药品质量研究与质量标准-有关物质检查常见问题讨论课件.ppt

1、药品质量研究与质量标准-有关物质检查常见问题讨论-余立幻灯片 本课件本课件PPT仅供大家学习使用仅供大家学习使用 学习完请自行删除，谢谢！学习完请自行删除，谢谢！本课件本课件PPT仅供大家学习使用仅供大家学习使用 学习完请自行删除，谢谢！学习完请自行删除，谢谢！第一次飞跃第二次飞跃纯度控制纯度控制杂质控制杂质控制杂质谱杂质谱控制控制杂质质控理念的变迁杂质Impurity的定义与分类 任何影响药品纯度的物质均称为杂质。-?中国药典?2021年版附录对药品杂质的定义 原料药中：化学构造和该药品不一样的任何物质 制剂中：除原料药和辅料外的任何其他成分 -ICH对杂质的定义 杂质按活性分类杂质杂质活性

2、杂质活性杂质无活性杂质无活性杂质（无毒无效）（无毒无效）毒性杂质毒性杂质（有毒无效）（有毒无效）（毒大效低）（毒大效低）有效杂质有效杂质（有效无毒）（有效无毒）（高效低毒）（高效低毒）杂质按来源分类杂质杂质有关物质有关物质（related substances）无关杂质无关杂质 外源物质外源物质 杂质来源1 有关物质有关物质起始原料起始原料中间体、副产物中间体、副产物 异构体和聚合物异构体和聚合物 多晶型多晶型降解产物降解产物 异构体和聚合物异构体和聚合物 多晶型多晶型微生物微生物污染异物污染异物非法添加非法添加 物物3 外源物质外源物质2无关杂质无关杂质试剂试剂 配位体、无机配位体、无机 盐

3、、溶剂盐、溶剂重金属催化剂重金属催化剂 过滤介质、活过滤介质、活 性炭性炭已鉴定杂质Identified Impurity特定杂质Specified Impurity潜在杂质PotentialImpurity杂质谱Impurity Profile已确证了结构特征的杂质在质量标准中规定检查并有自己限度标准的杂质。已鉴定或未鉴定理论推测在生产或贮藏过程中可能产生的杂质实际产品中不一定存在存在于药品中的所有杂质组成或模式新杂质的研究 药物杂质的可能来源1.原料：红霉素 A、红霉素 B、红霉素 C、红霉素D、红霉素 E、红霉素 F、阿奇霉素B、阿奇霉素C、阿奇霉素E、阿奇霉素F2.中间体：红霉素A肟（

4、Z）、6，9-亚胺醚、氮红霉素A、红霉素A肟（E）、红霉素 C肟（E）、9，11-亚胺醚、红霉素C 6，9-亚胺醚、红霉素A内酰胺 3.副产物：红霉素-N-氧化物、N-去甲基红霉素A、N-去甲基阿奇霉素A、氨基阿奇霉素A、N-甲酰基-N去甲基阿奇霉素A、N-去甲基-N-苯磺酰基阿奇霉素、阿奇霉素N-氧化物、3-去（二甲氨基）-3,4-去氢阿奇霉素、O-甲苯磺酰基红霉素肟、红霉素Z肟重排物、氮红霉素11，12-硼酸酯、N，N-去二甲基N-甲酰基阿奇霉素A、丙基阿奇霉素、3-N，N-去二甲基氨基-酮基阿奇霉素A、阿奇霉素11，12-硼酸酯4.降解产物：去克拉克定糖阿奇霉素A、去克拉克定糖氮红霉素、

5、红霉素8，9-脱水-6，9-半缩酮、红霉素6，9：9，12-螺缩酮阿奇霉素中可能存在的杂质：37种 附录 F 药品杂质分析指导原那么 附录 A 药品质量标准分析方法验证 指导原那么2010年版药典中的杂质分析 Q3A新原料药中的杂质 Q3B新制剂中的杂质ICH中的杂质分析其他参考资料?化学药物杂质研究的技术指导原那么?化学药物质量控制分析方法验证技术指导原那么?有关物质检查的常用方法适用多种杂质（定性定量）主要用于没有紫外吸收的杂质（定性半定量）适用不同的特定杂质（定性定量）TLCHPLC其他方法有关物质检查的其他方法容量滴定原子吸收重量法比色比浊物理常数紫外其他方法 物理常数测定法 旋光度-

