲和胶亲和胶表达形式分析：可溶性表达形式分析：可溶性/包涵体包涵体亲和纯化亲和纯化宿主菌宿主菌:BL21转化转化重组蛋白表达重组蛋白表达：SDS-PAGE 诱导剂诱导剂重组蛋白重组蛋白WB鉴定鉴定3.真核细胞表达体系真核细胞表达体系(1)酵母表达体系酵母表达体

6、系毕赤酵母表达体系：表达水平高毕赤酵母表达体系：表达水平高(外源蛋白占菌体总蛋白外源蛋白占菌体总蛋白10-30%)，异源蛋白的表达有胞内和分泌两种形式。工艺成熟，分，异源蛋白的表达有胞内和分泌两种形式。工艺成熟，分离纯化简单，糖基化方式更接近高等生物。离纯化简单，糖基化方式更接近高等生物。成功例子：乙型肝炎病毒表面抗原成功例子：乙型肝炎病毒表面抗原酿酒酵母表达体系：遗传背景清楚，容易操作，但表达的重组酿酒酵母表达体系：遗传背景清楚，容易操作，但表达的重组蛋白产量偏低蛋白产量偏低(外源蛋白占菌体总蛋白外源蛋白占菌体总蛋白10%)，且会被超糖基化。，且会被超糖基化。有胞内表达和分泌性表达两种，只有

7、分泌性表达的蛋白质才能有胞内表达和分泌性表达两种，只有分泌性表达的蛋白质才能被糖基化。被糖基化。成功例子：水蛭素成功例子：水蛭素(2)昆虫细胞杆状病毒表达体系昆虫细胞杆状病毒表达体系杆状病毒主要感染昆虫，利用昆虫细胞生产重组蛋白。杆状病毒主要感染昆虫，利用昆虫细胞生产重组蛋白。受体细胞：草地夜蛾细胞株受体细胞：草地夜蛾细胞株sf9和和sf21。优点：昆虫和哺乳动物细胞的翻译后加工方式相似，重组蛋优点：昆虫和哺乳动物细胞的翻译后加工方式相似，重组蛋白的抗原性、免疫原性和功能与天然蛋白相似，表达水平较白的抗原性、免疫原性和功能与天然蛋白相似，表达水平较高高(发酵液中目的产物含量发酵液中目的产物含量

8、1-500mg/L)。缺点：糖基化程度较低，形式较为单一。缺点：糖基化程度较低，形式较为单一。(3)哺乳动物细胞表达体系哺乳动物细胞表达体系调控序列调控序列 启动子：启动子：SV40、RSV、ADV、CMV、HSP、MCK 终止子：终止子：SV40小小t抗原基因、抗原基因、珠蛋白基因、牛生珠蛋白基因、牛生 长激素基因的转录终止信号。长激素基因的转录终止信号。选择性标记基因：选择性标记基因：TK、APH、dhfr、XGPRT可调控表达体系：可调控表达体系：Tet-on和和Tet-off体系体系 pERV3和和pEGSH诱导体系诱导体系宿主细胞：宿主细胞：CHO、COS、BHK、SP2/0、NIH

9、3T3、HEK293等等优点：产品的抗原性、免疫原性和功能与天然蛋白质最接近，优点：产品的抗原性、免疫原性和功能与天然蛋白质最接近，糖基化等翻译后加工最准确。糖基化等翻译后加工最准确。缺点：表达水平低，发酵液中目的产物缺点：表达水平低，发酵液中目的产物我国为我国为0.21g/L，国际上多在国际上多在12g/L以上。以上。2007年，全球销售额最高的年，全球销售额最高的6大类生物技术药物中，大类生物技术药物中，有五类有五类(肿瘤治疗药物、肿瘤治疗药物、anti-TNF 药物、药物、EPO、胰岛素和、胰岛素和凝血因子凝血因子)都是经哺乳动物细胞表达生产的。都是经哺乳动物细胞表达生产的。动物细胞大规

10、模培养是当前生物药物生产的主流方式。动物细胞大规模培养是当前生物药物生产的主流方式。四、检测方法四、检测方法1.电泳技术电泳技术 核酸：完整性、分离、纯化核酸：完整性、分离、纯化 琼脂糖凝胶电泳：琼脂糖凝胶电泳：agarose,水平水平,1XTAE EB(2ng),Gelred,Goldview,紫外灯紫外灯试剂配制：？试剂配制：？50XTAE图图 PCR产物电泳结果产物电泳结果1.DNA相对分子质量相对分子质量DL2000;2.PCR产物产物;3.PCR空白对照。空白对照。聚丙烯酰胺凝胶电泳聚丙烯酰胺凝胶电泳:PAGE(Acr+Bis)垂直，银盐染色垂直，银盐染色 非变性非变性/变性变性蛋白

