9苏教版生物选修一 第四章生物化学与分子生物学技术实践第二节分子生物学技术（共24张PPT）.ppt

1、4.2 4.2 分子生物学技术分子生物学技术 一一、分子生物学进展分子生物学进展 1.DNA 重组技术使生物技术中的重组技术使生物技术中的 _不断优化不断优化，高产量的微生物高产量的微生物 菌株已不再局限于通过微生物的诱变或分离菌株已不再局限于通过微生物的诱变或分离 获得获得， 完全可以通过完全可以通过_技术培育技术培育 _来实现来实现。 生物转化环节生物转化环节 DNA重组重组 工程菌工程菌 2.原核生物、真核生物的细胞已被用于大批原核生物、真核生物的细胞已被用于大批 量生产量生产_、_等外源蛋白；植物和等外源蛋白；植物和 动物也可以作为天然的动物也可以作为天然的 _，用于生产新的或改造过的

2、基因产物。，用于生产新的或改造过的基因产物。 DNA重组技术还大大简化了新药的开发和检测系统。重组技术还大大简化了新药的开发和检测系统。 胰岛素胰岛素 干扰素干扰素 生物反应器生物反应器 (1)工程菌是指用工程菌是指用DNA重组技术的方法使外源基因得到重组技术的方法使外源基因得到 高效表达的菌类细胞株系。高效表达的菌类细胞株系。() (2)克隆羊克隆羊“多利多利”是分子生物学的发展的成果。是分子生物学的发展的成果。() 判一判判一判 二二、PCR技术技术(聚合酶链式反应聚合酶链式反应) 1.PCR技术的含义技术的含义 在体外快速扩增在体外快速扩增_或或DNA序列序列(目的目的 DNA片段片段)

3、的实验技术的实验技术，又称为聚合酶链式反应又称为聚合酶链式反应。 2.PCR技术的原理技术的原理 (1)条件：条件：DNA模板、模板、_、_、4种脱种脱 氧核苷酸。氧核苷酸。 特定基因特定基因 DNA聚合酶聚合酶 引物引物 (2)PCR扩增的特点：扩增的特点：_、简便和简便和 _。 (3) 进 行进 行 PCR 的 先 决 条 件 ： 待 扩 增 的的 先 决 条 件 ： 待 扩 增 的 DNA 片 段片 段 _要为已知要为已知。 (4)引物序列确定的依据是：被扩增区域的引物序列确定的依据是：被扩增区域的3端边界端边界DNA 序列。序列。 快速快速 灵敏灵敏 3端核苷酸序列端核苷酸序列 1在在

4、PCR反应中与解旋酶作用相同的操作是什么反应中与解旋酶作用相同的操作是什么？ 提示：提示：生物体外，利用生物体外，利用DNA的热变性原理：的热变性原理：94 时时 DNA的双螺旋结构将解体，双链分开。的双螺旋结构将解体，双链分开。 想一想想一想 三三、PCR扩增的过程扩增的过程 1.物质条件物质条件(反应成分反应成分) (1)引物：两种引物：两种_，每种由每种由1540个核苷酸个核苷酸 聚合而成聚合而成。 (2)反应物：反应物：4种种_(dATP、dGTP、dCTP、 dTTP)。 (3)DNA聚合酶：常用的聚合酶：常用的DNA聚合酶是从一种嗜热菌中分聚合酶是从一种嗜热菌中分 离得到的离得到的

5、_。 寡核苷酸寡核苷酸 脱氧核苷酸脱氧核苷酸 Taq聚合酶聚合酶 (4)模板模板DNA：既可来源于动物：既可来源于动物、植物植物、微生微生 物物，也可来源于人工合成也可来源于人工合成。 (5)Mg2 ：提供 ：提供DNA聚合反应的离子条件聚合反应的离子条件。 (6)_ ：提供反应的溶液体系：提供反应的溶液体系。 2.PCR扩增过程扩增过程 变性变性退火退火延伸延伸 (1)变性：在变性：在94 高温下作为模板的双链高温下作为模板的双链DNA_成为成为 单链单链DNA。 反应缓冲液反应缓冲液 解旋解旋 (2)退火：反应体系的温度降至退火：反应体系的温度降至4060 ，使得使得_ 与作为模板的单链与

6、作为模板的单链DNA上特定部位相互配对上特定部位相互配对、结合结合。 (3)延伸：反应体系的温度回升到延伸：反应体系的温度回升到72 左右，在单链上左右，在单链上4种种 脱氧核苷酸按照脱氧核苷酸按照_的原则连接在引物之后，的原则连接在引物之后， 使引物链延伸，形成互补的使引物链延伸，形成互补的_。 引物引物 碱基互补配对碱基互补配对 DNA双链双链 想一想想一想 2某考古学家在冰中发现了一种已经灭绝的巨型动物的某考古学家在冰中发现了一种已经灭绝的巨型动物的 肌肉肌肉，采取什么方法可以判断该动物与现今大象的采取什么方法可以判断该动物与现今大象的DNA相相 似似？ 提示：提示：用用PCR技术扩增该

7、动物的技术扩增该动物的DNA，与大象的，与大象的DNA进进 行比较。行比较。 PCR体外扩增体外扩增DNA与生物体与生物体 内内DNA复制的比较复制的比较 体内复制体内复制 PCR反应反应 不同不同 点点 解旋解旋 在解旋酶的作在解旋酶的作 用下，细胞提用下，细胞提 供能量，部分供能量，部分 解开解开 加热至加热至94 左右，左右， 双链全部解开，不双链全部解开，不 需解旋酶需解旋酶 引物引物 小段小段RNA 可以是可以是RNA或单链或单链 DNA分子片段分子片段 精讲精析精讲精析 体内复制体内复制 PCR反应反应 不不 同同 点点 合成合成 子链子链 在引物基础上，一在引物基础上，一 条链连