6、检查具有光学活性的杂质 紫外分光光度法 杂质吸光度-在特定波长具有紫外吸收的杂质 容量滴定法 游离脂肪酸、过氧化物、复原糖 重量法 酸中不溶物、水中可溶物 比色比浊法 游离淀粉、碘化物、铁盐等；氯化物、硫酸盐 有关物质检查的其他方法有关物质检查的其他方法 原子吸收分光光度法：检查金属杂质 毛细管电泳法：抑肽酶中检查去丙氨酸-去甘氨酸-抑 肽酶和去丙氨酸-抑肽酶两个特定杂质 气相色谱法：检查挥发性杂质 热分析法：检查不同晶型的杂质 拉曼光谱法、红外光谱法、X-射线粉末衍射 生物检定法、酶联免疫试剂盒抗生素残留量 有关物质检查的其他方法有关物质检查的其他方法HPLC方法的建立与验证 高效液相色谱法

7、系用高压输液泵将规定的流动相泵入装有填充剂的色谱柱进展别离测定的色谱方法。注入的供试品由流动相带入柱内，各成分在柱内被别离并依次进入检测器，由记录仪、积分仪或数据处理系统记录色谱信号。二二极极管管阵阵列列蒸蒸发发光光散射散射示差折光示差折光电电化化学学质谱质谱荧荧光光紫外紫外检测器的种类HPLCHPLC方法的建立方法的建立溶液浓度溶液浓度 流动相流动相 检测波长检测波长 色谱柱色谱柱 系统适应性系统适应性试验方法试验方法进样体积进样体积 柱温柱温 溶剂溶剂 新方法分析方法的有效性氨苄西林钠/舒巴坦钠原方法在对已有方法比较的基础上确定最佳分析方法典型的HPLC方法测定有关物质 有关物质 照高效液

8、相色谱法附录 D测定。色谱条件与系统适用性试验 用十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂；以磷酸盐缓冲液pH6.3取磷酸二氢钾9.07g，加水1000ml使溶解，用无水磷酸氢二钠溶液9.46g1000ml调节pH值至6.3，临用前稀释10倍-乙腈-甲醇36：11：3为流动相，流速每分钟1.5ml；检测波长为200nm；柱温40。分别取前列地尔对照品溶液、前列腺素A1和前列腺素B1杂质对照品溶液各适量，按1：1：1比例混合，摇匀，作为系统适用性试验用溶液。取该溶液25l注入液相色谱仪，调节色谱系统，使前列地尔峰的保存时间约为1113分钟，前列腺素A1峰与前列腺素B1峰的别离度应符合要求；同时调节检测灵敏度

9、，使前列腺素B1峰的高度约为满量程的10%。测定法 精细称取本品适量，用乙腈-水9：1溶解并定量稀释制成每1ml中约含1mg的溶液作为供试品溶液；精细量取含量测定项下的对照品溶液适量，用乙腈-水9：1稀释制成每1ml中约含10g的溶液，作为前列地尔对照品溶液；另精细称取前列腺素A1和前列腺素B1杂质对照品各适量，用乙腈-水9：1分别溶解并定量稀释制成每1ml中约含15g和5g的溶液作为前列腺素A1和前列腺素B1的杂质对照品溶液。精细量取供试品溶液、前列腺素A1、前列腺素B1杂质对照品溶液和前列地尔对照品溶液各25l,分别注入液相色谱仪，记录供试品溶液的色谱图至主成分峰保存时间的4倍。前列腺素A

10、1和前列腺素B1均按外标法计算，分别不得过1.5%和0.5%；其他杂质按主成分自身对照法计算，单个最大杂质的峰面积不得过前列地尔对照品溶液的主峰面积1.0%；杂质总量不得过2.0%小于0.01%的色谱峰不计。HPLC方法的建立与验证 溶剂的选择：溶液稳定性考察-溶解度高且稳定 8小时不需提示 4小时提示临用现配或立即进样 2小时改换溶剂 -无背景干扰或小 溶剂峰、倒峰 -低毒价廉 检测波长的选择检测波长的选择 主波长、低波长、杂质波长、权衡波长 检出杂质的数与量 干扰因素 操作的便捷性 检测波长的选择色谱柱的选择 反相色谱系统使用非极性填充剂 C18、C8；氰基柱、氨基柱 正相色谱系统使用极性

