大二生化实验张蕾实验六 SDS-PAGE电泳技术.pptx

1、SDS-PAGE电泳技术电泳技术分析鱼类不同组织中的总蛋白分析鱼类不同组织中的总蛋白 SDS-PAGE凝胶的制备凝胶的制备 SDS-PAGE电泳电泳 凝胶染色和脱色凝胶染色和脱色电电 泳泳 电泳是带电跟粒在电场作用下，向着与其电荷相反的电极移动的现象。这现象在1808年就发现了，但是作为一项生物化学研究的方法学却是在1937年后，随着电泳仪器等装置的改进才有了较大的进展。然而，电泳真正在生物化学和其它领域的研究中得到广泛的应用，还是在用滤纸作支持物的纸电泳问世之后。60年代以来，由于采用了新型的支持物和先进的仪器没备，所以适合于各种目的的电泳便应时而生。电电 泳泳 的的 种种 类类 1显微电泳

2、：显微电泳是用显微镜直接观察细胞等大颗粒物质电泳行为的过程。目前此法已用于研究膜结构以及癌细胞和正常细胞的差异性等方面。2.自由界面电泳：胶体溶液的溶质颗粒经过电泳后，在胶体溶液和溶剂之间形成界面的电泳过程。3.区带电泳：样品物质在惰性支持物上电泳的过程。电泳的基本原理电泳的基本原理 带电颗粒在电场中泳动的速度与电场强度和带电颗粒的净电荷量成正比，而与颗粒半径和介质粘度成反比。若颗粒是具有两性电介质性质的蛋白质分子时，它在一定pH溶液中的电荷性质是独持的。这种物质在电场中泳动一段时间后，便会集中到确定的位置上呈一条致密区带。若样品为混合的蛋白质溶液时，由于不同蛋白质的等电点和分子量是不同的，因

3、此经电泳后，就形成了泳动度不同的区带。利用此性质，便可把混合液中不同的蛋白质(或其它物质)分离开，也可用其对样品的纯度进行鉴定。在一定的条件下，任何带电颗粒都具有自己的特定泳动度。它是胶体颗粒的一个物理常数，可用其鉴定蛋白质等物质，还可用其研究蛋白质、核酸等物质的一些化学性质。影响泳动速度的因子有颗粒的性质、电场强度和溶液的性质（pH、离子强度和粘度）、电渗等。SDS-PAGE电泳原理电泳原理 聚丙烯酰胺凝胶电泳能有效地把不同类型的蛋白质分开的主要依据是样品中各种物质的电荷和分子量的差异性。而SDS-PAGE的主要依据，则是各种物质分子量的差异性。因为当SDS与蛋白质结合后，蛋内质分子即带有大

4、量的负电荷，并远远超越其原来的电荷，从而使天然蛋白质分子间的电荷差别降低乃至消除。与此同时蛋白质在SDS的作用下结构变得松散，形状趋向致。多肽与SDS结合的量几乎总成正比而与其序列无关。所以各种SDS蛋白质复合物在电泳时产生的泳动率差异，就反映出分子量的差异。在此条件下，样品分子量的对数与其在凝胶中的迁移率呈直线关系。SDS-PAGE测定蛋白质分子量的原理测定蛋白质分子量的原理 在饱和状态下，每克多肽结合的去污剂大约可达1.4g，借助已知分子质量的标准参照物就可以估测出肽链的分子质量大小。但对主链进行修饰（如糖基化）则表观分子质量会受到显著影响。因此羰基化蛋白质的表观分子质量不能真实地反映多肽

5、链的实际分子质量。SDS蛋白质复合物在强还原剂(如巯基乙醇)存在下，蛋白质分子内二硫键被打开，而不被氧化，这样分离出的谱带即为为蛋白质亚基。蛋白质结合SDS的量，受溶液pH、离子强度和缓冲液组分的影响。同时还受蛋白质中完整二硫键的影响。这也就是说，它与蛋白质的种类有关。例如、糖蛋白和某些酶(如葡萄糖氧化酶、木瓜蛋白酶以及胃蛋白酶等)与SDS的亲和力较低；又如溶菌酶在SDS作用下，其4对二硫键被打开，半径增加，因此测出的分子量是偏高的。不连续聚丙烯酰胺电泳原理不连续聚丙烯酰胺电泳原理 不连续不连续PAGE：Ornstein(1964)and Davis(1964)（1）凝胶层的不连续凝胶层的不连

6、续；浓缩胶浓度为2.5%-4%，分离胶则根据被分离样品的情况而定。（2）缓冲液离子成分的不连续缓冲液离子成分的不连续；在两层凝胶中加入前导离子，在电极缓冲液中加入尾随离子。为保持溶液的电中性及一定的pH，在缓冲液中加入一种与前导和尾随离子符号相反的离子，为缓存配对离子。在分离蛋白质样品时，常用的前导离子为Cl，甘氨酸根负离子为尾随离子，采用三羟甲基氨基甲烷（Tris）作为缓冲配对离子。（3）电位梯度的不连续电位梯度的不连续：前导离子后面形成了高的电位梯度。当前导离子、尾随离子和蛋白质迁移率和电位梯度的乘积相等时，则三种离子移动速度相同。在前导离子和尾随离子之间形成一个稳定的不断向阳极移动的界面

