第十四章：大肠杆菌基因工程资料课件.ppt

1、第十四章第十四章 大肠杆菌基因工程大肠杆菌基因工程第一节、大肠杆菌作为受体菌的特征第一节、大肠杆菌作为受体菌的特征1.1.全基因组测序，遗传背景清楚全基因组测序，遗传背景清楚 ，共有共有44054405个开放阅读框架。个开放阅读框架。2.2.基因克隆表达系统成熟完善。基因克隆表达系统成熟完善。一一大肠杆菌表达外源基因的优势大肠杆菌表达外源基因的优势3.3.繁殖迅速，培养简单，操作方便，繁殖迅速，培养简单，操作方便，遗传稳定。遗传稳定。4.4.被美国被美国FDAFDA批准为安全的基因工程批准为安全的基因工程受体生物。受体生物。5.5.成本低成本低1.缺乏对真核生物蛋白质的加工系统。缺乏对真核生物

2、蛋白质的加工系统。2.内源性蛋白酶易降解空间构象不正内源性蛋白酶易降解空间构象不正确的异源蛋白。确的异源蛋白。3.不具备真核生物的蛋白质复性系统。不具备真核生物的蛋白质复性系统。4.其细胞膜间隙含有大量的内毒素，其细胞膜间隙含有大量的内毒素，可能混在产物里。可能混在产物里。二二大肠杆菌表达外源基因的劣势大肠杆菌表达外源基因的劣势第二节、外源基因在大肠杆菌中高效表达原理第二节、外源基因在大肠杆菌中高效表达原理一一启动子启动子二二终止子终止子三三核糖体结合位点核糖体结合位点四四密码子密码子五五质粒拷贝数质粒拷贝数一一启动子启动子1.大肠杆菌启动子的强弱取决于大肠杆菌启动子的强弱取决于启动子本身的序

3、列，尤其是启动子本身的序列，尤其是-10-10区区和和-35-35区的碱基组成及彼此间的距区的碱基组成及彼此间的距离离启动子与外源基因转录起始位点启动子与外源基因转录起始位点之间的距离之间的距离2.启动子最佳作用距离的探测启动子最佳作用距离的探测其中目的基因表达量最高的克隆即具有最其中目的基因表达量最高的克隆即具有最佳的启动子作用距离。佳的启动子作用距离。若克隆菌细胞内检测不到相应的若克隆菌细胞内检测不到相应的mRNAmRNA，有，有必要考虑调整启动子与基因最佳的距离。必要考虑调整启动子与基因最佳的距离。3.启动子的筛选启动子的筛选采用鸟枪法战略，将合适大小的采用鸟枪法战略，将合适大小的DNA

4、DNA片段克隆到启动子探针质粒片段克隆到启动子探针质粒pKO1pKO1上，上，受体细胞染色体受体细胞染色体DNADNA上的上的galEgalE、galTgalT与质粒报告基因与质粒报告基因galKgalK的表达产物联合的表达产物联合作用，能将培养基中的半乳糖糖酵解作用，能将培养基中的半乳糖糖酵解成红色素物质。成红色素物质。鸟枪法克隆鸟枪法克隆转化galE+、galT+的大肠杆菌受体菌株含有外源启动子活性含有外源启动子活性的重组克隆的重组克隆依据依据RNARNA聚合酶与启动子区域的特异性结合原理设聚合酶与启动子区域的特异性结合原理设计的。将大肠杆菌基因组文库中的重组质粒与计的。将大肠杆菌基因组文

5、库中的重组质粒与RNARNA聚合酶在体外保温片刻，然后选择合适的限制性聚合酶在体外保温片刻，然后选择合适的限制性内切酶对其进行消化，未与内切酶对其进行消化，未与RNARNA聚合酶保温的同一聚合酶保温的同一重组质粒作酶切对照。如果试验质粒的限制性片重组质粒作酶切对照。如果试验质粒的限制性片段比对照质粒减少，则表明被钝化的酶切位点位段比对照质粒减少，则表明被钝化的酶切位点位于于RNARNA聚合酶保护区域内，即该区域存在启动子结聚合酶保护区域内，即该区域存在启动子结构。将这个区域的构。将这个区域的DNADNA片段次级克隆在启动子探针片段次级克隆在启动子探针质粒上，测定其所含有启动子的转录活性。质粒上