11、质：蛋白质：SDS-PAGE1.试剂配制：？试剂配制：？30%丙烯酰胺丙烯酰胺-N,N亚甲双丙烯酰胺亚甲双丙烯酰胺1.5M pH8.8 Tris-HCl1M pH6.8 Tris-HCl10%SDS10%过硫酸铵过硫酸铵电泳缓冲液：电泳缓冲液：25mMTris-HCl(pH8.0),250mM Gly,0.1%SDS(pH8.3)4X电泳加样缓冲液电泳加样缓冲液考马斯亮蓝染色液考马斯亮蓝染色液脱色液脱色液2.浓缩胶和分离胶配制表：？浓缩胶和分离胶配制表：？10%分离胶分离胶1.配胶：分离胶浓度，胶凝时间，储存配胶：分离胶浓度，胶凝时间，储存2.上样：上样：30l/次次/道道3.电泳：电泳：90

12、V-120V4.染色染色5.脱色脱色步骤：步骤：1948年诺贝尔化学奖年诺贝尔化学奖Arne Wilhelm Kaurin Tiselius“发展了电泳和吸收分析等方法，发展了电泳和吸收分析等方法，发现了血清蛋白的组分发现了血清蛋白的组分”电泳、色谱、相分离、凝胶过滤电泳、色谱、相分离、凝胶过滤(1)原理原理:变性和复性变性和复性2.核酸分子杂交核酸分子杂交碱基互补配对碱基互补配对两条核酸单链两条核酸单链(同源性同源性)退火退火双链双链条件条件(温度及离子温度及离子)(2)探针探针概念概念:特定的已知核苷酸片段特定的已知核苷酸片段,能与互补核酸序列退火能与互补核酸序列退火 杂交杂交,用于待测核

13、酸样品中特定核酸顺序的检测用于待测核酸样品中特定核酸顺序的检测.种类种类 基因组基因组DNA:外显子外显子 cDNA:理想，非特异性少，获得困难理想，非特异性少，获得困难 cRNA：理想，杂合体稳定，杂交温度高：理想，杂合体稳定，杂交温度高 杂交效率高杂交效率高 非特异性少非特异性少 寡核苷酸片段：寡核苷酸片段：15-30bp，杂交时间短，杂交时间短标记物标记物 特性特性高度灵敏性高度灵敏性不影响碱基配对不影响碱基配对不影响探针分子的主要理化特性不影响探针分子的主要理化特性使用酶促方法时使用酶促方法时,不影响酶活性不影响酶活性检测方法的灵敏性和特异性高检测方法的灵敏性和特异性高化学稳定性高化学

14、稳定性高操作的安全性操作的安全性 放射性同位素放射性同位素:32P,3H,35S 非放射性标记物：生物素、地高辛、荧光素非放射性标记物：生物素、地高辛、荧光素标记方法标记方法内标记内标记末端标记末端标记 切口平移法切口平移法随机引物法随机引物法单链单链DNA探针探针cRNA探针标记探针标记切口平移法切口平移法：dsDNA，掺入率高，最常用，掺入率高，最常用-32PdATP37 15min限速步骤限速步骤37 23h dsDNA+随机引物随机引物变性：沸水变性：沸水3min冰浴：冰浴：1minKlenow大片段：大片段：RT 3h5 3聚合酶活性聚合酶活性 3 5外切酶活性外切酶活性-32PdA

15、TP随机引物法：随机引物法：dsDNA，掺入率高，常用，掺入率高，常用单链单链DNA探针标记：探针标记：M13噬菌体的噬菌体的DNA片段标记片段标记dsDNA 3端端G A A T T CC T T A A GGC T T A A A A T T C G+EcoR方法方法1：内切酶切出粘末端：内切酶切出粘末端Klenow大片段大片段适当种类的适当种类的-32P dNTP末端标记：末端标记：方法方法2：3端填充标记法端填充标记法 T4噬菌体噬菌体DNA聚合酶、聚合酶、T7噬菌体噬菌体DNA聚合酶、聚合酶、Klenow片段片段dNTP-:3 5外外切酶切酶 dNTP+:5 3聚聚合酶合酶5末端：末

16、端：T4多核苷酸激酶多核苷酸激酶(T4PNK)，DNA、RNA-32P dATP5-OH末端寡核苷酸的磷酸化末端寡核苷酸的磷酸化磷酸基团的交换磷酸基团的交换纯化纯化凝胶过滤层析凝胶过滤层析:Sephadex G-50乙醇沉淀法乙醇沉淀法液相杂交：待检物在液体中，速度快，液相杂交：待检物在液体中，速度快，与核酸电镜技术结合在一起，与核酸电镜技术结合在一起，研究不同研究不同DNA的同源性的同源性 mRNA与染色体与染色体DNA间的关系间的关系固相杂交：待检物在一定支持物上，检测方便，固相杂交：待检物在一定支持物上，检测方便，应用广泛。应用广泛。膜固相印迹杂交膜固相印迹杂交 细胞原位杂交细胞原位杂交