8、续合成，另条链连续合成，另 一条链不连续合成一条链不连续合成 分别从两条链的分别从两条链的 引物端开始，都引物端开始，都 是连续合成，控是连续合成，控 制温度在制温度在72 左左 右右 特点特点 边解旋边复制，半边解旋边复制，半 保留复制保留复制 体外迅速扩增体外迅速扩增 DNA 聚合酶聚合酶 需要需要 需要需要Taq DNA 聚合酶聚合酶 体内复制体内复制 PCR反应反应 不同不同 点点 循环循环 次数次数 受生物体自身控制受生物体自身控制 30多次多次 温度温度 体内温和条件体内温和条件 高温高温(可变可变) 产物产物 完整完整DNA DNA片段片段 相同点相同点 需提供需提供DNA复制的

9、模板复制的模板 以四种脱氧核苷酸为原料以四种脱氧核苷酸为原料 都需要一定的缓冲溶液都需要一定的缓冲溶液 子链延伸的方向都是从子链延伸的方向都是从5端到端到3 端端 特别提醒特别提醒 DNA母链的母链的3端对应着子链的端对应着子链的5端，即端，即DNA的两条的两条 链是反向平行的。链是反向平行的。 解旋酶的作用是使解旋酶的作用是使DNA两条链的氢键断开，而两条链的氢键断开，而 DNA聚合酶与聚合酶与DNA连接酶都可催化形成磷酸二酯键。连接酶都可催化形成磷酸二酯键。 DNA聚合酶是将单个核苷酸加到已有的单链片段聚合酶是将单个核苷酸加到已有的单链片段 的的3羟基上，需要模板，而羟基上，需要模板，而D

10、NA连接酶连接的是两连接酶连接的是两 条条DNA片段的缺口，不需要模板。片段的缺口，不需要模板。 在在PCR反应中，加入的四种脱氧核苷酸实际上是四反应中，加入的四种脱氧核苷酸实际上是四 种脱氧核苷三磷酸，既是原料，也是能源。种脱氧核苷三磷酸，既是原料，也是能源。 在在PCR反应中加入的反应中加入的Mg2 实际上是 实际上是Taq聚合酶的激聚合酶的激 活剂。活剂。 PCR技术相关知识分析技术相关知识分析 1.PCR 原理：原理：DNA 热变性的原理热变性的原理 双链双链 DNA 变性（变性（94 ） 复性（温度缓慢降低）复性（温度缓慢降低）单链 单链 DNA 精讲精析精讲精析 2. PCR引物引

11、物 (1)引物是引物是PCR特异性反应的关键，特异性反应的关键，PCR产物的特异性产物的特异性 取决于引物与模板取决于引物与模板DNA互补的程度。理论上，只要知道互补的程度。理论上，只要知道 任何一段模板任何一段模板DNA序列，就能按其设计互补的寡核苷酸序列，就能按其设计互补的寡核苷酸 链作引物，利用链作引物，利用PCR就可将模板就可将模板DNA在体外大量扩增。在体外大量扩增。 (2)引物引物3端的碱基，特别是最末及倒数第二个碱基，应端的碱基，特别是最末及倒数第二个碱基，应 严格要求配对，以避免因末端碱基不配对而导致严格要求配对，以避免因末端碱基不配对而导致PCR反反 应失败。应失败。 (3)

12、引物的特异性：引物应与核酸序列数据库的其他序列引物的特异性：引物应与核酸序列数据库的其他序列 无明显同源性。无明显同源性。 3.PCR扩增的过程扩增的过程 (1)变性：当温度上升到变性：当温度上升到94 时，双链时，双链DNA解旋为单链，解旋为单链， 如下图：如下图： (2)退火：温度下降至退火：温度下降至4060 左右时，两种引物通过碱基左右时，两种引物通过碱基 互补配对与两条单链互补配对与两条单链DNA结合，如下图：结合，如下图： (3)延伸：当温度上升至延伸：当温度上升至72 左右，溶液中的四种脱氧核苷左右，溶液中的四种脱氧核苷 酸在酸在DNA聚合酶的作用下，根据碱基互补配对原则合成新聚

13、合酶的作用下，根据碱基互补配对原则合成新 的的DNA链，如下图：链，如下图： 4. PCR扩增数目的理论计算扩增数目的理论计算 理论上理论上DNA扩增呈指数增长，若只有一个扩增呈指数增长，若只有一个DNA模板，则模板，则 复制复制n次后有次后有2n个个DNA；若一开始有；若一开始有m个个DNA模板，则模板，则 复制复制n次后有次后有m2n个个DNA。实际操作过程中，由于无。实际操作过程中，由于无 关变量的影响，一般来说，实验值要略小于理论值。从关变量的影响，一般来说，实验值要略小于理论值。从 第二轮循环开始，上一次循环的产物也作为模板参与反第二轮循环开始，上一次循环的产物也作为模板参与反 应，应， 并且由引物并且由引物延伸而成的延伸而成的DNA单链会与引物单链会与引物结合，结合， 进行进行DNA的延伸，这样，的延伸，这样，DNA聚合酶只能特异地复制聚合酶只能特异地复制 处于两个引物之间的处于两个引物之间的DNA序列，使这段序列呈指数扩序列，使这段序列呈指数扩 增。增。