6、，测定其所含有启动子的转录活性。酶保护法分离酶保护法分离原理是双链原理是双链DNADNA不能与硝酸纤维素薄膜有效结合，而不能与硝酸纤维素薄膜有效结合，而DNA-DNA-蛋白质复合物却能在一定条件下结合在膜上。将待检测蛋白质复合物却能在一定条件下结合在膜上。将待检测DNADNA片段与片段与RNARNA聚合酶保温，并转移保温混合物至膜上，温聚合酶保温，并转移保温混合物至膜上，温和漂洗薄膜，除去未结合和漂洗薄膜，除去未结合RNARNA聚合酶的双链聚合酶的双链DNADNA片段，然后片段，然后再用高盐溶液将结合在薄膜上的再用高盐溶液将结合在薄膜上的DNADNA片段洗下。一般来说，片段洗下。一般来说，这种

7、这种DNADNA片段在膜上的滞留程度与其同片段在膜上的滞留程度与其同RNARNA聚合酶的亲和性聚合酶的亲和性（即启动子的强弱）成比例，然而这种强弱难以量化，通（即启动子的强弱）成比例，然而这种强弱难以量化，通常仍需要将之克隆在探针质粒上进行检测。常仍需要将之克隆在探针质粒上进行检测。滤膜结合法分离滤膜结合法分离4.常用的大肠杆菌的启动子常用的大肠杆菌的启动子P Placlac 来源于乳糖操纵子来源于乳糖操纵子P Ptrptrp 来源于色氨酸操纵子来源于色氨酸操纵子P PL L 来源于来源于噬菌体早期操纵子噬菌体早期操纵子P PrecArecA 来源于来源于recArecA基因基因5.5.启动子

8、的构建启动子的构建为了获得更强的启动子，除了从基因为了获得更强的启动子，除了从基因组组DNADNA上进行筛选甄别外，还可利用已上进行筛选甄别外，还可利用已知的启动子重新构建新的杂合启动子，知的启动子重新构建新的杂合启动子，以满足不同外源基因的表达要求。以满足不同外源基因的表达要求。为了获得更强的启动子，除了从基因组DNA上进行筛选甄别外，还可利用已知的启动子重新构建新的杂合启动子，以满足不同外源基因的表达要求。由Ptrp-35区序列和Plac-10区序列重组而成的杂合启动子Ptac，其相对强弱分别是Ptrp的三倍和Plac的11倍。6.启动子的可控性启动子的可控性乳糖启动子乳糖启动子P Pla

9、clac的可控性的可控性野生型的野生型的P Placlac与其控制区与其控制区O Olaclac偶联在偶联在一起，在没有诱导物存在时，整个一起，在没有诱导物存在时，整个操纵子处于基底水平表达；诱导物操纵子处于基底水平表达；诱导物可以使启动子可以使启动子P Placlac介导的转录大幅介导的转录大幅增加。增加。野生型的野生型的P Placlac上游附近具有代谢激活因子上游附近具有代谢激活因子（CAPCAP）结合区，）结合区，cAMPcAMP激活激活CAPCAP，CAPCAP结合结合启动子控制区，促进启动子控制区，促进PlacPlac介导的转录。葡介导的转录。葡萄糖代谢使萄糖代谢使cAMPcAMP

10、减少。因此基因工程上使减少。因此基因工程上使用的乳糖启动子抗葡萄糖代谢阻遏的突变用的乳糖启动子抗葡萄糖代谢阻遏的突变型，即型，即P PlaclacUV5UV5而在大规模培养重组大肠杆菌时，培养基中必须加而在大规模培养重组大肠杆菌时，培养基中必须加入葡萄糖，因此在实际操作中通常使用的是野生型入葡萄糖，因此在实际操作中通常使用的是野生型PlacPlac启动子的突变体启动子的突变体PlacUV5PlacUV5启动子。它含有一个启动子。它含有一个突变碱基对，其活性比野生型突变碱基对，其活性比野生型PlacPlac启动子更强，而启动子更强，而且对葡萄糖及分解代谢产物的阻遏作用不敏感，但且对葡萄糖及分解代