17、(3)分类分类固相支持物固相支持物结合核酸类型结合核酸类型 ssDNA ssDNA ssDNA RNA dsDNA dsDNA RNA RNA荷载能力荷载能力(g/cm2)80100 400600 400600膜膜 强强 度度 差差 好好 好好结合核酸的方式结合核酸的方式 非共价结合非共价结合 共价结合共价结合 共价结合共价结合结合核酸最小长度结合核酸最小长度 500 nt 50 nt/bp 50 nt/bp固定方法固定方法 80烘烤烘烤2h 80烘烤烘烤2h 80烘烤烘烤2h 或紫外交联或紫外交联 或紫外交联或紫外交联 硝酸纤维素膜硝酸纤维素膜 普通尼龙膜普通尼龙膜 带正电荷尼龙膜带正电荷尼

18、龙膜固相杂交固相杂交Southern-blotNorthern-blotDot-blot原位杂交原位杂交菌落原位杂交菌落原位杂交(4)过程过程检测检测核酸核酸(单链或双链单链或双链)固定在膜上固定在膜上(双链变性为单链双链变性为单链)探针的制备和标记探针的制备和标记预杂交预杂交封闭膜上的非特异结合位点封闭膜上的非特异结合位点降低杂交本底降低杂交本底杂交杂交杂交温度和离子强度杂交温度和离子强度洗膜洗膜离子强度和温度离子强度和温度洗去非特异性结合的探针洗去非特异性结合的探针放射自显影放射自显影化学显色法化学显色法Southern blot dsDNA内切酶内切酶dsDNA片段片段-+电泳电泳+*标

19、记的探针标记的探针*杂交杂交转膜转膜*放射自显影放射自显影洗膜洗膜印迹方法：印迹方法：毛细管转移法、电转移法和真空转移法毛细管转移法、电转移法和真空转移法Bio-Rad 电转仪电转仪Agarose 电泳电泳Southern blotNorthern blot基因组基因组DNA总总RNA限制性内切酶限制性内切酶尼龙膜尼龙膜甲醛变性电泳甲醛变性电泳变性变性PAGE基因酶切图谱基因酶切图谱基因组基因定性及定量基因组基因定性及定量基因突变基因突变探针探针特定特定RNA定性定性 定量定量 大小大小探针探针 转转 移移NaOH滤膜再次使用滤膜再次使用Southern印迹杂交印迹杂交1、处理样品、处理样品2

20、、凝胶电泳及转移前处理、凝胶电泳及转移前处理3、核酸转移及固定、核酸转移及固定4、预杂交、预杂交5、杂交、杂交6、洗膜、洗膜7、杂交结果的检测、杂交结果的检测8、杂交膜的重复使用、杂交膜的重复使用 1 实验准备：创造一个无实验准备：创造一个无RNA酶的环境酶的环境 2 制备凝胶制备凝胶 3 样品的处理：在杂交之前，应该确定所用的核酸样品具样品的处理：在杂交之前，应该确定所用的核酸样品具有相当的纯度和完整性有相当的纯度和完整性 4 RNA电泳及转移电泳及转移 5 核酸的固定、预杂交、杂交、洗膜及杂交结果的检测均核酸的固定、预杂交、杂交、洗膜及杂交结果的检测均同同Southern印迹杂交印迹杂交N

21、orthern 印迹杂交印迹杂交斑点杂交与狭缝杂交斑点杂交与狭缝杂交 概念概念:将将DNA或或RNA样本变性后直接点于膜上，用于样本变性后直接点于膜上，用于 基因组中特定基因表达的定性和定量分析，基因组中特定基因表达的定性和定量分析，简单快速，一张膜可同时检测多个样本。简单快速，一张膜可同时检测多个样本。组织或细胞经适当处理后，细胞通透性增加，组织或细胞经适当处理后，细胞通透性增加，探针能与细胞内探针能与细胞内DNA或或RNA杂交，可以确定探杂交，可以确定探 针互补序列在胞内位置，具有重要的生物学和针互补序列在胞内位置，具有重要的生物学和 病理学意义。病理学意义。原位杂交原位杂交:菌落的原位杂

22、交：菌落的原位杂交：筛选含有阳性重组子的菌落。筛选含有阳性重组子的菌落。菌落转印到膜上菌落转印到膜上原位溶菌和变性原位溶菌和变性杂交杂交蛋白质杂交：蛋白质杂交：WB1.样品处理：样品处理：RIPA裂解，超声，离心，总蛋白浓度裂解，超声，离心，总蛋白浓度2.SDS-PAGE:分离胶浓度分离胶浓度3.转膜：转膜：-滤纸滤纸-胶胶-NC膜膜-滤纸滤纸 +，条件条件4.丽春红染色：丽春红染色：丽春红丽春红5.封闭：封闭：5脱脂奶粉脱脂奶粉-TBST，RT 1h 摇床摇床6.Ab1：1:501:3000(封闭液封闭液)，RT 1h/4过夜过夜7.洗膜：洗膜：TBST，RT 1h，换液，摇床换液，摇床8.