7、。也就是在高电位梯度和低电位梯度之间形成一个迅速移动的界面。（4）pH值的不连续值的不连续：在浓缩胶和分离胶之间有pH的不连续，这是为了控制尾随离子的解离度，从而控制其有效迁移率。要求在浓缩胶中，慢离子较所有被分离样品的有效迁移率低，以使样品夹在前导和尾随离子界面之间，使样品浓缩。而在分离胶中尾随离子的有效迁移率比所有样品的有效迁移率高，使样品不再受离子界面的影响。PAGE原理原理 浓缩胶的作用浓缩胶的作用：不连续缓冲系统样品和浓缩胶中含 Tris-HCl（pH 6.8）,上下槽缓冲液含Tris-甘氨酸（pH 8.3）。样品和浓缩胶中的氯离子形成移动界面的先导边界，而甘氨酸分子则组成尾随边界，

8、在移动界面的两边界之间是一电导较低而电位梯度较陡的区域,它推动样品中的蛋白质前移并在分离胶前沿积聚。此处分离胶pH值较高，有利于甘氨酸的解离，形成的甘氨酸离子穿过堆积的多肽并紧随氯离子之后，在分离胶中泳动。SDS多肽复合物从移动界面中解脱开来，在电位和pH值均匀的区段泳动，通过分离胶的筛分作用按照分子大小不同得到分离。PAGE原理原理分离胶的作用分离胶的作用：（1）分子筛作用：分子量大的蛋白质泳动的速度慢，分子量小的蛋白质泳动的速度快。（2）电荷的作用：大部分的蛋白质在pH8.3电极 缓冲液的条件下带有负电荷，表面负电荷多的蛋白质迁移快，反之则慢。浓缩胶分离胶加样加电场，样品浓缩在界面上电泳结

9、束SDS-PAGE的有效分离范围的有效分离范围 SDS-PAGE的有效分离范围取决于灌胶用聚丙烯酰胺的浓度和交联度。在没有交联剂的情况下，丙烯酰胺只能聚合形成粘稠的溶液，经过双丙烯酰胺交联后才能使凝胶产生刚性和伸展性，并形成SDS多肽复合物必须通过的空隙。这些空隙的大小随双丙烯酰胺：丙烯酰胺比率的增加而变小。丙烯酰胺浓度/%线性分离范围/kDa1512107.55.010-4312-6020-8036-9457-212SDS-PAGE的有效分离范围的有效分离范围注：丙烯酰胺：双丙烯酰胺的分子比是注：丙烯酰胺：双丙烯酰胺的分子比是1：29实验方法 凝胶板的制备 点样及电泳 全蛋白的染色和脱色密封

10、条梳子平，凹玻板斜楔板电泳槽DYCZ-24D型垂直板电泳槽1234聚丙烯酰胺凝胶的配制聚丙烯酰胺凝胶的配制 分离胶分离胶：每四个人为一个大组，配制20ml的分离胶。在37约聚合30min。浓缩胶浓缩胶：每四个人为一个大组，配制10ml的浓缩胶。在37约聚合30min。贮液贮液 分离胶（分离胶（10%10%）浓缩胶（浓缩胶（5%5%）30%Acr/Bis 6.7ml 0.83 ml1.5mol/L pH8.8 Tris 5 ml 1.0mol/L pH6.8 Tris 0.63 mlwater 7.9 ml 3.4 ml10%SDS 0.2 ml 0.05 ml10%AP 200 l 50 lT

11、EMED 8 l 5 lTotal volume 20ml 5ml聚丙烯酰胺凝胶制备聚丙烯酰胺凝胶制备1.安装玻璃板；2.配置分离胶；按照表中的顺序加入所需的溶液，加完TEMED后聚合反应开始，立刻混匀溶液灌胶。3.灌胶；将分离胶灌至两层玻璃板之间的间隙中，注意要给浓缩胶流出一定的空间（齿梳长再加1cm）。然后用吸管在分离胶上覆盖一层异丙醇（丙烯酰胺浓度为10%左右）或者是0.1%SDS（丙烯酰胺浓度为8%左右）。置于室温或者是37。4.聚合完成后（约30min），用滤纸将覆盖液吸走，用去离子水清洗凝胶的顶部数次（3次）以去除为聚合的丙烯酰胺。再用滤纸将水吸走。5.按照表中的体积制备浓缩胶。6

12、.将浓缩胶直接灌装在聚合好的分离胶上，立即在其中插入一块干净的齿梳，注意不要混入气泡。置于室温或者是37 聚合30min左右。7.聚合后，将齿梳取出，用去离子水将未聚合的丙烯酰胺清洗。8.安装电泳装置。9.点样。每个样品上样10l。10.电泳。先在凝胶上加8V/cm电压，待染料前沿进入分离胶后将电压调节到15V/cm继续电泳，直至溴酚蓝到达分离胶的底部，然后关闭电源。注：这里的长度指的是分离胶和浓缩胶的总长。11.卸下玻璃板，小心撬开玻璃板，标注凝胶的方向。12.染色和脱色全蛋白考马斯亮蓝染色和脱色全蛋白考马斯亮蓝染色和脱色 考马斯亮蓝染色和脱色：将凝胶置于装有染色液的大平皿中，摇床上过夜。第二天将凝胶置于脱色液中脱色，第三天来观察结果。将结果在凝胶成像系统上扫描，保存结果。思考题1.SDS-PAGE电泳的原理？2.PAGE的应用有哪些？