11、谢产物的阻遏作用不敏感，但仍为受体细胞中的仍为受体细胞中的LacLac阻遏蛋白阻遏，因此可以用阻遏蛋白阻遏，因此可以用乳糖或乳糖或IPTGIPTG进行有效诱导。人工构建的进行有效诱导。人工构建的PtacPtac启动子启动子由于含有由于含有laclac操作子区域，所以其阻遏诱导性质与操作子区域，所以其阻遏诱导性质与PlacUV5PlacUV5相同。相同。色氨酸启动子色氨酸启动子P Ptrptrp的可控性的可控性P Ptrptrp受色氨酸受色氨酸-阻遏蛋白复合物的阻遏，阻遏蛋白复合物的阻遏，转录呈基底状态，在培养系统中去除色转录呈基底状态，在培养系统中去除色氨酸或加入氨酸或加入3-3-吲哚丙烯酸（

12、吲哚丙烯酸（IAAIAA）可有）可有效解除阻遏。正常培养体系中去除色氨效解除阻遏。正常培养体系中去除色氨酸很难，基因工程通过添加酸很难，基因工程通过添加IAAIAA诱导诱导P Ptrptrp介导的目的基因的表达。介导的目的基因的表达。噬菌体启动子噬菌体启动子P PL L的可控性的可控性P PL L受阻遏蛋白阻遏，很难直接诱导，基因受阻遏蛋白阻遏，很难直接诱导，基因工程中常使用温度敏感型的工程中常使用温度敏感型的cIcI突变基因突变基因cIcI857857控制控制P PL L，cIcI857857阻遏蛋白在阻遏蛋白在4242时失时失活脱落，活脱落，P PL L便可介导目的基因的表达，但便可介导目

13、的基因的表达，但在大型细菌培养罐中迅速升温很难，故常在大型细菌培养罐中迅速升温很难，故常使用双质粒的控制系统，用色氨酸间接控使用双质粒的控制系统，用色氨酸间接控制目的基因表达。制目的基因表达。当培养基中缺少色氨酸时，当培养基中缺少色氨酸时，PtrpPtrp启动子打开，启动子打开，CICI阻遏蛋白合成，由阻遏蛋白合成，由PlPl启动子介导的外源基因转录启动子介导的外源基因转录关闭；相反，当色氨酸大量存在时，关闭；相反，当色氨酸大量存在时，PtrpPtrp启动子启动子关闭，关闭，CICI阻遏蛋白不再合成，阻遏蛋白不再合成，PlPl启动子开放并激启动子开放并激活外源基因表达。从整体上来看，外源基因虽

14、然活外源基因表达。从整体上来看，外源基因虽然处于处于PlPl启动子控制之下，但却可用色氨酸取代温启动子控制之下，但却可用色氨酸取代温度进行诱导表达。度进行诱导表达。二二终止子终止子外源基因在强启动子的控制下表达，外源基因在强启动子的控制下表达，易发生转录过头现象，即易发生转录过头现象，即RNARNA聚合酶聚合酶滑过终止子结构继续转录质粒上邻滑过终止子结构继续转录质粒上邻近的近的DNADNA序列，形成长短不一的序列，形成长短不一的mRNAmRNA混合物。混合物。1.过长转录物的产生在很大程度上会过长转录物的产生在很大程度上会影响外源基因的表达，原因如下：影响外源基因的表达，原因如下：转录产物越长

15、，转录产物越长，RNARNA聚合酶转录一聚合酶转录一分子分子mRNAmRNA所需时间相应增加，外源所需时间相应增加，外源基因本身的转录效率下降；基因本身的转录效率下降；如外源基因下游紧接有载体上其它如外源基因下游紧接有载体上其它重要基因或重要基因或DNADNA功能区域，则功能区域，则RNARNA聚聚合酶在此处的转录可能干扰质粒的合酶在此处的转录可能干扰质粒的复制及其它生物功能，甚至导致重复制及其它生物功能，甚至导致重组质粒的不稳定性；组质粒的不稳定性；过长的过长的mRNAmRNA往往产生大量无用往往产生大量无用的蛋白质，增加工程菌的能量的蛋白质，增加工程菌的能量消耗。消耗。过长的转录物往往不能

