Northern印迹杂交技术教案课件.ppt

1、Northern印迹杂交技术 Northern Northern 杂交是用于杂交是用于RNARNA定量和定性分析的常用定量和定性分析的常用技术，它是将技术，它是将RNARNA分子从电泳凝胶转移到硝酸纤维分子从电泳凝胶转移到硝酸纤维素滤膜或其他化学修饰的活性滤纸上，再进行核素滤膜或其他化学修饰的活性滤纸上，再进行核酸分子杂交的一种实验方法。酸分子杂交的一种实验方法。可以鉴定总可以鉴定总RNARNA或或poly(A)poly(A)+RNARNA样品中同源样品中同源RNARNA的存的存在与否、测定样品中特定在与否、测定样品中特定mRNAmRNA分子的大小和丰度，分子的大小和丰度，是分子生物学中研究基

2、因表达在转录水平上的调是分子生物学中研究基因表达在转录水平上的调节以及节以及cDNAcDNA合成的重要手段。合成的重要手段。所用材料、试剂及仪器所用材料、试剂及仪器方 法 与 步 骤参考书籍及文献 总RNA样品或mRNA样品、探针模板DNA、随机引物、地高辛-dUTP、klenow酶、硝酸纤维素虑膜等。试剂试剂 10*MOPS缓冲液、DEPC水、6*RNA上样缓冲液、37%甲醛、甲酰胺、20*ssc(pH7.0)杂交缓冲液、2*洗膜缓冲液(2*ssc)、预杂交液、杂交缓冲液、缓冲液，、NBT(硝基四氮唑蓝)、BCIP(5-溴-4-氯-3-吲哚磷酸盐)、TE缓冲液、显色液、琼脂糖等。仪器仪器 恒

3、温水浴箱，电泳仪，杂交袋，真空转移仪，真空泵，杂交炉，恒温摇床，脱色摇床，漩涡振荡器，分光光度计，微量移液器，电炉（或微波炉），离心机，烧杯，量筒，三角瓶，紫外灯等。琼脂糖与纯水一定比例于微波炉内混匀、冷却到75C 加mops缓冲液、甲醛，混匀。制备成电泳用胶 待胶凝过程中，准备RNA样品。上样电泳：用1*MOPS缓冲液，先用20V使样品进胶，再用5V/cm电泳1 h，停止电泳。切去凝胶一角，用用SSC冲洗并浸泡胶板，以除去甲醛。用标尺测量加样孔与条带的距离，拍照浸泡在浸泡在250 ml 50Mmol/l NaOH,室室温、温、30r/min 30min。浸泡在浸泡在 250 mltris*N

4、aCI 室温、室温、30r/min30min。浸泡在浸泡在250ml10*SSC约约1min。RNARNA转膜前的处理转膜前的处理毛细管洗脱法毛细管洗脱法真空转移法真空转移法电印迹法电印迹法电泳后的凝胶电泳后的凝胶 放置放置 室温转移室温转移1025h 1025h 漂洗（漂洗（SSCSSC）除碎胶片）除碎胶片 8080烘烤烘烤2h2h固定固定核酸核酸.探针模探针模模板、随模板、随机引物机引物、双蒸、双蒸水。水。离心、离心、混匀。混匀。变性变性冰块冰块顺序加顺序加随机引随机引缓冲液缓冲液、dNTPdNTP、dUTPdUTPKlenowKlenow酶，混酶，混匀。匀。室温室温3h7575C C保温

5、保温1010MinMin。加预冷加预冷无水乙无水乙醇、混醇、混匀。匀。-20、2 h1000r/min1000r/min15min15min、去上清去上清、乙醇洗、乙醇洗涤、真涤、真空干燥空干燥、TETE溶解溶解、-20-20C C备用。备用。将待杂交的滤膜放入杂交袋中，按将待杂交的滤膜放入杂交袋中，按20mL/100cm20mL/100cm2 2滤膜计算加入预杂交液、滤膜计算加入预杂交液、6868水浴摇床杂交水浴摇床杂交1-2 h1-2 h。将标记好的将标记好的DNADNA探针煮沸探针煮沸5min5min，迅速在，迅速在冰上冷却。将探针加入预热的杂交液冰上冷却。将探针加入预热的杂交液中，充分

6、混匀。中，充分混匀。倒去预杂交液，按倒去预杂交液，按250mL/c250mL/c滤膜计算滤膜计算向杂交袋中加入含地高辛标记探针的向杂交袋中加入含地高辛标记探针的杂交液，杂交液，6868杂交杂交6 h6 h以上。以上。洗膜：在室温下用洗膜：在室温下用50mL 250mL 2*SSCSSC，0.1%0.1%SDS SDS 溶液洗膜两次以上，每次溶液洗膜两次以上，每次 5 min 5 min。膜即可以立即用于显色检测或储存备膜即可以立即用于显色检测或储存备用（干燥环境中）。用（干燥环境中）。室温，用缓冲液室温，用缓冲液洗膜洗膜 1-5 min 1-5 min，缓冲液，缓冲液洗膜洗膜 30 min 3

7、0 min，再用缓冲液，再用缓冲液洗膜洗膜 1-5 1-5 minmin。用缓冲液用缓冲液稀释抗体缓冲液（稀释抗体缓冲液（1 1：20002000），），稀释后的抗体溶液在稀释后的抗体溶液在44只能稳定只能稳定12 h12 h。室。室温下将膜在抗体稀释液中浸泡温下将膜在抗体稀释液中浸泡30 min30 min。缓冲液缓冲液洗膜洗膜2 2次，每次次，每次15 min15 min，以除去未，以除去未结合的抗体复合物。再用结合的抗体复合物。再用20 mL20 mL缓冲液缓冲液平平衡膜衡膜2-5 min2-5 min。在黑暗条件下将膜与显色液放入密封在黑暗条件下将膜与显色液放入密封的暗盒中显色。通常的

8、暗盒中显色。通常 2 min 2 min后出现颜后出现颜色，充分显色应在色，充分显色应在16 h16 h以上。膜可以以上。膜可以在弱光下短时间暴露以检测显色强度。在弱光下短时间暴露以检测显色强度。显色完毕后用显色完毕后用TETE缓冲液停止染色，照缓冲液停止染色，照相记录显色结果。相记录显色结果。参考书籍及文献参考书籍及文献1 朱玉贤朱玉贤,李李 毅毅.现代分子生物学现代分子生物学M.高等教育出版高等教育出版社社,2002，173-178.2 黄怡森黄怡森,张光毅张光毅.生化与分子生物学生化与分子生物学M.科学出版社，科学出版社，2008，345-347.3 郝福英郝福英,朱玉贤朱玉贤,朱圣庚，等朱圣庚，等.分子生物学实验技术分子生物学实验技术M.北北京大学出版社京大学出版社,1998,68-72.4 魏春红魏春红,李毅李毅.现代分子生物学实验技术现代分子生物学实验技术M.高等教育出版高等教育出版社社,2006,156-162.5 汪天虹汪天虹.分子生物学实验分子生物学实验M.北京大学出版社北京大学出版社,2009,76-79.此课件下载可自行编辑修改，仅供参考！此课件下载可自行编辑修改，仅供参考！感谢您的支持，我们努力做得更好！谢谢感谢您的支持，我们努力做得更好！谢谢