流式细胞技术和流式细胞仪.ppt

1、临床检验仪器浙江中医药大学附属第一医院 刘铁柱第十一章第十一章 流式细胞技术与流式细胞技术与流式细胞仪流式细胞仪 本章内容提要 概述概述 第一节第一节 流式细胞仪的工作原理流式细胞仪的工作原理 第二节第二节 流式细胞仪的分类与结构流式细胞仪的分类与结构 第三节第三节 流式细胞仪的主要性能指标流式细胞仪的主要性能指标 第四节第四节 流式细胞仪应用的技术要求流式细胞仪应用的技术要求 第五节第五节 FCMFCM的维护及常见故障的排除的维护及常见故障的排除 第六节第六节 流式细胞仪的临床应用流式细胞仪的临床应用 本章内容小结本章内容小结概述概述 流式细胞仪的定义流式细胞仪的定义流式细胞术的定义流式细胞

2、术的定义生物学颗粒的内容生物学颗粒的内容流式细胞仪的发展史流式细胞仪的发展史概述概述 流式细胞仪的定义流式细胞仪的定义:流式细胞仪是以激流式细胞仪是以激光为光源，集流体力学技术、电子物光为光源，集流体力学技术、电子物理技术、光电测量技术、计算机技术理技术、光电测量技术、计算机技术以及细胞荧光化学技术、单克隆抗体以及细胞荧光化学技术、单克隆抗体技术为一体的新型高科技仪器。技术为一体的新型高科技仪器。概述概述 流式细胞术的定义流式细胞术的定义:应用流式细胞仪对应用流式细胞仪对于处在快速直线流动状态中的细胞或于处在快速直线流动状态中的细胞或生物颗粒进行快速的、多参数的定量生物颗粒进行快速的、多参数的

3、定量分析和分选的技术称为流式细胞术。分析和分选的技术称为流式细胞术。概述概述 生物学颗粒包括大的免疫复合物、生物学颗粒包括大的免疫复合物、DNADNA、RNARNA、蛋白质、病毒颗粒、脂质体、蛋白质、病毒颗粒、脂质体、细胞器、细菌、霉菌、染色体、真核细胞、细胞器、细菌、霉菌、染色体、真核细胞、杂交细胞、聚集细胞等，所检测的生物颗杂交细胞、聚集细胞等，所检测的生物颗粒的理化性质包括细胞大小、细胞形态、粒的理化性质包括细胞大小、细胞形态、胞浆颗粒化程度、胞浆颗粒化程度、DNADNA含量、总蛋白质含量、含量、总蛋白质含量、细胞膜完整性和酶活性等。细胞膜完整性和酶活性等。概述概述 1934 1934年

4、：年：MoldavanMoldavan19671967年：年：Van DillaVan Dilla 和和Los AlamosLos Alamos 1965 1965年：年：KamentskyKamentsky 1969 1969年：年：FulwylerFulwyler利用利用SweetSweet 80 80年代年代 90 90年代年代概述概述 1934 1934年年MoldavanMoldavan 使悬浮的血红细使悬浮的血红细胞从一个毛细玻璃管中流过，每个通胞从一个毛细玻璃管中流过，每个通过的细胞可被一个光电装置记录下来，过的细胞可被一个光电装置记录下来，这可谓流式细胞仪的最初模型。这可谓流式

5、细胞仪的最初模型。概述概述 1965 1965年年KamentskyKamentsky用紫外吸收和可用紫外吸收和可见光散射两个参数同时测量未染色的见光散射两个参数同时测量未染色的细胞，给出了细胞中核酸的含量和细细胞，给出了细胞中核酸的含量和细胞大小，奠定了多参数流式细胞测量胞大小，奠定了多参数流式细胞测量的基础。的基础。概述概述 1967 1967年年Van DillaVan Dilla 和和Los AlamosLos Alamos采用了采用了Crosland-TaylorCrosland-Taylor设计的层流流设计的层流流动室和氩离子激光器开发出了液流束、动室和氩离子激光器开发出了液流束、

6、照明光轴，检测系统三者互相垂直的照明光轴，检测系统三者互相垂直的流式细胞仪，成为目前各种流式细胞流式细胞仪，成为目前各种流式细胞测量仪的基础。测量仪的基础。概述概述 1969 1969年年FulwylerFulwyler利用利用SweetSweet的静电的静电墨水喷射液滴偏转技术，建立了流式墨水喷射液滴偏转技术，建立了流式细胞分选术。细胞分选术。EhrlichEhrlich和和WheelessWheeless利用利用飞点扫描技术和缝扫描技术使零分辨飞点扫描技术和缝扫描技术使零分辨率的流式细胞仪变成了低分辨率的流率的流式细胞仪变成了低分辨率的流式细胞仪。式细胞仪。概述概述 80 80年代以来，流

