乙醇法提取水产品中的组胺.ppt

1、1食品科学与工程：指导教师：2 组胺（Histamine,HA）的化学名4（5）（2-氨乙基）咪唑，属于生物胺。组氨酸遇到富含组氨酸脱羧酶的细菌(如摩根氏变形杆菌、组胺无色杆菌、埃希氏大肠杆菌、链球菌、葡萄球菌等)污染后可使鱼肉中的游离组氨酸发生氨基酸脱羧反应产生组胺，反应如下：3 组胺作为人体内源活性物质，在生物细胞中具有重要的生理功能，但是当人体摄入过量的组胺时，会引起食物中毒，严重的还会危及生命。据研究发现当鱼内组胺含量达到4mg/g 或人体摄入组胺达到1.5mg/kg 体重以上时，易发生中毒。许多国家的食品卫生标准中建议用组胺含量作为鱼类和水产品中微生物腐败的指标。我国的食品卫生标准中

2、也明确规定各类海产品中组胺的允许摄入量为鲐鱼不得超过100mg/100g，其它不得超过 30mg/100g，其它国家也有对部分食品中组胺含量做了严格的限量要求。4 目前国内、外用于组胺的测定方法有AOAC 的生物学法(954.04)、化学法(957.07)、荧光法(977.13)和国标法GB/T5009.45-2003。但这些方法需用特殊的仪器设备，所用试剂、器较多，操作繁琐、费时。它们都很难达到现场快速检测的要求。胶体金法检测组胺是一种具有快速简便等优点的定性方法，其原理是组胺可以使胶体金分子凝聚沉淀，反应体系由红色变成蓝色，根据反应体系由红变蓝的程度可快速定性食物被组胺污染的程度，而快速检

3、测的方法必须有配套快速的样品预处理技术。5 国标法中样品预处理是水产品捣碎后用三氯乙酸浸泡一段时间后，过滤，再用正戊醇萃取滤液中的组胺，最后用盐酸提取后用分光光度法测定。由于当中所用试剂三氯乙酸、盐酸等都可以与胶体金试剂反应，生成蓝色沉淀，干扰试验结果，因此必须建立一种适用于胶体金快速检测的样品预处理方法。根据组胺的性质，组胺是容易溶解于乙醇溶液的，因此本文拟用乙醇法来提取水产品中的组胺，以满足胶体金法快速检测水产品中组胺的需要。6方法步骤方法步骤乙醇溶液对胶体金显色的影响乙醇溶液对胶体金显色的影响 用无水乙醇和蒸馏水配制浓度梯度为100%、90%、80%、70%、60%、50%、45%、40

4、%的乙醇溶液，用移液枪准确吸取各浓度的乙醇溶液20l与等体积的胶体金在1.5ml反应管中均匀混合，静置3min后观察反应现象。乙醇溶液对分光光度法测定的影响乙醇溶液对分光光度法测定的影响 分别配制浓度为1g/ml、5g/ml、10g/ml的组胺乙醇溶液和组胺水溶液，按1.2.6.3所述的方法进行组胺的测定，考查组胺对分光光度法显色体系的影响。7乙醇提取方法乙醇提取方法 去除鱼中不可食部分，将其捣碎、混匀，准确称取10g(精确到0.01g)样品于50ml小烧杯中，用20ml一定浓度的乙醇溶液作提取剂，在一定温度和时间下对样品进行处理，过滤。乙醇提取条件的探讨乙醇提取条件的探讨 考虑乙醇浓度、乙醇

5、提取时间、乙醇提取温度三个因素进行了单因素试验，在单因素基础上进行了L9(33)的正交试验对组胺测定中的组胺提取条件进行优化。8国标法中样品预处理方法国标法中样品预处理方法 去除鱼中不可食部分，将其捣碎、混匀，准确称取10g(精确到0.01g)样品于50ml小烧杯中，加入20mL三氯乙酸（10%）作提取剂，在室温下浸提2h-3h，过滤，取1.0ml滤液于分液漏斗中，用氢氧化钠溶液（250g/L）调pH9-10。加入3.0ml正戊醇，振摇5min，提取三次。合并滤液并用正戊醇定容至10.0ml。取1.0ml正戊醇提取液于分液漏斗中用1mol/L盐酸提取3次，合并盐酸提取液并用盐酸溶液定容至10.

6、0ml，备用。9测定方法测定方法标准曲线的绘制标准曲线的绘制 分别吸取0.00、0.20、0.40、0.60、0.80、1.00ml组胺标准使用液于10ml比色管中，再加入1ml1mol/L盐酸溶液。于各标准管中各加入15%碳酸钠溶液3ml，偶氮试剂3ml，加水至10.0ml，混匀，放置10min后于480nm处测吸光值，以组胺含量为横坐标，以吸光度值为纵坐标，绘制标准曲线，同时求得的直线回归方程为：Y=0.0192X+0.008 R2=0.9968；X吸光度；Y组胺含量（g）。10国标法中样品的测定国标法中样品的测定 准确吸取样品处理液1.0mL于10mL比色管中，再分别加入3.0mL偶氮试