16、形成理想过长的转录物往往不能形成理想的二级结构，大大降低外源基因的二级结构，大大降低外源基因编码产物的翻译效率。编码产物的翻译效率。2.2.强终止子的选择与使用强终止子的选择与使用目前常用的终止子来自于大肠杆菌目前常用的终止子来自于大肠杆菌rRNArRNA操纵子上的操纵子上的rrnTrrnT1 1T T2 2以及以及T7T7噬菌体噬菌体DNADNA上的上的T T，对于一些终止作用较弱的，对于一些终止作用较弱的终止子，通常采用二聚体终止子串联终止子，通常采用二聚体终止子串联的特殊结构，以增强其转录终止作用。的特殊结构，以增强其转录终止作用。终止子也可像启动子一样，通过特殊终止子也可像启动子一样，

17、通过特殊的探针质粒从细菌或噬菌体基因组的探针质粒从细菌或噬菌体基因组DNADNA中克隆筛选。中克隆筛选。3.3.终止子探针质粒终止子探针质粒pCP1pCP1可在可在AprApr的转化子中筛选对四环素敏感的重组克隆。的转化子中筛选对四环素敏感的重组克隆。三三核糖体结合位点核糖体结合位点1.外源基因在大肠杆菌中的高效表达外源基因在大肠杆菌中的高效表达取决于：取决于：转录启动频率转录启动频率mRNAmRNA的翻译起始效率：由其的翻译起始效率：由其55端端核糖体结合位点（核糖体结合位点（RBSRBS）的序列决）的序列决定定 2.2.RBSRBS序列的特征结构要素：序列的特征结构要素：位于翻译起始密码子

18、上游的位于翻译起始密码子上游的68个个核苷酸序列核苷酸序列5UAAGGAGG3（SD序列）序列）-16S rRNA翻译起始密码子翻译起始密码子SD序列与翻译起始密码子之间的距序列与翻译起始密码子之间的距离及碱基组成离及碱基组成基因编码区基因编码区5端若干密码子的碱基端若干密码子的碱基序列序列3.3.SDSD序列的影响：序列的影响：取决于取决于SDSD序列与序列与16S 16S rRNArRNA的碱基互补性，的碱基互补性，其中其中GGAGGGAG四个碱基四个碱基序列尤为重要，其序列尤为重要，其中任一换成中任一换成C C或或T T均均会导致翻译效率大会导致翻译效率大幅度降低。幅度降低。mRNASm

19、all ribosomal subunit4.4.SDSD序列与起始密码子之间的序列的影响：序列与起始密码子之间的序列的影响：SDSD序列下游若是序列下游若是AAAAAAAA或或UUUUUUUU翻译翻译效率最高。效率最高。CCCCCCCC或或GGGGGGGG的翻译效率分别是最的翻译效率分别是最高值的高值的50%50%和和25%25%。紧邻紧邻AUGAUG的前三个碱基成分对翻译的前三个碱基成分对翻译效率也很重要。如大肠杆菌效率也很重要。如大肠杆菌-半半乳糖苷酶的乳糖苷酶的mRNAmRNA：最佳碱基为：最佳碱基为UAUUAU或或CUUCUU，若用，若用UUCUUC、UCAUCA或或AGGAGG取代

20、，取代，则酶的表达水平降为则酶的表达水平降为1/201/20。5.5.SDSD序列与起始密码子之间距离的影响：序列与起始密码子之间距离的影响：精确距离保证了精确距离保证了mRNAmRNA在核糖体定位在核糖体定位后，翻译起始密码子正好处于核糖后，翻译起始密码子正好处于核糖体复合物结构中的体复合物结构中的P P位。多数情况下，位。多数情况下，它们之间为它们之间为7 7个碱基。个碱基。6.起始密码子及其后续密码子的影响：起始密码子及其后续密码子的影响：三个起始密码子：三个起始密码子：AUGAUG、GUGGUG、UUGUUG 识别频率：识别频率：GUG=50%AUGGUG=50%AUG UUG=25%

21、AUG UUG=25%AUG从起始密码子开始的前几个密码子从起始密码子开始的前几个密码子碱基要保证不与碱基要保证不与mRNAmRNA的的55端非编码端非编码区形成颈环结构，从而严重干扰区形成颈环结构，从而严重干扰mRNAmRNA在核糖体的准确定位。在核糖体的准确定位。四四密码子密码子1.1.生物体对密码子的偏爱性：不同生生物体对密码子的偏爱性：不同生物甚至是同种生物不同的蛋白编码物甚至是同种生物不同的蛋白编码基因，对于同一氨基酸所对应的简基因，对于同一氨基酸所对应的简并密码子，使用频率不同，即生物并密码子，使用频率不同，即生物体基因对简并密码子的选择具有一体基因对简并密码子的选择具有一定的偏爱