7、式细胞仪的数据年代以来，流式细胞仪的数据采集、存储、显示、分析日趋完善，采集、存储、显示、分析日趋完善，随着样品制备方法的增多，新的荧光随着样品制备方法的增多，新的荧光染料和细胞标记物的出现，流式细胞染料和细胞标记物的出现，流式细胞仪的应用范围逐渐扩大。仪的应用范围逐渐扩大。概述概述 进入进入9090年代，标本制备仪和自动年代，标本制备仪和自动进样器的问世，以及适合临床应用的进样器的问世，以及适合临床应用的单克隆抗体的增加，使流式细胞仪不单克隆抗体的增加，使流式细胞仪不仅出现在大专院校和科研单位，它也仅出现在大专院校和科研单位，它也逐渐进入医院的中心实验室和检验科。逐渐进入医院的中心实验室和检

8、验科。第一节第一节 流式细胞仪的工作原理流式细胞仪的工作原理第一节第一节 流式细胞仪的工作原理流式细胞仪的工作原理 一、生物学颗粒分析原理一、生物学颗粒分析原理 二、细胞分选原理二、细胞分选原理第一节第一节 流式细胞仪的工作原理流式细胞仪的工作原理一、分析原理：将悬浮分散的一、分析原理：将悬浮分散的单细胞悬液，经特异荧光单细胞悬液，经特异荧光染料染色后，放人样品管。染料染色后，放人样品管。在气体压力的作用下，悬在气体压力的作用下，悬浮在样品管中的单细胞悬浮在样品管中的单细胞悬液形成样品流垂直进入流液形成样品流垂直进入流式细胞仪的流动室，沿流式细胞仪的流动室，沿流动室的轴心向下流动。动室的轴心向

9、下流动。第一节第一节 流式细胞仪的工作原理流式细胞仪的工作原理 流动室轴心至外壁的鞘液也向下流动，流动室轴心至外壁的鞘液也向下流动，形成包绕细胞悬液的鞘液流，鞘液和形成包绕细胞悬液的鞘液流，鞘液和样品流在喷嘴附近组成一个圆柱流束，样品流在喷嘴附近组成一个圆柱流束，自喷嘴的圆形孔喷出，与水平方向的自喷嘴的圆形孔喷出，与水平方向的激光束垂直相交，相交点称为测量区。激光束垂直相交，相交点称为测量区。第一节第一节 流式细胞仪的工作原理流式细胞仪的工作原理 染色的细胞在测量区受激光照射后发染色的细胞在测量区受激光照射后发出荧光，同时产生光散射。这些信号出荧光，同时产生光散射。这些信号分别被光电倍增管和光

10、电二极管接收，分别被光电倍增管和光电二极管接收，经过计算机储存、计算、分析这些数经过计算机储存、计算、分析这些数字化信息，就可得细胞的大小和核酸字化信息，就可得细胞的大小和核酸含量等指标。含量等指标。第一节第一节 流式细胞仪的工作原理流式细胞仪的工作原理 二、分选原理：当某类细二、分选原理：当某类细胞的特性与要分选的细胞胞的特性与要分选的细胞相同时，流式细胞仪就会相同时，流式细胞仪就会在这类细胞形成液滴时给在这类细胞形成液滴时给含有这类细胞的液滴充以含有这类细胞的液滴充以特定的电荷，带有电荷的特定的电荷，带有电荷的液滴向下落入偏转板间的液滴向下落入偏转板间的静电场时，依所带电荷的静电场时，依所

11、带电荷的符号分别向左偏转或向右符号分别向左偏转或向右偏转，落入指定的收集器偏转，落入指定的收集器内。内。第二节第二节 流式细胞仪的分类和基本结构流式细胞仪的分类和基本结构 一、流式细胞仪的分类一、流式细胞仪的分类 （一）流动室与液流驱动系统（一）流动室与液流驱动系统 （二）激光光源与光束成形系统（二）激光光源与光束成形系统 （三）光学系统（三）光学系统 （四）信号检测与分析（四）信号检测与分析 （五）细胞分选器（五）细胞分选器 二、流式细胞仪的基本结构二、流式细胞仪的基本结构第二节第二节 流式细胞仪的分类和基本结构流式细胞仪的分类和基本结构一、流式细胞仪的分类一、流式细胞仪的分类流式细胞仪根据

12、功能不同可分为临床型和科流式细胞仪根据功能不同可分为临床型和科研型。研型。临床型只有分析功能，没有分选功能，操作临床型只有分析功能，没有分选功能，操作简便。简便。科研型既有分析功能又有分选功能，可快速科研型既有分析功能又有分选功能，可快速将所感兴趣的细胞分选出来。将所感兴趣的细胞分选出来。第二节第二节 流式细胞仪的分类和基本结构流式细胞仪的分类和基本结构一、流式细胞仪的分类一、流式细胞仪的分类流式细胞仪根据结构不同分为一般式和流式细胞仪根据结构不同分为一般式和狭缝扫描流式狭缝扫描流式 一般式的光斑直径大于细胞体积，只能检测细胞一般式的光斑直径大于细胞体积，只能检测细胞生化参数。生化参数。狭缝扫