23、Ab2：1:3000(封闭液封闭液)，RT 40min，摇床，摇床9.洗膜：同前洗膜：同前10.ECL显色：显色：RT5min，暗室，暗室，X-光片光片生物芯片：包括基因芯片、蛋白质芯片和组织芯片三类生物芯片：包括基因芯片、蛋白质芯片和组织芯片三类芯片：在有限的材料表面固定大量的样品，一次试验可对芯片：在有限的材料表面固定大量的样品，一次试验可对 很多的基因或蛋白进行检测。很多的基因或蛋白进行检测。基因芯片：又称基因芯片：又称DNA微阵列或微阵列或DNA芯片，是在基片上面积芯片，是在基片上面积 很小的区域内有序地固定大量的基因探针组成。很小的区域内有序地固定大量的基因探针组成。种类：寡核苷酸芯

24、片和种类：寡核苷酸芯片和cDNA芯片芯片制备方法：直接点样法：寡核苷酸芯片和制备方法：直接点样法：寡核苷酸芯片和cDNA芯片芯片 原位合成法：寡核苷酸芯片原位合成法：寡核苷酸芯片基因芯片基因芯片a.探针探针(DNA或或cDNA)固定固定:以高密度点阵的形式按以高密度点阵的形式按 一定顺序固定排列在硅片一定顺序固定排列在硅片(玻片、尼龙膜等玻片、尼龙膜等)表面上表面上b.待测样品标记待测样品标记:DNA、RNA或或cDNA用荧光标记用荧光标记c.杂交杂交d.检测检测:读片仪读片仪 一次实验，一次实验，DNA芯片便能记录成千上万的基因表达图谱。芯片便能记录成千上万的基因表达图谱。应用：应用：a.基

25、因表达：直接检测基因表达：直接检测mRNA的种类及丰度，是研究基因表达的种类及丰度，是研究基因表达 的有力工具。的有力工具。b.基因突变和基因诊断：大规模地筛查由基因突变引起的疾基因突变和基因诊断：大规模地筛查由基因突变引起的疾 病，辅助疾病的诊断。病，辅助疾病的诊断。c.基因测序基因测序d.功能基因组研究功能基因组研究3.DNA序列测定序列测定化学裂解法：化学裂解法：Maxam和和Gilbert，1977，可用于补充，可用于补充DNA测序结果，测序结果，常用于难以用酶末端终止法测序的特殊常用于难以用酶末端终止法测序的特殊DNA序列及结构。序列及结构。酶末端终止法：酶末端终止法：Sanger和

26、和Nicklen，1977，又称为双脱氧链终止法。，又称为双脱氧链终止法。自动化程度高，且在技术上不断进步。如荧光标记自动化程度高，且在技术上不断进步。如荧光标记DNA 测序技术、毛细管测序仪等。测序技术、毛细管测序仪等。全基因组鸟枪测序法：用于大规模基因组测序，不需要预先构建基因组的物全基因组鸟枪测序法：用于大规模基因组测序，不需要预先构建基因组的物 理图谱，理图谱，Celera Genomics公司用以人类基因组测序。公司用以人类基因组测序。逐个克隆鸟枪测序法：用于大规模基因组测序，需预先构建基因组的物理图逐个克隆鸟枪测序法：用于大规模基因组测序，需预先构建基因组的物理图 谱，人类基因组计

27、划公共联盟采用这个方法用于人类谱，人类基因组计划公共联盟采用这个方法用于人类 基因组测序。基因组测序。杂交测序：借助于基因芯片杂交测序：借助于基因芯片(1)化学裂解法化学裂解法 a.先将先将DNA的末端之一进行标记的末端之一进行标记(32P)；b.在多组互相独立的化学反应中分别进行特定碱基的化学修饰；在多组互相独立的化学反应中分别进行特定碱基的化学修饰；c.在修饰碱基位置化学法断开在修饰碱基位置化学法断开DNA链；链；d.聚丙烯酰胺凝胶电泳将聚丙烯酰胺凝胶电泳将DNA链按长短分开；链按长短分开；e.根据放射自显影显示区带，直接读出根据放射自显影显示区带，直接读出DNA的核苷酸序列。的核苷酸序列