22、性。定的偏爱性。密码子的简并特性决定了来自不同生物因而密码子的简并特性决定了来自不同生物因而碱基组成也不同的基因组中，简并密码子出碱基组成也不同的基因组中，简并密码子出现的非随机性。在富含现的非随机性。在富含ATAT的生物（如单链的生物（如单链DNADNA噬菌体噬菌体X174X174）基因组中，密码子第三位上）基因组中，密码子第三位上的的U U和和A A出现的频率较高，而在出现的频率较高，而在GCGC丰富的生物丰富的生物（如链霉菌）基因组中，第三位上含有（如链霉菌）基因组中，第三位上含有G G或或C C的简并密码子占的简并密码子占90%90%以上的绝对优势。以上的绝对优势。2.密码子与反密码子

23、相互作用的自由能密码子与反密码子相互作用的自由能在碱基含量没有显著差异的生物基因组中，在碱基含量没有显著差异的生物基因组中，简单密码子的使用频率可能是由密码子与简单密码子的使用频率可能是由密码子与反密码子的作用强度所决定的。适中的作反密码子的作用强度所决定的。适中的作用强度最有利于蛋白质生物合成的迅速进用强度最有利于蛋白质生物合成的迅速进行；弱配对作用可能使氨酰基行；弱配对作用可能使氨酰基tRNAtRNA分子进分子进入核糖体入核糖体A A位需要总费更多的时间；而强位需要总费更多的时间；而强配对作用则可能使转肽后核糖体在配对作用则可能使转肽后核糖体在P P位逐位逐出空载出空载tRNAtRNA分子

24、耗费更多的时间。分子耗费更多的时间。tRNAtRNA上反密码子的第一位碱基如果是修饰的上反密码子的第一位碱基如果是修饰的U U，则它与，则它与A A配对的机会多于配对的机会多于C C；如果是；如果是I I，则，则与与U U和和C C配对的频率高于配对的频率高于A A。反密码子第反密码子第1位碱基位碱基 密码子第密码子第3位碱基位碱基 A U C G G U，C U A，C I U，C，3.3.细胞内细胞内tRNAtRNA的含量的含量简并密码子的使用频率与相应简并密码子的使用频率与相应tRNAtRNA的丰度呈正的丰度呈正相关，通常，表达量较大的基因含有较少种类相关，通常，表达量较大的基因含有较少

25、种类的密码子，而且这些密码子又对应于含量高的的密码子，而且这些密码子又对应于含量高的tRNAtRNA分子，这样细胞便能以更快的速度合成需分子，这样细胞便能以更快的速度合成需求量大的蛋白质；而对于需求量少的蛋白质而求量大的蛋白质；而对于需求量少的蛋白质而言，其基因中含有较多与低丰度言，其基因中含有较多与低丰度tRNAtRNA相对应的相对应的密码子，用以控制该蛋白质的合成速度。密码子，用以控制该蛋白质的合成速度。4.密码子偏爱性对外源基因表达的影响密码子偏爱性对外源基因表达的影响原核生物和真核生物基因组中密码原核生物和真核生物基因组中密码子的使用频率有较大差异，两种策子的使用频率有较大差异，两种策

26、略可以使外源基因的密码子在大肠略可以使外源基因的密码子在大肠杆菌细胞中获得最佳表达：杆菌细胞中获得最佳表达：外源基因全基因合成外源基因全基因合成同步表达相关同步表达相关tRNAtRNA编码基因编码基因五五质粒拷贝数质粒拷贝数目前广泛使用的表达型载体在每个大目前广泛使用的表达型载体在每个大肠杆菌细胞中可达到数百甚至数千个肠杆菌细胞中可达到数百甚至数千个拷贝，质粒分子的过多增殖会影响受拷贝，质粒分子的过多增殖会影响受体细胞的生长与代谢，进而导致质粒体细胞的生长与代谢，进而导致质粒的不稳定性以及外源基因宏观表达水的不稳定性以及外源基因宏观表达水平的下降。平的下降。解决此难题的有效策略是解决此难题的有