13、描流式细胞仪被检细胞直径大于激光光斑狭缝扫描流式细胞仪被检细胞直径大于激光光斑直径，可计算出细胞直径大小、核直径大小、核直径，可计算出细胞直径大小、核直径大小、核浆比例等一系列的形态学信息的定量资料。浆比例等一系列的形态学信息的定量资料。第二节第二节 流式细胞仪的分类与结构流式细胞仪的分类与结构 狭缝扫描流式细胞仪狭缝扫描流式细胞仪 被检细胞直被检细胞直径大于激光光斑径大于激光光斑直径，细胞通过直径，细胞通过光束时各部分被光束时各部分被依次扫描。依次扫描。第二节第二节 流式细胞仪的分类和基本结流式细胞仪的分类和基本结构构 流式细胞仪的结构可流式细胞仪的结构可分为流动室及液流驱动系分为流动室及液

14、流驱动系统；激光光源及光束成形统；激光光源及光束成形系统；光学系统；信号检系统；光学系统；信号检测与存贮、显示、分析系测与存贮、显示、分析系统；细胞分选系统等五个统；细胞分选系统等五个部分。部分。第二节第二节 流式细胞仪的分类和基本结构流式细胞仪的分类和基本结构二、流式细胞仪的基本结构二、流式细胞仪的基本结构（一）流动室与液流驱动系统（一）流动室与液流驱动系统 流动室由石英玻璃制成，并在石英玻璃中央开一流动室由石英玻璃制成，并在石英玻璃中央开一个孔，供细胞单个流过，检测区在该孔的中心，个孔，供细胞单个流过，检测区在该孔的中心，流动室内充满了鞘液流动室内充满了鞘液,鞘液的作用是将样品流环包。鞘液

15、的作用是将样品流环包。样品流在鞘流的环包下形成聚焦，保证每个细胞样品流在鞘流的环包下形成聚焦，保证每个细胞通过激光照射区的时间相等，从而得到准确的细通过激光照射区的时间相等，从而得到准确的细胞荧光信息。胞荧光信息。第二节第二节 流式细胞仪的分类和基本结构流式细胞仪的分类和基本结构 由右图可知，空由右图可知，空气泵产生压缩空气，气泵产生压缩空气，通过鞘流压力调节器通过鞘流压力调节器加在鞘液上一恒定的加在鞘液上一恒定的压力，这样鞘液以匀压力，这样鞘液以匀速运动流过流动室，速运动流过流动室，在整个系统运行中流在整个系统运行中流速是不变的。速是不变的。第二节第二节 流式细胞仪的分类和基本结构流式细胞仪

16、的分类和基本结构 由于激光焦点处能由于激光焦点处能量分布为正态分布（见量分布为正态分布（见图），中心处能量最高。图），中心处能量最高。因此，当样本速率选择因此，当样本速率选择高速时，处在样本流不高速时，处在样本流不同位置的细胞或颗粒，同位置的细胞或颗粒，受激光照射的能量不一受激光照射的能量不一样，从而被激发出的荧样，从而被激发出的荧光强度也不相同。光强度也不相同。第二节第二节 流式细胞仪的分类和基本结构流式细胞仪的分类和基本结构（二）激光光源与光束成形系统（二）激光光源与光束成形系统 激光是一种相干光源，它能提供单波激光是一种相干光源，它能提供单波长、高强度及稳定性高的光照。由于细胞长、高强度

17、及稳定性高的光照。由于细胞的快速流动，每个细胞经过光照区的时间的快速流动，每个细胞经过光照区的时间仅为仅为1s1s左右，且细胞所携带荧光物质被左右，且细胞所携带荧光物质被激发出的荧光信号强弱，与被照射的时间激发出的荧光信号强弱，与被照射的时间和激发光的强度有关，因此细胞必须达到和激发光的强度有关，因此细胞必须达到足够的光照强度。足够的光照强度。第二节第二节 流式细胞仪的分类和基本结构流式细胞仪的分类和基本结构（三）光学系统（三）光学系统FCMFCM的光学系统是由若干组透镜、滤光片和的光学系统是由若干组透镜、滤光片和小孔组成。小孔组成。滤光片主要分为：滤光片主要分为：1.1.长通滤光片长通滤光片

18、 长通滤光片使特定波长以长通滤光片使特定波长以 上的光通过。上的光通过。2.2.短通滤光片短通滤光片 特定波长以下的光通过。特定波长以下的光通过。3.3.带通滤光片带通滤光片 带通滤光片允许一定波长带通滤光片允许一定波长 范围内的光通过范围内的光通过第二节第二节 流式细胞仪的分类和基本结构流式细胞仪的分类和基本结构（四）信号检测与分析（四）信号检测与分析 当细胞携带荧光素标记物，通过激光当细胞携带荧光素标记物，通过激光照射区时，细胞内不同物质产生不同波长照射区时，细胞内不同物质产生不同波长的荧光信号。这些信号以细胞为中心，向的荧光信号。这些信号以细胞为中心，向空间空间360360度立体角发射，

19、产生散射光和荧光度立体角发射，产生散射光和荧光信号。信号。第二节第二节 流式细胞仪的分类和基本结构流式细胞仪的分类和基本结构（四）信号检测与分析（四）信号检测与分析 1.1.散射光信号散射光信号 散射光分为前向角散散射光分为前向角散射和侧向角散射，散射光不依赖任何细胞射和侧向角散射，散射光不依赖任何细胞样品的制备技术样品的制备技术(如染色如染色)，称为细胞的物，称为细胞的物理参数（或称固有参数）。理参数（或称固有参数）。（1 1）前向角散射）前向角散射 前向角散射与被测细胞前向角散射与被测细胞的大小有关的大小有关（2 2）侧向角散射）侧向角散射 侧向散射光侧向散射光可提供细胞内精细结构和颗粒性