28、。(2)Sanger双脱氧链终止法双脱氧链终止法 Paul Berg Walter Gilbert Frederick Sanger“在核酸碱基序列测定的贡献在核酸碱基序列测定的贡献”1980年诺贝尔化学奖年诺贝尔化学奖“在核酸生化，尤其是在核酸生化，尤其是DNA重组的基础研究重组的基础研究”逐个克隆鸟枪法测序逐个克隆鸟枪法测序全基因组鸟枪法测序全基因组鸟枪法测序(3)杂交测序：是以基因芯片为基础的一种测序方法，杂交测序：是以基因芯片为基础的一种测序方法，将一段将一段 DNA 片段分解为一系列相差一个碱基的八聚体，片段分解为一系列相差一个碱基的八聚体，将这些八聚体做成基因芯片与待测将这些八聚体

29、做成基因芯片与待测 DNA 杂交，杂交，根据杂交结果拼凑出所测根据杂交结果拼凑出所测 DNA 序列。序列。4.生物信息学分析技术生物信息学分析技术概念：是生物学和信息技术的结合，利用计算机对大量生物数据进行分析。概念：是生物学和信息技术的结合，利用计算机对大量生物数据进行分析。组成：数据库：数据采集，包括组成：数据库：数据采集，包括DNA/RNA/蛋白质测序，蛋白质的结构，蛋白质测序，蛋白质的结构，基因基因/蛋白质表达数据，蛋白质相互作用数据。蛋白质表达数据，蛋白质相互作用数据。算法和统计方法：确定大数据集中各成员的关系算法和统计方法：确定大数据集中各成员的关系 对生物数据的分析和解释：生物数

30、据的检索对生物数据的分析和解释：生物数据的检索 Entrez,NCBI,BLAST1.动物模型动物模型2.蛋白质相互作用蛋白质相互作用 3.定点突变技术定点突变技术4.基因表达谱和表型变化基因表达谱和表型变化线索：生物信息学线索：生物信息学五、基因功能研究的方法五、基因功能研究的方法方法方法a.直接转染或用反转录病毒感染胚胎干细胞，然后将这些直接转染或用反转录病毒感染胚胎干细胞，然后将这些 细胞移植到囊胚发育阶段的胚胎中；细胞移植到囊胚发育阶段的胚胎中；b.用反转录病毒感染早期胚胎；用反转录病毒感染早期胚胎；c.将包含目的基因的将包含目的基因的DNA显微注射到卵母细胞、受精卵或显微注射到卵母细

31、胞、受精卵或 早期胚胎细胞中；早期胚胎细胞中；d.雄配子介导的基因转移；雄配子介导的基因转移；e.将目的基因转移到未受精的卵细胞中；将目的基因转移到未受精的卵细胞中；f.通过基因枪和电融合等物理方法进行基因转移。通过基因枪和电融合等物理方法进行基因转移。1.转基因动物转基因动物2007年诺贝尔生理学或医学奖年诺贝尔生理学或医学奖Mario R.Capecchi Sir Martin J.Evans Oliver Smithies“发现利用胚胎干细胞在小鼠中引起特定基因修饰的原则发现利用胚胎干细胞在小鼠中引起特定基因修饰的原则”基因敲除：又称为胚胎干细胞基因打靶技术。基因敲除：又称为胚胎干细胞基

32、因打靶技术。动物模型：小鼠，动物模型：小鼠，ES细胞核型为细胞核型为40XY打靶载体：置换型和插入型打靶载体：置换型和插入型数据库：数据库：1995年建立年建立MKMD(Mouse Knockout&Mutation Database)http:/ RNA分子引起具有相同序列的分子引起具有相同序列的mRNA发生降解来关闭基发生降解来关闭基 因表达活性，能够产生功能缺失表型，是功能基因组学因表达活性，能够产生功能缺失表型，是功能基因组学 研究的重要工具。研究的重要工具。生物学意义生物学意义:遗传监视器遗传监视器 监控异常的或外源遗传物质在机体内的水平，监控异常的或外源遗传物质在机体内的水平，调控

33、基因的表达调控基因的表达 2006年诺贝尔生理学或医学奖年诺贝尔生理学或医学奖 Andrew Z.Fire Craig C.Mello“发现发现RNA干涉作用干涉作用-双链双链RNA引起的基因沉默引起的基因沉默”机制机制dsRNA的形成的形成短干扰短干扰RNA的产生的产生靶靶mRNA的降解的降解靶序列的选择：靶序列的选择：a.基因外显子编码区的基因外显子编码区的dsRNA能产生特异和高效的抑制作用，能产生特异和高效的抑制作用，对应于内含子序列的对应于内含子序列的dsRNA不能产生可检测的抑制效应。不能产生可检测的抑制效应。b.在构建载体时，应选择在构建载体时，应选择cDNA分子中的可读框序列分