11、填充剂 硅胶柱 离 子 交 换填充剂；凝 胶 或 高分子多孔微球；手 性 键 合填充剂色谱柱的选择-常见问题 色谱柱与流动相性质不匹配 100%的水或Buffer最好选水相柱AQ柱 普通C18柱流动相中用到离子对试剂，用后应好好冲 最好专用！因色谱柱填料性质已与原来有所不同 在该柱上所摸索的色谱条件，可能在其它同类柱子上得不到重现！流动相的选择-别离能力强 各种有关物质根本别离-温和稳定 pH、比例适中对柱伤害小，性质稳定-配制简单、易得价廉 -无毒环保 头孢曲松钠的流动相原来0.8%四庚基溴化铵乙腈溶液-水-磷酸盐缓冲液-枸橼酸缓冲液500：440：55：5，由4种成分组成，需配制3种缓冲液

12、；后改为0.02mol/L正辛胺溶液-乙腈73：27，用磷酸调节pH值为6.5，仅由2种成分组成 流动相的选择别离能力的考察-粗产品溶液或配制各种杂质混合物 起始原料，中间体，副产物 -强制降解酸、碱、光、热、氧化二、HPLC方法的建立与验证 强制降解的考察方法误区：酸、碱、光、热、氧化 -破坏条件过于强烈 控制在主成分降低10%20%为宜 -中和方法 -目的不明确，结论不正确分离能力的考察二、HPLC方法的建立与验证-不规定柱温 不需加温且对温度不敏感 -25或30 不需加温但对温度敏感，需保持恒温 -35 70 需加温且对温度敏感，需保持恒温 作为耐用性试验之一 且可与溶液稳定性同时进展柱

13、温的确定溶液的配制 需要注意的几点：-需否避光？-可否超声、加热、多久？过滤？滤材？-浓度与线性范围和检测限是否匹配？弃20ml初滤液？用xx膜过滤？用聚四氟酰胺小瓶？机械振摇xx分钟等等？二、HPLC方法的建立与验证-常用10l100l-过低误差大，影响重现性-太多过载，影响峰形与别离 -配合溶液浓度保证检测灵敏度进样体积的确定色谱系统的适用性试验-指标的应用-别离度的保证-灵敏度的测试 -精细度的要求Company Logo系统适用性试验要求重复性理论板数分离度保留时间拖尾因子常用指标别离度指标性物质的选择-难别离物质对-最常出现的杂质-单独规定限度的特定杂质 -构造性质相近且 不干扰测定

14、的物质二、HPLC方法的建立与验证-准确定量分析时通常两峰间R1.5-峰顶峰谷比分离度的要求拖尾因子T的要求与应用 为保证别离效果和测量精度用于评价色谱峰对称性 的指标 T=W0.05h/2d1 式中W0.05h 为5峰高处的峰宽；d1 为5峰高出峰顶点至峰前沿 之间的距离 除另有规定外，峰高法定量时 T 应在0.951.05 之间。峰面积法测定时，假设拖尾严重，将 影响峰面积的准确测量。峰前峰后有 紧邻杂质峰时，对拖尾因子作出规定。重复性RSD的要求 用于评价连续进样后，色谱系统响应值的重复性能。采用外标法时，通常取各品种项下的对照品溶液，连续进样5 次，除另有规定外，其峰面积测量值的相对标

15、准偏差应不大于2.0%；采用内标法时，通常配制相当于80%、100%和120%的对照品溶液，参加规定量的内标溶液，配成3 种不同浓度的溶液，分别至少进样2 次，计算平均校正因子。其相对标准偏差应不大于2.0%在质量标准中如果没有明确规定，就是2.0%Company Logo特定杂质峰定位的方法 杂质对照品混合对照品临时降解相对保留时间+参考图峰定位方法的验证 验证 定量 限度-准确度 +-精细度 +-重复性 +-中间精细度 +-专属性 +-检测限 +-定量限 +-线性范围 +-耐用性 +Company Logo 杂质含量的计算对照品外标法主成分自身对照法加校正因子的自身对照法面积归一化法对照品