20、质的信息。可提供细胞内精细结构和颗粒性质的信息。第二节第二节 流式细胞仪的分类和基本结构流式细胞仪的分类和基本结构（四）信号检测与分析（四）信号检测与分析 2.2.荧光信号荧光信号 当激光光束与细胞正交当激光光束与细胞正交时，一般会产生两种荧光信号。一种是细时，一般会产生两种荧光信号。一种是细胞自身在激光照射下发出微弱的荧光信号，胞自身在激光照射下发出微弱的荧光信号，称为细胞自发荧光；另一种是经过特异荧称为细胞自发荧光；另一种是经过特异荧光素标记细胞后，受激发照射得到的荧光光素标记细胞后，受激发照射得到的荧光信号，通过对这类荧光信号的检测和定量信号，通过对这类荧光信号的检测和定量分析能了解所研

21、究细胞的性质和数量。分析能了解所研究细胞的性质和数量。第二节第二节 流式细胞仪的分类和基本结构流式细胞仪的分类和基本结构 临床型临床型FCM常用的激光器为常用的激光器为488nm,常用的常用的染料有碘化丙啶染料有碘化丙啶 PI,藻红蛋白藻红蛋白 PE,等。等。有的仪器还配置了半导体激光器有的仪器还配置了半导体激光器(波长波长635nm)可激发可激发APC 等染料等染料,拓宽了拓宽了FCM的的应用范围。应用范围。第二节第二节 流式细胞仪的分类和基本结构流式细胞仪的分类和基本结构（四）信号检测与分析（四）信号检测与分析2.2.荧光信号荧光信号 （1 1）荧光信号线性测量和对数测量）荧光信号线性测量

22、和对数测量线性放大器的输出与输入是线性关系，细线性放大器的输出与输入是线性关系，细胞胞DNADNA含量、含量、RNARNA含量、总蛋白质含量等的含量、总蛋白质含量等的测量一般选用线性放大测量。在细胞膜表测量一般选用线性放大测量。在细胞膜表面抗原等的荧光检测时通常使用对数放大面抗原等的荧光检测时通常使用对数放大器。器。第二节第二节 流式细胞仪的分类和基本结构流式细胞仪的分类和基本结构（四）信号检测与分析（四）信号检测与分析2.2.荧光信号荧光信号 （2 2）荧光信号的面积和宽度）荧光信号的面积和宽度荧光信号的面积是采用对荧光光通量进荧光信号的面积是采用对荧光光通量进 行积分测量，一般对行积分测量

23、，一般对DNADNA倍体测量时采用倍体测量时采用 面积，这是因为荧光脉冲的面积比荧光面积，这是因为荧光脉冲的面积比荧光 脉冲的高度更能准确反映脉冲的高度更能准确反映DNADNA的含量。的含量。荧光信号的宽度常用来区分双连体细胞。荧光信号的宽度常用来区分双连体细胞。第二节第二节 流式细胞仪的分类和基本结构流式细胞仪的分类和基本结构（四）信号检测与分析（四）信号检测与分析2.2.荧光信号荧光信号 （3 3）光谱重叠的校正）光谱重叠的校正 当细胞携带两种荧光受激光激发而发当细胞携带两种荧光受激光激发而发射两种不同波长的荧光时，理论上可选择射两种不同波长的荧光时，理论上可选择滤片使每种荧光仅被相应的检

24、测器检测，滤片使每种荧光仅被相应的检测器检测，但由于目前所使用的各种荧光染料都是宽但由于目前所使用的各种荧光染料都是宽发射谱性质，虽然它们之间发射峰值各不发射谱性质，虽然它们之间发射峰值各不相同，但发射谱范围有一定的重叠。相同，但发射谱范围有一定的重叠。第二节第二节 流式细胞仪的分类和基本结构流式细胞仪的分类和基本结构 从右图中可以看从右图中可以看出，阴影为探测器检出，阴影为探测器检测光谱的范围，测光谱的范围，FITCFITC探测器会探测到少量探测器会探测到少量的的PEPE光谱，而光谱，而PEPE探测探测器则检测到较多的器则检测到较多的FITCFITC光谱。光谱。第二节第二节 流式细胞仪的分类

25、和基本结构流式细胞仪的分类和基本结构为了减少各荧光间的相互补偿为了减少各荧光间的相互补偿,通常采用双激光立体四色通常采用双激光立体四色FCMFCM系统系统,原理如图中点原理如图中点A A通过透镜通过透镜f f成像在成像在AA处，而点处，而点B B通通过透镜过透镜f f成像在成像在BB处。处。在光电倍增管前放上一在光电倍增管前放上一小孔，作为空间滤波器，小孔，作为空间滤波器，排除其它杂散光信号，排除其它杂散光信号，从而确保了从而确保了A A点光源进不点光源进不了了BB点处，点处，B B点光源也点光源也进不了进不了AA点处。点处。第二节第二节 流式细胞仪的分类和基本结构流式细胞仪的分类和基本结构（