34、子中的可读框序列c.避免起始密码子下游和终止密码子上游避免起始密码子下游和终止密码子上游50100nt范围内序列范围内序列d.避开多个串联的避开多个串联的G、T或或A碱基的区域碱基的区域e.GC含量应该小于含量应该小于50f.与其他基因无同源性与其他基因无同源性g.同时构建两个以上对同一基因不同靶区域的同时构建两个以上对同一基因不同靶区域的dsRNA表达载体表达载体方法方法化学合成。化学合成。体外转录。体外转录。RNase III 家族的酶（例如：家族的酶（例如：Dicer，RNase III）切）切割长链割长链dsRNA。用用PCR法合成法合成siRNA表达结构，并在细胞中表达。表达结构，并

35、在细胞中表达。向细胞中导入可表达向细胞中导入可表达siRNA的质粒载体或病毒载体，的质粒载体或病毒载体，并使之表达并使之表达。向细胞中转染向细胞中转染siRNA步骤：步骤：a.设计并合成设计并合成siRNA;b.利用脂质体将利用脂质体将siRNA 导入细胞导入细胞c.具有相同序列的具有相同序列的mRNA降解降解d.细胞或个体不能合成相应的蛋白质，表现出功能缺失表型细胞或个体不能合成相应的蛋白质，表现出功能缺失表型检测：检测：RT-PCR，WB对照：阴性，阳性，空白对照：阴性，阳性，空白 3.反义核酸技术反义核酸技术:根据核酸杂交原理设计的选择性抑制特定基因表达的实验技术。根据核酸杂交原理设计的

36、选择性抑制特定基因表达的实验技术。1)种类：反义种类：反义DNA(oligodeoxymucleotide,ODNs)、反义反义RNA、核酶（、核酶（ribozyme)、DNAzyme 2)生物学作用：抑制靶基因的表达生物学作用：抑制靶基因的表达3)设计：随机筛选靶点设计：随机筛选靶点4)长度长度:1520nt5)机理机理：空间位阻：与空间位阻：与mRNA或或DNA双链双链形成的形成的RNA/DNA杂交体激活杂交体激活RNaseH活性活性阻止阻止mRNA的拼接的拼接阻止靶基因的复制或转录阻止靶基因的复制或转录6)修饰修饰改变立体构型：由天然的改变立体构型：由天然的型糖苷键改为型糖苷键改为型型化

37、学修饰：即化学修饰：即ODNs磷酸糖骨架的磷酸二酯键被磷酸糖骨架的磷酸二酯键被 一些化学基因取代一些化学基因取代ODNs末端修饰末端修饰 肽核酸肽核酸7)问题问题 非反义效应非反义效应 靶靶mRNA的不可接近性的不可接近性 反义核酸进入细胞后可与其它分子如蛋白相互反义核酸进入细胞后可与其它分子如蛋白相互 作用，可能引起一系列的副作用作用，可能引起一系列的副作用 RNase H作用特性的影响作用特性的影响 反义核酸的剂量反义核酸的剂量-效应曲线局限的范围非常窄效应曲线局限的范围非常窄8)应用前景应用前景：反义药物，基因功能研究反义药物，基因功能研究4.蛋白质的相互作用蛋白质的相互作用基于文库筛选

38、的方法：基于文库筛选的方法：酵母双杂交酵母双杂交、表面展示技术、表面展示技术生物物理方法：生物物理方法：免疫共沉淀免疫共沉淀、蛋白质亲和层析蛋白质亲和层析、交联技术和荧光共振能量转移技术交联技术和荧光共振能量转移技术遗传学方法：基因外抑制子、合成致死筛选遗传学方法：基因外抑制子、合成致死筛选(1)酵母双杂交：酵母双杂交：通过鉴定报告基因的转录活性检测蛋白质。通过鉴定报告基因的转录活性检测蛋白质。LexA=BD+AD步骤：步骤：a.构建诱饵质粒构建诱饵质粒 诱饵基因亚克隆至诱饵基因亚克隆至BD表达载体表达载体 诱饵蛋白在酵母中表达的鉴定：诱饵蛋白在酵母中表达的鉴定：Western-blot 诱饵

39、质粒自激活作用的检测诱饵质粒自激活作用的检测b.构建至构建至AD表达载体表达载体cDNA文库的扩增：库容文库的扩增：库容108c.筛库：将重组筛库：将重组BD和和AD质粒分别或同时转染酵母报告菌株，质粒分别或同时转染酵母报告菌株，利用报告基因筛选阳性克隆利用报告基因筛选阳性克隆d.PCR反应鉴定反应鉴定e.测序测序f.蛋白相互作用的验证：蛋白相互作用的验证：g.功能研究功能研究体系：体系：Gal4(最常用最常用)、LexA/Gal4、LexA/VP16优点：高敏感性，适用于细胞核内外多种蛋白质之间优点：高敏感性，适用于细胞核内外多种蛋白质之间 相互作用的研究。相互作用的研究。缺点：缺点：a.不