27、效策略是将重组质将重组质粒的扩增纳入可控制轨道粒的扩增纳入可控制轨道，即在细，即在细菌生长周期的最适阶段将重组质粒菌生长周期的最适阶段将重组质粒扩增到一个最佳程度。扩增到一个最佳程度。质粒扩增时序的控制质粒扩增时序的控制pCP3拥有一个温度可诱导型的复制子，拥有一个温度可诱导型的复制子，28时，每个细胞的质粒拷贝数为时，每个细胞的质粒拷贝数为60，42时拷贝数迅速增至时拷贝数迅速增至300600，同时受，同时受体细胞染色体上的体细胞染色体上的CI基因表达的温度敏感基因表达的温度敏感型阻遏蛋白失活。因此，用一种手段同时型阻遏蛋白失活。因此，用一种手段同时控制质粒拷贝数和基因的表达。控制质粒拷贝数

28、和基因的表达。第三节、大肠杆菌工程菌的构建策略1.1.大肠杆菌缺乏针对异源重组蛋白大肠杆菌缺乏针对异源重组蛋白的拆叠复性和翻译后加工系统的拆叠复性和翻译后加工系统;一一导致异源重组蛋白在大肠杆菌细胞导致异源重组蛋白在大肠杆菌细胞中不稳定性的主要原因是：中不稳定性的主要原因是：2.2.大肠杆菌不具备真核生物细胞完大肠杆菌不具备真核生物细胞完善的亚细胞结构以及众多基因表善的亚细胞结构以及众多基因表达产物的稳定因子达产物的稳定因子;3.3.高效表达的异源重组蛋白在大肠高效表达的异源重组蛋白在大肠杆菌细胞中形成高浓度微环境，杆菌细胞中形成高浓度微环境，致使蛋白分子间的相互作用增强。致使蛋白分子间的相互

29、作用增强。二二包涵体型异源蛋白的表达包涵体型异源蛋白的表达1.1.包涵体（包涵体（Inclusion BodiesInclusion Bodies）及其性质：）及其性质：在某些生长条件下，大肠杆菌能积在某些生长条件下，大肠杆菌能积累某种特殊的生物大分子，它们致累某种特殊的生物大分子，它们致密地集聚在细胞内，或被膜包裹或密地集聚在细胞内，或被膜包裹或形成无膜裸露结构，这种结构称为形成无膜裸露结构，这种结构称为包涵体。包涵体。2.以包涵体形式表达蛋白的优点：以包涵体形式表达蛋白的优点：能简化外源基因表达产物的分离纯化能简化外源基因表达产物的分离纯化程序：包涵体的水难溶性及其密度远程序：包涵体的水难

30、溶性及其密度远大于其它细胞碎片结合蛋白，直接通大于其它细胞碎片结合蛋白，直接通过高速离心即可将重组异源蛋白从细过高速离心即可将重组异源蛋白从细胞裂解物中分离出来。胞裂解物中分离出来。能在一定程度上保持表达产物的结构能在一定程度上保持表达产物的结构稳定：形成包涵体后，大肠杆菌的蛋稳定：形成包涵体后，大肠杆菌的蛋白酶降解作用基本上对异源重组蛋白白酶降解作用基本上对异源重组蛋白的稳定性已不构成威胁。的稳定性已不构成威胁。3.以包涵体形式表达蛋白的缺点：以包涵体形式表达蛋白的缺点：以包涵体形式表达的重组蛋白丧失以包涵体形式表达的重组蛋白丧失了原有的生物活性，必须通过有效了原有的生物活性，必须通过有效的

31、变性复性操作，才能回收得到具的变性复性操作，才能回收得到具有正确空间结构的目的蛋白。有正确空间结构的目的蛋白。4.以包涵体形式表达目的蛋白的操作：以包涵体形式表达目的蛋白的操作：如未进行特殊设计（如分泌型表达或融合型如未进行特殊设计（如分泌型表达或融合型表达），外源基因在大肠杆菌中的蛋白量占表达），外源基因在大肠杆菌中的蛋白量占细胞总蛋白量的细胞总蛋白量的20%20%以上时，表达产物一般以上时，表达产物一般倾向于形成包涵体。因此，以包涵体形式表倾向于形成包涵体。因此，以包涵体形式表达目的基因操作的关键是选择高表达的载体，达目的基因操作的关键是选择高表达的载体，事实上，这种高表达效率也是包涵体的