26、五）细胞分选器（五）细胞分选器1 1小水滴的形成小水滴的形成压电晶体带动流动室振动，液流形成水滴。压电晶体带动流动室振动，液流形成水滴。喷嘴的振动频率即每秒钟产生水滴的喷嘴的振动频率即每秒钟产生水滴的数目。当喷嘴直径为数目。当喷嘴直径为50m50m时，信号频率时，信号频率为为40kHz40kHz，则每秒钟产生，则每秒钟产生4 4万个水滴。若每万个水滴。若每秒钟流出的细胞是秒钟流出的细胞是10001000个，则平均每个，则平均每4040个个水滴中只有一个水滴是有细胞的，其他皆水滴中只有一个水滴是有细胞的，其他皆为空白。为空白。第二节第二节 流式细胞仪的分类和基本结构流式细胞仪的分类和基本结构（五

27、）细胞分选器（五）细胞分选器2 2逻辑电路逻辑电路 为了分选细胞，需要细胞在经过测量为了分选细胞，需要细胞在经过测量区时判断出哪个细胞满足了分选的条件，区时判断出哪个细胞满足了分选的条件，并产生一个逻辑信号，此信号驱动充电脉并产生一个逻辑信号，此信号驱动充电脉冲发生器，使之产生充电脉冲。冲发生器，使之产生充电脉冲。第二节第二节 流式细胞仪的分类和基本结构流式细胞仪的分类和基本结构（五）细胞分选器（五）细胞分选器3 3水滴的充电与偏转水滴的充电与偏转 当水滴从流束上将要断开时给整个流当水滴从流束上将要断开时给整个流束充电，则水滴从流束上断开后便带有同束充电，则水滴从流束上断开后便带有同极性的多余

28、表面电荷。下落的水滴通过一极性的多余表面电荷。下落的水滴通过一对平行板电极形成的静电场时，带正电荷对平行板电极形成的静电场时，带正电荷的水滴向带负电的电极板偏转，这样就可的水滴向带负电的电极板偏转，这样就可用容器收集水滴。用容器收集水滴。第二节第二节 流式细胞仪的分类和基本结构流式细胞仪的分类和基本结构（六）（六）FCMFCM测量数据的存贮、显示与分析测量数据的存贮、显示与分析 目前目前FCMFCM数据的存贮的方式均采用列表数据的存贮的方式均采用列表排队排队(List Mode)(List Mode)方式。目前方式。目前FCMFCM所采用的所采用的都是多参数指标，荧光标记物参数数量在都是多参数

29、指标，荧光标记物参数数量在逐渐增多。采用逐渐增多。采用List ModeList Mode方式可大量节方式可大量节约内存和磁盘容量。约内存和磁盘容量。第三节第三节 流式细胞仪的主要性能指标流式细胞仪的主要性能指标 一、荧光测量灵敏度一、荧光测量灵敏度 二、仪器的分辨率二、仪器的分辨率 三、前向角散射光检测灵敏度三、前向角散射光检测灵敏度 四、四、FCMFCM分析速度分析速度 五、五、FCMFCM分选指标分选指标第三节第三节 流式细胞仪的主要性能指标流式细胞仪的主要性能指标一、荧光测量灵敏度一、荧光测量灵敏度 灵敏度的高低是衡量仪器检测微弱灵敏度的高低是衡量仪器检测微弱荧光信号的重要指标。一般以

30、能检测到荧光信号的重要指标。一般以能检测到单个微球上最少标有单个微球上最少标有FITCFITC或或PEPE荧光分子荧光分子数目来表示，现在的数目来表示，现在的FCMFCM均可达到检测小均可达到检测小于于100100个荧光分子的指标。个荧光分子的指标。第三节第三节 流式细胞仪的主要性能指标流式细胞仪的主要性能指标二、仪器的分辨率二、仪器的分辨率 分辨率是衡量仪器测量精度的指标，分辨率是衡量仪器测量精度的指标，通常用变异系数通常用变异系数CV(CoefficientCV(Coefficient of of Variation)Variation)值表示：值表示：(是分布的标准误差，是分布的平均值是

31、分布的标准误差，是分布的平均值)%100CV第三节第三节 流式细胞仪的主要性能指标流式细胞仪的主要性能指标三、前向角散射光检测灵敏度三、前向角散射光检测灵敏度 前向角散射光检测灵敏度是指能够检前向角散射光检测灵敏度是指能够检测到的最小颗粒大小，一般目前商品化的测到的最小颗粒大小，一般目前商品化的FCMFCM可以测量到可以测量到0.2m0.2m0.5m0.5m左右。左右。第三节第三节 流式细胞仪的主要性能指标流式细胞仪的主要性能指标四、四、FCMFCM分析速度分析速度 分析速度以每秒分析的细胞数来表示。分析速度以每秒分析的细胞数来表示。当细胞流过光束的速度超过当细胞流过光束的速度超过FCMFCM