40、适宜于转录因子相互作用蛋白质的筛选不适宜于转录因子相互作用蛋白质的筛选 b.酵母细胞中蛋白质翻译后修饰比较简单酵母细胞中蛋白质翻译后修饰比较简单 c.通过酵母双杂交筛选获得的多为通过酵母双杂交筛选获得的多为EST片段片段 d.存在假阳性与假阴性的问题存在假阳性与假阴性的问题应用应用根据研究目的可分为三类：根据研究目的可分为三类：a.明确两种已知蛋白之间有无相互作用；明确两种已知蛋白之间有无相互作用；b.鉴定已明确有相互作用的蛋白质发生相互作用所鉴定已明确有相互作用的蛋白质发生相互作用所必须的功能域以及特定氨基酸的改变对相互作用必须的功能域以及特定氨基酸的改变对相互作用的影响；的影响；c.寻找与

41、某一特定蛋白质有相互作用的未知蛋白寻找与某一特定蛋白质有相互作用的未知蛋白其他杂交体系其他杂交体系反向杂交体系：蛋白质相互作用报告基因产生特殊物质细胞死亡反向杂交体系：蛋白质相互作用报告基因产生特殊物质细胞死亡 蛋白质无相互作用报告基因不产生特是物质细胞存活蛋白质无相互作用报告基因不产生特是物质细胞存活 应用：鉴别不同突变对蛋白质相互作用的影响，应用：鉴别不同突变对蛋白质相互作用的影响，筛选阻止某些蛋白质相互作用的肽或小分子物质筛选阻止某些蛋白质相互作用的肽或小分子物质单杂交体系：研究单杂交体系：研究DNA与蛋白质相互作用，与蛋白质相互作用，分离能与分离能与DNA序列结合的蛋白质的基因序列结合

42、的蛋白质的基因RNA-蛋白质蛋白质小分子小分子-蛋白质蛋白质三杂交体系：研究三杂交体系：研究RNA与蛋白质之间相互作用关系与蛋白质之间相互作用关系 以及小分子与蛋白质相互作用关系。以及小分子与蛋白质相互作用关系。(2)表面展示技术表面展示技术噬菌体表面展示技术：最常用，在噬菌体颗粒的表面通过衣壳噬菌体表面展示技术：最常用，在噬菌体颗粒的表面通过衣壳 蛋白定位表达与之融合的外源蛋白质或多肽，可用于筛选和蛋白定位表达与之融合的外源蛋白质或多肽，可用于筛选和 改造功能性多肽，研究基因功能。改造功能性多肽，研究基因功能。酵母表面展示技术：通过将酵母自身分泌到细胞外的蛋白质编码酵母表面展示技术：通过将酵

43、母自身分泌到细胞外的蛋白质编码 基因与外源蛋白质基因融合，将外源蛋白质展示于酵母表面，基因与外源蛋白质基因融合，将外源蛋白质展示于酵母表面，用于筛选具有高亲和力的多肽。用于筛选具有高亲和力的多肽。动物病毒展示技术动物病毒展示技术核糖体展示技术核糖体展示技术(3)免疫共沉淀技术：免疫共沉淀技术：概念：是分析确定生理条件下完整细胞内两种蛋白质概念：是分析确定生理条件下完整细胞内两种蛋白质 是否存在相互作用的有效方法。是否存在相互作用的有效方法。原理：是利用标签抗体与融合蛋白携带的标签之间的高亲原理：是利用标签抗体与融合蛋白携带的标签之间的高亲 和力特性纯化和检出溶液中的靶分子。和力特性纯化和检出溶

44、液中的靶分子。注意：抗原的丰度注意：抗原的丰度 抗体对抗原的亲和力，最好选用单抗。抗体对抗原的亲和力，最好选用单抗。免疫共沉淀免疫共沉淀:真核细胞真核细胞 X-HA+Y-myc共转染共转染Cos7/293细胞细胞 IP:HA-IB:myc IP:myc-IB:HA共定位：真核细胞共定位：真核细胞 X-GFP+Y-RFP共转染共转染Cos7/293细胞，荧光显微镜细胞，荧光显微镜EMSA(electromobility shift assay):蛋白质蛋白质-DNA间的相互作用间的相互作用将将DNA进行放射性标记进行放射性标记(50 bp)与细胞与细胞/细胞核提取物反应细胞核提取物反应非变性非变