7、剂和3.0mL碳酸钠溶液，用水定容至10ml，混匀，静置10min，然后以零管为参比，于480nm波长测定其吸光值，最后根据标准曲线回归方程计算出组胺的含量。乙醇提取法中样品的测定乙醇提取法中样品的测定 准确吸取样品处理液1.0mL于10mL比色管中，再分别加入1ml盐酸溶液（1mol/L）、3.0mL偶氮试剂和3.0mL碳酸钠溶液，再用水定容至10ml，混匀，静置10min，以零管为参比，于480nm波长测定其吸光值，最后根据标准曲线回归方程计算出组胺的含量。统计方法统计方法 利用SAS和Excel软件进行统计分析和数据处理 11乙醇溶液对胶体金显色的影响乙醇溶液对胶体金显色的影响 试验结果

8、表明较高浓度的乙醇溶液（100%、90%、80%、70%、60%、50%）会使胶体金沉淀，颜色由红变蓝，从而干扰试验结果。随着选用乙醇浓度的降低，发现45%浓度的乙醇溶液使胶体金试剂由红变蓝的程度减小，当使用40%浓度的乙醇溶液与胶体金混合时，胶体金颜色未发生任何反应。因此，试验中选用40%及以下的乙醇溶液作为提取剂。12乙醇溶液对分光光度法测定的影响乙醇溶液对分光光度法测定的影响 由表1可看出，乙醇体系和水体系中组胺测定的结果没有显著差异，因此乙醇溶液对分光光度法测定组胺没有显著影响。可在一定浓度的乙醇体系下用分光光度法测定样品中组胺含量。13单因素试验结果单因素试验结果乙醇的浓度对组胺测定

9、结果的影响乙醇的浓度对组胺测定结果的影响 由图1可知，乙醇的浓度从0%到40%，随着浓度的增加，测量结果有较快的增加，可能是随着乙醇的浓度的增大，组胺的溶解度增加，组胺的提取率随着提高，因此乙醇浓度40%为佳。14 由图2可知，随着提取时间的增加，组胺的测定结果随着增加，在50min时，测量结果最大；延长提取时间，测量的结果变化不明显，可能是样品中的组胺已经基本溶出，因此为了节约时间，提取时间初步定为50min。提取时间对组胺测定结果的影响提取时间对组胺测定结果的影响15 由图3可知，提取温度从20增加到60，组胺的测定结果不断减小，可能是由于温度的增加，加快了乙醇的挥发速度，从而造成乙醇有效

10、浓度下降，影响组胺的提取，造成组胺提取率降低，因此提取温度初步定为30。提取温度对组胺测定结果的影响提取温度对组胺测定结果的影响16正交试验结果正交试验结果正交试验因素水平表17乙醇提取正交试验结果乙醇提取正交试验结果 由表3可知上述三个因素中，对组胺测定结果的影响程度有以下关系:乙醇浓度(A)提取温度(C)提取时间(B)。最佳乙醇提取条A3B3C3，即乙醇浓度40%、提取时间为60min、提取温度为40。因这种条件不在正交表的试验中，所以要做验证试验。18验证试验验证试验 由正交试验结果分析可知A3B3C3为最佳优化组合，与正交试验中测得最大值的组合A2B2C3不一致，做验证试验比较其测定结

11、果，如表4所示。由表4可知优化组合的测定结果高于正交试验中的第5组试验。因此，对样品进行预处理的提取条件最佳组合为A3B3C3。19乙醇提取与组胺国标测定方法的比较结果乙醇提取与组胺国标测定方法的比较结果 由5结果可知，乙醇提取法与国标提取方法相比，为国标提取法的54.03%。但其方法简便，快捷，大大缩短了提取时间，减少了烦琐的操作过程，此外由于胶体金法测定组胺的方法检出限较低，因此虽然提取率不够高，但可以满足胶体金法对组胺的定性、半定量的测定。20（1）乙醇浓度对胶体金显色的影响结果表明：乙醇浓度大于45%时，会使胶体金生成蓝色沉淀，从而干扰试验结果。试验中应选择浓度不大于40%的乙醇溶液作

12、为样品中组胺的提取剂。（2）乙醇体系和水体系中组胺测定的结果没有显著差异，因此乙醇溶液对分光光度法测定组胺没有显著影响。可在一定浓度的乙醇体系下用分光光度法测定样品中组胺含量。21（3）单因素试验和正交试验结果表明：影响乙醇提取因素的主次顺序为乙醇浓度提取温度提取时间；最佳提取条件为乙醇浓度为40%，提取时间为60min，提取温度为40。（4）乙醇提取法与组胺国标提取方法比较结果表明：乙醇提取法与国标提取方法相比，为国标提取法的54.03%。方法简便，快捷，由于胶体金法测定组胺的方法检出限较低，因此可以满足胶体金法对组胺的定性、半定量的测定。22 本次毕业论文从选题到论文的完成的全过程，每一个环节都少不了指导老师的细心指导，因此，要特别感谢的是王丽老师，您辛苦了！除此之外，也要感谢实验中帮助过我的同学和老师们，最后还要感谢食品药品学院的全体教师，您们的辛勤工作是我们不断成长的助推力。23