32、仪器响应速仪器响应速度时，细胞产生的荧光信号就会丢失，这度时，细胞产生的荧光信号就会丢失，这段时间称为仪器的死时间。段时间称为仪器的死时间。死时间越短，仪器处理数据越快，一死时间越短，仪器处理数据越快，一般可达到般可达到3000300060006000个个/秒左右。大型机已秒左右。大型机已达到每秒几万个细胞。达到每秒几万个细胞。第三节第三节 流式细胞仪的主要性能指标流式细胞仪的主要性能指标五、五、FCMFCM分选指标分选指标 分选指标主要包括分选速度、分选纯分选指标主要包括分选速度、分选纯度和分选收获率。度和分选收获率。分选速度指每秒可提取所要细胞的个数。分选速度指每秒可提取所要细胞的个数。分

33、选纯度指要分选的目的细胞占分选出分选纯度指要分选的目的细胞占分选出 细胞的百分比。细胞的百分比。分选收获率指被分出的细胞与原来溶液分选收获率指被分出的细胞与原来溶液 中该细胞的百分比。中该细胞的百分比。第四节第四节 流式细胞仪应用的技术要求流式细胞仪应用的技术要求 流式细胞分析仪器是一项集多学科流式细胞分析仪器是一项集多学科知识综合应用的复杂仪器，除了对仪器知识综合应用的复杂仪器，除了对仪器各方面性能指标有严格的要求以外，在各方面性能指标有严格的要求以外，在实验设计与样品处理方面也需要有丰富实验设计与样品处理方面也需要有丰富的基础理论及操作经验。的基础理论及操作经验。一、检测样品制备的重要性一

34、、检测样品制备的重要性 二、常用的荧光染料与标记染色二、常用的荧光染料与标记染色 三、三、FCMFCM操作技术的质量控制操作技术的质量控制第四节第四节 流式细胞仪应用的技术要求流式细胞仪应用的技术要求 一、检测样品制备的重要性一、检测样品制备的重要性 因为流式细胞仪测量的是每个细胞因为流式细胞仪测量的是每个细胞所产生的散射光和荧光信号，如果两个所产生的散射光和荧光信号，如果两个或多个细胞间粘连重叠或细胞碎片过多，或多个细胞间粘连重叠或细胞碎片过多，都会影响信号的收集及所收集信号的真都会影响信号的收集及所收集信号的真实性，所以制备单细胞悬液是进行流式实性，所以制备单细胞悬液是进行流式细胞仪分析最

35、关键的第一步。细胞仪分析最关键的第一步。第四节第四节 流式细胞仪应用的技术要求流式细胞仪应用的技术要求 二、常用的荧光染料与标记染色二、常用的荧光染料与标记染色 散射光信号是激光照在细胞上所产生散射光信号是激光照在细胞上所产生的前向光和侧向光信号。荧光信号来自于的前向光和侧向光信号。荧光信号来自于细胞的自发荧光或被分析细胞经特异性荧细胞的自发荧光或被分析细胞经特异性荧光标记染色后通过激光束激发后所产生的。光标记染色后通过激光束激发后所产生的。因此，被分析细胞在制备成单细胞悬液后，因此，被分析细胞在制备成单细胞悬液后，经过与荧光染料染色后才能上机进行检测。经过与荧光染料染色后才能上机进行检测。第

36、四节第四节 流式细胞仪应用的技术要求流式细胞仪应用的技术要求 三、流式细胞仪操作技术的质量控制三、流式细胞仪操作技术的质量控制 在临床检测中，应对各个工作环节和在临床检测中，应对各个工作环节和仪器性能进行严格的质量控制和规范化操仪器性能进行严格的质量控制和规范化操作，以保证各项检测数据和指标的可靠性。作，以保证各项检测数据和指标的可靠性。1 1光路与流路校正光路与流路校正 2 2PMTPMT校准校准 3 3绝对计数的校准绝对计数的校准第四节第四节 流式细胞仪应用的技术要求流式细胞仪应用的技术要求 1 1光路与流路校正光路与流路校正 主要目的在于确保激光光路与样品流主要目的在于确保激光光路与样品

37、流处于正交状态，使仪器检测时的变异减少处于正交状态，使仪器检测时的变异减少到最小，从而控制仪器的到最小，从而控制仪器的CVCV值。在流路校值。在流路校正物中，有标准大小的荧光微球，其物理正物中，有标准大小的荧光微球，其物理性质、生物学特性和化学特性均经过标定。性质、生物学特性和化学特性均经过标定。第四节第四节 流式细胞仪应用的技术要求流式细胞仪应用的技术要求 2 2PMTPMT校准校准 流式细胞仪在使用过程中，光电倍流式细胞仪在使用过程中，光电倍增管随时间的增加，其放大功率会有所增管随时间的增加，其放大功率会有所改变，对样品检测的灵敏度会产生影响。改变，对样品检测的灵敏度会产生影响。为保证样品

38、检测时仪器处于最佳工作状为保证样品检测时仪器处于最佳工作状态，采用质控品进行态，采用质控品进行PMTPMT校准，必要时校准，必要时进行电压补偿。进行电压补偿。第四节第四节 流式细胞仪应用的技术要求流式细胞仪应用的技术要求 3 3绝对计数的校准绝对计数的校准 为保证仪器在计数时的准确性，仪为保证仪器在计数时的准确性，仪器应采用绝对计数标准品建立绝对计数器应采用绝对计数标准品建立绝对计数标准。该标准品是经标定的，如以计算标准。该标准品是经标定的，如以计算10001000个细胞为个细胞为1ml1ml，作为设定标准。，作为设定标准。在样本测定时，以此为标准进行绝对计在样本测定时，以此为标准进行绝对计数