16、外标法优点缺点50%定位方便定量准确要求严费用高70%有条件时首选的方法主成分自身对照法优点缺点50%不需定位费用低定量粗70%没条件时首选的方法加校正因子的主成分自身对照法优点缺点50%定位方便定量较准确需测定因子定位难70%杂质与主成分响应因子差异大（超过0.91.1）且对照品昂贵时选用的方法面积归一化法优点缺点50%不需定位费用低定量粗70%不提倡使用的方法影响多 重复性差Company Logo特定杂质 非特定杂质有效杂质宽管毒性杂质严控杂质限度的规定单个不得过0.10%根据生产现状杂质限度的规定 毒性杂质严控：-遵守公认标准 -不超越前期标准 -以相关平安实验数据为科学依据 -以保证

17、临床平安为根本目的杂质限度的规定 有效杂质宽管：-不能不管三磷酸腺苷二钠、头孢拉定 -不超越前期标准 -以投入产出比等利弊平衡为科学依据杂质限度的规定 非特定杂质：-不超越前期标准-一般不得过0.10%2021年版 -以平安实验和投入产出比等利弊平衡为科 学依据辅料影响的排除-有关物质检查 前沿色谱峰，易排除 少峰，可定位，能排除 多峰，难定位，不能排除 辅料对测定的干扰辅料对测定的干扰1、防止使用 辅料或方法 2、不排除可以默认或校正3、排除辅料干扰方法要明确、易重现、具 可操作性、配混合液4、保证特定杂质最具代表性降解产物 检出效果-不得已的最后一招 比较研究的标尺问题 -购置的对照品/标

18、准品 权威性 真实性 准确性-发票、标签、批号、分析报告单、盐基/碱基、水分详细精制方法、质量检验报告标定方法与结果 详细提取精制方法、质量检验 报告、标定方法与结果详细合成精制方法、质量检验报告、标定方法与结果 纯化精制提取精制 合成精制比较研究的标尺问题 -非购买的对照品/标准品建立标准时要考虑的问题200820072006 200520042003 200220012000 数据标定：用正确的方法由至少3位实验者，不同仪器进行不少于10个数据的测定 待标品质量考察：证明不仅是对的而且还是好的 对数据进行数理统计处理比较研究的标尺问题 -对照品/标准品的标定标定者 测定结果%n 均值%RS

19、D%1.98.82%，99.12%，99.18%，99.25%，99.17%5 99.11%0.17%2.98.96%，99.04%，99.24%，98.98%，98.98%5 99.04%0.12%3.99.12%，98.94%，99.04%，99.04%，99.18%5 99.06%0.09%经Corchan检验，三位标定者的方差没有差异，均来自同一正态分布。用Dixon法检验15组数据中的最大值99.25%，最小值98.82%均非离群值。T1-0.05S置信区间 =X =99.080.068 n1/2标定结果的置信区间为99.1599.01%，因此，本批对照品的色谱纯度总均值为99.08

20、%。比照研究比照检验研究工程 原执行标准考察方法 原法定标准比较研究的范围与方法 -考察项目与方法的选择原则 物料不同原料、辅料分析对象 工艺不同路线、中间体 设备不同质材、参数精度 不全面没的学复方无有关物质已有标准不完善不应学地标升国标标准 不适用不能学厂送设备 为什么呢？产品生产个性应关注 标准隐性变化 同类最新动态 如何在已有标准基础上变化拓展项目项目原研厂标准原研厂标准拟定标准拟定标准EP7.0EP7.0USP34USP34JP15JP15含量限度按干燥品计算，每1mg的效价不得少于150单位按干燥品计算，每1mg的效价不得少于150单位按干燥品计算，每1mg效价不得少于150I.U

21、.（非口服制剂），每1mg效价不得少于120I.U.（口服制剂按干燥品计算，每1mg中效价不得少于180USP 肝素单位每1mg的效价不得少于110单位。性状白色或类白色的粉末，有引湿性白色或类白色的粉末，极具引湿性白色或几乎白色的粉末，有适度的引湿性白色到灰棕色的粉末或颗粒溶解度在水中易溶在水中易溶，在乙醚中不溶在水中易溶在水中溶解，在乙醚中不溶比旋度不小于+35(40mg/ml,水)应不小于+50(40mg/ml,水)鉴别1、电泳法2、钠盐1、电泳法2、钠盐A、具有抗凝血作用B、比旋度C、电泳法：D.钠盐A、H-NMRB、IC法C、抗Xa/抗IIa：D、钠盐酸碱度5.07.5（0.10g到