45、性PAGE 与蛋白质结合的与蛋白质结合的DNA迁移率降低迁移率降低问题问题:蛋白质是否与蛋白质是否与DNA结合结合?(4)蛋白质亲和层析技术：蛋白质亲和层析技术：将特定蛋白质固定于固相载体上用于吸附能与之特异将特定蛋白质固定于固相载体上用于吸附能与之特异性结合的蛋白质，用于蛋白质的纯化和推测功能未知目的性结合的蛋白质，用于蛋白质的纯化和推测功能未知目的蛋白的功能。蛋白的功能。C I P M66.2kDHis6-TRF1 可溶性可溶性(5)抗原表位的鉴定与分析方法抗原表位的鉴定与分析方法抗原和抗体的识别与结合是最典型的蛋白质之间的相互作用抗原和抗体的识别与结合是最典型的蛋白质之间的相互作用对位：

46、指抗体参与结合的部位对位：指抗体参与结合的部位表位：指抗原参与结合的部位表位：指抗原参与结合的部位鉴定方法：计算机软件对抗原氨基酸序列的结构分析，准确率达鉴定方法：计算机软件对抗原氨基酸序列的结构分析，准确率达 75，包括亲水性、可及性、抗原性、可塑性、电荷，包括亲水性、可及性、抗原性、可塑性、电荷 分布和二级结构预测分析。分布和二级结构预测分析。实验方法：酶促实验方法：酶促/化学裂解片段分析法、蛋白质印迹法、肽扫描、化学裂解片段分析法、蛋白质印迹法、肽扫描、表面呈现肽库表面呈现肽库/随机片段表达库筛选、化学修饰随机片段表达库筛选、化学修饰/突变突变 分析、分析、X射线衍射、表面等离子共振和核

47、磁共振等。射线衍射、表面等离子共振和核磁共振等。应用：合成多肽疫苗、制备诊断试剂和筛选高效价抗体；利用定应用：合成多肽疫苗、制备诊断试剂和筛选高效价抗体；利用定 点突变技术改造蛋白质结构以降低蛋白质药物免疫原性。点突变技术改造蛋白质结构以降低蛋白质药物免疫原性。5.基因表达谱和表型变化基因表达谱和表型变化基因表达差异基因表达差异 蛋白质水平：双向凝胶电泳和质谱技术蛋白质水平：双向凝胶电泳和质谱技术 基因芯片技术基因芯片技术(主流主流)代表性差异分析代表性差异分析 抑制性减法杂交技术抑制性减法杂交技术 mRNA减法杂交技术减法杂交技术 基因表达系列分析法基因表达系列分析法 基因组错配筛选技术。基

48、因组错配筛选技术。表型变化表型变化 抑制基因的表达：反义寡核苷酸、核酶、抑制基因的表达：反义寡核苷酸、核酶、负显性突变体、转基因、负显性突变体、转基因、RNAi 增强基因表达：即功能增益，增加基因拷贝数或增强基因表达：即功能增益，增加基因拷贝数或 采用强启动子促使基因过量表达。采用强启动子促使基因过量表达。RNA水平水平六、组学研究技术六、组学研究技术1.基因组学基因组学转录组分析：即转录组分析：即mRNA的定性和定量分析，的定性和定量分析，分类：杂交法、分类：杂交法、PCR法和测序法法和测序法。基因组：指一个单倍体细胞的所有基因组：指一个单倍体细胞的所有DNA组成，或者一个组成，或者一个 双

49、倍体细胞双倍体细胞DNA组成的一半。组成的一半。基因组学领域：基因组学领域：DNA测序、在物种内进行基因组多样性的测序、在物种内进行基因组多样性的 采集及其基因转录调控的研究。采集及其基因转录调控的研究。2.蛋白质组学蛋白质组学概念：指在不同生理或病理条件下，对生物体、组织、概念：指在不同生理或病理条件下，对生物体、组织、细胞内蛋白质存量的鉴别和功能特点分析。细胞内蛋白质存量的鉴别和功能特点分析。方法：分离：蛋白质双向电泳方法：分离：蛋白质双向电泳 鉴定：质谱鉴定：质谱 分析：蛋白质芯片分析：蛋白质芯片 蛋白质蛋白质-DNA/蛋白质蛋白质-蛋白质的相互作用蛋白质的相互作用蛋白质双向电泳蛋白质双

50、向电泳电泳：第一向电泳：第一向:等电聚焦（等电聚焦（IEF）第二向第二向:SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳（聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS-PAGE）染色：确定差异点蛋白质染色：确定差异点蛋白质PCR产物产物A-T克隆克隆测序测序重组表达载体重组表达载体重重 组组 蛋蛋 白白制备抗体制备抗体转转 染染 细细 胞胞原核表达载体原核表达载体哺乳动物细胞表达载体哺乳动物细胞表达载体病毒表达载体病毒表达载体昆虫表达载体昆虫表达载体酵母表达载体酵母表达载体检测活性检测活性体内、体外体内、体外作用机制作用机制应用应用思考题：思考题：Fig12.Fig2是是PCR结果，每个泳道的模板不同，你如何改进结果，每个泳道的模板