39、，从而获得绝对计数的标准值。数，从而获得绝对计数的标准值。第五节第五节 FCMFCM的维护及常见故障的排除的维护及常见故障的排除 一、仪器的维护一、仪器的维护1.1.激光电源的波动范围应小于激光电源的波动范围应小于10%10%。2.2.冷却水须用过滤器，并保证压力和流量。冷却水须用过滤器，并保证压力和流量。3.3.室温在室温在18182424，相对湿度小于，相对湿度小于85%85%。4.4.安装单独的可靠的地线。安装单独的可靠的地线。5.5.仪器操作必须有经过培训的人员操作。仪器操作必须有经过培训的人员操作。6.6.样品和鞘液管道每周应用漂白粉液清洗。样品和鞘液管道每周应用漂白粉液清洗。第五节

40、第五节 FCMFCM的维护及常见故障的排除的维护及常见故障的排除故障信息故障信息 引起故障的原因引起故障的原因 解决方法解决方法 清洗液高度错误清洗液高度错误 清洗液少了清洗液少了 加清洗液加清洗液 清洗液高度警示清洗液高度警示 清洗液传感器失清洗液传感器失灵灵 与公司联系与公司联系 数据处理速率错数据处理速率错误误 数据太大，难以数据太大，难以处理处理 稀释样品稀释样品 文件名错误文件名错误 输入的文件名与输入的文件名与系统冲突系统冲突 输入另一个文件输入另一个文件名名 二、常见故障及排除二、常见故障及排除第五节第五节 FCMFCM的维护及常见故障的排除的维护及常见故障的排除故障信息故障信息

41、 引起故障的原因引起故障的原因 解决方法解决方法 存取数据时发生存取数据时发生错误错误 流式细胞仪不能流式细胞仪不能存取数据存取数据 关开计算机重试关开计算机重试 程序错误程序错误 软件不能执行该软件不能执行该程序程序 选择主菜单上的选择主菜单上的重建项重建项 程序号太大程序号太大 程序号不能大于程序号不能大于32 32 取消一些程序，取消一些程序，再输入相应号码再输入相应号码 没有激光束没有激光束 激光器关闭激光器关闭 检查电源，开激检查电源，开激光器光器 二、常见故障及排除二、常见故障及排除第五节第五节 FCMFCM的维护及常见故障的排除的维护及常见故障的排除故障信息故障信息 引起故障的原

42、因引起故障的原因 解决方法解决方法 激光器开启错误激光器开启错误 激光器门打开激光器门打开 关激光器门关激光器门 参数太多参数太多 选择的参数应小选择的参数应小于于8个个 取消某些参数，取消某些参数，重新选择重新选择 参数不存在参数不存在 程序中无此参数程序中无此参数 重新建立程序重新建立程序 二、常见故障及排除二、常见故障及排除第五节第五节 FCMFCM的维护及常见故障的排除的维护及常见故障的排除故障信息故障信息 引起故障的原因引起故障的原因 解决方法解决方法 样品压力错误样品压力错误 因为样品管坏了，因为样品管坏了，样品不能被压入样品不能被压入流动室流动室 换一个样品管换一个样品管 建立样

43、品压力错建立样品压力错误误 流式细胞仪连接流式细胞仪连接错误错误 检查连接，开关检查连接，开关机重试机重试 鞘液高度错误鞘液高度错误 鞘液太少鞘液太少 补充鞘液补充鞘液 二、常见故障及排除二、常见故障及排除第六节第六节 流式细胞仪的临床应用流式细胞仪的临床应用 六、六、FCMFCM对自身免疫性疾病对自身免疫性疾病HLAHLA抗原的分析抗原的分析 二、流式细胞仪在血液学中的应用二、流式细胞仪在血液学中的应用 三、流式细胞仪在细胞生物学中的应用三、流式细胞仪在细胞生物学中的应用 四、流式细胞仪在肿瘤学中的应用四、流式细胞仪在肿瘤学中的应用 五、流式细胞仪在五、流式细胞仪在AIDSAIDS病检测中的

44、分析病检测中的分析 七、流式细胞仪在药物学方面的应用七、流式细胞仪在药物学方面的应用 一、流式细胞仪在免疫学中的应用一、流式细胞仪在免疫学中的应用第六节第六节 流式细胞仪的临床应用流式细胞仪的临床应用一、流式细胞仪在免疫学中的应用一、流式细胞仪在免疫学中的应用 流式细胞术广泛地应用于免疫理论研流式细胞术广泛地应用于免疫理论研究及其临床实践，所以有人称之为现代免究及其临床实践，所以有人称之为现代免疫技术基石之一。尤其同单克隆抗体的结疫技术基石之一。尤其同单克隆抗体的结合应用，在淋巴细胞及其亚群分析、淋巴合应用，在淋巴细胞及其亚群分析、淋巴细胞功能分析、免疫分型、分选、肿瘤细细胞功能分析、免疫分型