22、10ml水）5.07.5（0.10g到10ml水）5.58.0（0.10g到10ml水）5.07.5（0.10g到10ml水）6.08.0杂质研究技术 柱串联技术 适用于溶解度无明显差异但电荷上有明显差异的难别离物质，通过将一根SCX阳离子交换短柱与一根MG C18长柱串联就可以简单到达将其别离的目的。原理：有电荷差异的被别离物质进入色谱柱串联系统后，带正电荷的物质通常是碱性物质会由于SCX短柱的离子交换作用而被保存在短柱中，而带负电荷的物质通常为酸性物质与中性物质那么会毫无阻碍的通过短柱进入C18长柱中，从而成功别离；然后由于MGC18长柱中疏水性基团间的相互作用而对中性物质有强保存作用，但

23、对带负电荷物质无强保存作用，这样带负电荷物质与中性物质也简单被分开了 如果为了让峰形更好，各峰间别离更开，还可在阳离子交换短柱与C18长柱前接一根NH2短柱它可与阴离子发生交换作用，进展三根串联，也可以使带负电荷的酸性物质与中性物质到达更好的别离效果。毒性快速评价平台 斑马鱼毒性快速评价平台，对杂质的胚胎毒性、神经毒性，心脏毒性等进展评价。优点：杂质用量少 无需知道杂质构造 实验周期短 34天一个周期药物耳毒性检测利用一种特殊染料对斑马鱼幼体头部耳蜗区神经丘毛细胞的染色，检测毛细胞的存活状态，来判断检测物的耳毒性。下图中红色圈示耳蜗区域；给药组中红色箭头示给药后毛细胞减少，黄色圈示给药后1神经

24、丘消失。给药后系统对照组（正常幼体）药典采用现代分析技术举例 由于某些药物组成的复杂性，特别是一些生物大分子药物，使用传统的分析方法已经不能满足当前的质控需要，2021年版药典逐渐改用现代分析技术。首次运用毛细管电泳法 注射用抑肽酶：检查两个特定杂质 注射用盐酸头孢吡肟：方法1-毛细管电泳法 N-甲基吡咯烷 方法2-HPLC法羧基柱，电导检测毛细管电泳法检查特定杂质抑肽酶由上海药检所起草，参考USP增订去丙氨酸-去甘氨酸-抑肽酶和去丙氨酸抑肽酶检查项色谱条件：石英毛细管分离柱，毛细管温度：30，电极液：磷酸二氢钾溶液；分离压：12KV；波长：214nm结果：去丙氨酸抑肽酶RT为0.99，去丙氨

25、酸-去甘氨酸-抑肽酶RT为0.98，两相关物间分离度1.40，去丙氨酸-抑肽酶与抑肽酶间分离度1.24、抑肽酶拖尾因子1.8Minutes1516171819202122232425AU-0.006-0.004-0.0020.0000.0020.0040.0060.00818.35418.55418.792抑肽酶SDS-PAGE凝胶电泳图 本品系自牛胰或肺中提取、纯化制得的肽酶抑制剂。采用SDS-PAGE凝胶电泳的方法抑肽酶的有关物质，结果如下图，都只有一个条带。可能是抑肽酶和有关物质的分子量相差不大，使用凝胶电泳不能将其别离药典采用现代分析技术举例 首次运用肽图分析技术：根据蛋白质、多肽的分

26、子量大小以及氨基酸组成特点，使用专一性较强的蛋白水解酶，一般为肽链内切酶，作用于特殊的肽链位点将多肽裂解成小片断，再通过一定的别离检测手段形成特征性指纹图谱，用此法进展鉴别，专属性强，可鉴别仅相差一个氨基酸残基的不同种属来源的样品。如胰岛素-采用V8酶解+HPLC法；重组人生长激素-采用胰蛋白酶酶解+HPLC法获得肽图进展鉴别等。胰岛素肽图人胰岛素酶解-HPLC肽图猪胰岛素酶解-HPLC肽图如何借鉴进口药注册标准读懂取长补短更上一层楼学到位+先进性完成时应该是当时最为严格的同品种标准专属性仅属于某个企业专有个性化某些项目的适用性及推广性较差保密性非公开的，仅在CDE，中检所和口岸所等部门存档进口药注册标准的特点Thank You!