45、、分选、肿瘤细胞的免疫检测、研究细胞周期等方面都起胞的免疫检测、研究细胞周期等方面都起着相当重要的作用。着相当重要的作用。第六节第六节 流式细胞仪的临床应用流式细胞仪的临床应用二、流式细胞仪在血液学中的应用二、流式细胞仪在血液学中的应用 血液病多为肿瘤性、免疫性和遗传性血液病多为肿瘤性、免疫性和遗传性疾病，恶性血液病约占其总数一半以上。疾病，恶性血液病约占其总数一半以上。FCMFCM在血液细胞的分类、分型，造血细胞在血液细胞的分类、分型，造血细胞分化的研究，血细胞中各种酶的定量分析，分化的研究，血细胞中各种酶的定量分析，如过氧化物酶、非特异性酯酶等方面应用如过氧化物酶、非特异性酯酶等方面应用广

46、泛。广泛。第六节第六节 流式细胞仪的临床应用流式细胞仪的临床应用三、流式细胞仪在细胞生物学中的应用三、流式细胞仪在细胞生物学中的应用 细胞生物学研究中，应用最频繁也最细胞生物学研究中，应用最频繁也最普通的是细胞周期分析，研究细胞周期或普通的是细胞周期分析，研究细胞周期或DNADNA倍体与细胞表面受体及抗原表达的关系，倍体与细胞表面受体及抗原表达的关系，包括细胞周期各时相的百分比和细胞周期包括细胞周期各时相的百分比和细胞周期动力学参数的测定等内容。对同一细胞的动力学参数的测定等内容。对同一细胞的参数测定技术则导致了对细胞周期的一些参数测定技术则导致了对细胞周期的一些新发现，典型的方法是吖啶橙双染

47、色技术。新发现，典型的方法是吖啶橙双染色技术。第六节第六节 流式细胞仪的临床应用流式细胞仪的临床应用四、流式细胞仪在肿瘤学中的应用四、流式细胞仪在肿瘤学中的应用 近年来荧光细胞化学技术的发展，以近年来荧光细胞化学技术的发展，以及荧光探针标记的单克隆抗体，为流式细及荧光探针标记的单克隆抗体，为流式细胞技术研究各种肿瘤抗原、肿瘤蛋白、致胞技术研究各种肿瘤抗原、肿瘤蛋白、致癌基因开辟了新途径，极大地提高了肿瘤癌基因开辟了新途径，极大地提高了肿瘤学的研究水平，并为流式细胞技术在肿瘤学的研究水平，并为流式细胞技术在肿瘤学的研究中开辟了更广阔的应用前景。学的研究中开辟了更广阔的应用前景。第六节第六节 流式

48、细胞仪的临床应用流式细胞仪的临床应用五、流式细胞仪在五、流式细胞仪在AIDSAIDS病检测中的分析病检测中的分析 流式细胞术用于流式细胞术用于AIDSAIDS免疫功能的检测免疫功能的检测是最重要的检测手段，采用三参数荧光标是最重要的检测手段，采用三参数荧光标记计数可对记计数可对T T淋巴细胞及亚群进行分析，淋巴细胞及亚群进行分析，并通过动态监测并通过动态监测T T细胞亚群可以对细胞亚群可以对HIVHIV感染感染者或者或AIDSAIDS发病者进行区别。发病者进行区别。第六节第六节 流式细胞仪的临床应用流式细胞仪的临床应用六、六、FCMFCM对自身免疫性疾病对自身免疫性疾病HLAHLA抗原的分析抗

49、原的分析 利用利用FCMFCM可以进行可以进行HLA-B27HLA-B27HLA-B7HLA-B7双标记抗体检测双标记抗体检测HLA-B27HLA-B27阳性细胞，同时阳性细胞，同时又可排出交叉反应。通常又可排出交叉反应。通常58589797的的强直性脊柱炎患者可检出这种抗原，而强直性脊柱炎患者可检出这种抗原，而正常人仅正常人仅2 27 7可检出这种抗原。可检出这种抗原。FCMFCM检测检测HLA-B27HLA-B27快速、特异、敏感，为强制快速、特异、敏感，为强制性脊柱炎的临床诊断提供了有力的帮助。性脊柱炎的临床诊断提供了有力的帮助。第六节第六节 流式细胞仪的临床应用流式细胞仪的临床应用七、

50、流式细胞仪在药物学方面的应用七、流式细胞仪在药物学方面的应用 流式细胞仪在检测药物在细胞中的分流式细胞仪在检测药物在细胞中的分布，研究药物的作用机制方面应用广泛。布，研究药物的作用机制方面应用广泛。亦可用于筛选新药，如化疗药物对肿瘤细亦可用于筛选新药，如化疗药物对肿瘤细胞的凋亡机制，可通过测胞的凋亡机制，可通过测DNADNA凋亡峰，凋亡峰，Bcl-2Bcl-2凋亡调节蛋白等进行观察。凋亡调节蛋白等进行观察。本章小结本章小结 本章简要介绍了流式细胞术和流式本章简要介绍了流式细胞术和流式细胞仪的基本概念。细胞仪的基本概念。论述了流式细胞仪的基本原理、论述了流式细胞仪的基本原理、流式细胞仪的分类和基