32、长处事实上，这种高表达效率也是包涵体的长处所在。所在。5.包涵体变性复性操作：包涵体变性复性操作：在细菌细胞内，集聚状态和共价修饰在细菌细胞内，集聚状态和共价修饰的蛋白质不能进入复性过程，因此永的蛋白质不能进入复性过程，因此永远成为无活性的蛋白质，包涵体的蛋远成为无活性的蛋白质，包涵体的蛋白质属于这两种状态，需要在体外进白质属于这两种状态，需要在体外进行人工变性（解除共价修饰和驱散集行人工变性（解除共价修饰和驱散集聚体）复性操作。聚体）复性操作。N：天然状态：天然状态U：变性状态：变性状态C：共价修饰：共价修饰A：集聚状态：集聚状态I：有效变性复性过程：有效变性复性过程中的中间状态中的中间状态

33、X：脱离有效变性复：脱离有效变性复性过程而进入集聚的性过程而进入集聚的中间状态中间状态温度温度表达水平表达水平细菌遗传性状细菌遗传性状异源蛋白氨基酸序列异源蛋白氨基酸序列6.形成包涵体的影响因素形成包涵体的影响因素三三分泌型异源蛋白的表达分泌型异源蛋白的表达1.大肠杆菌中异源蛋白的定位大肠杆菌中异源蛋白的定位以可溶性或不溶性（包涵体）状态以可溶性或不溶性（包涵体）状态存在于细胞质中。存在于细胞质中。通过运输或分泌方式定位于细胞周通过运输或分泌方式定位于细胞周质，甚至穿过外膜进入培养基。蛋质，甚至穿过外膜进入培养基。蛋白产物白产物N N端的信号肽序列是蛋白质端的信号肽序列是蛋白质分泌的前体条件。

34、分泌的前体条件。2.以分泌形式表达蛋白的优点：以分泌形式表达蛋白的优点：目的蛋白稳定性高。如重组人胰岛目的蛋白稳定性高。如重组人胰岛素原若分泌到细胞周质中，其稳定素原若分泌到细胞周质中，其稳定性大约是细胞质中的性大约是细胞质中的1010倍。倍。蛋白易于分离蛋白易于分离外源重组蛋白外源重组蛋白N N端的甲硫氨酸残基端的甲硫氨酸残基可在信号肽的专一性剪切过程中被可在信号肽的专一性剪切过程中被有效除去。有效除去。3.分泌表达形式的缺点：分泌表达形式的缺点：相对其它生物细胞而言，大肠杆菌的蛋白分泌相对其它生物细胞而言，大肠杆菌的蛋白分泌机制并不健全。外源真核生物基因很难在大肠机制并不健全。外源真核生物

35、基因很难在大肠杆菌中进行分泌型表达，少数外源基因既便能杆菌中进行分泌型表达，少数外源基因既便能分泌表达，但其表达率通常要比包涵体方式低分泌表达，但其表达率通常要比包涵体方式低很多，因此目前用于产业化的异源蛋白分泌型很多，因此目前用于产业化的异源蛋白分泌型重组大肠杆菌尽管有，但并不普遍。重组大肠杆菌尽管有，但并不普遍。4.蛋白质的分泌机制：蛋白质的分泌机制：原核细菌周质中含有多种分子伴侣可原核细菌周质中含有多种分子伴侣可阻止分泌蛋白的随机折叠，分泌在周阻止分泌蛋白的随机折叠，分泌在周质和培养基中的蛋白很少形成分子间质和培养基中的蛋白很少形成分子间的二硫键交联，因此分泌型重组蛋白的二硫键交联，因此

36、分泌型重组蛋白具有较高比例的正确构象，生物活性具有较高比例的正确构象，生物活性的回收率增加，对蛋白酶不敏感。的回收率增加，对蛋白酶不敏感。分子伴侣的作用机制：分子伴侣的作用机制：识别新生肽段折叠过程中暴露的错误结构，识别新生肽段折叠过程中暴露的错误结构，并与之结合生成复合物，从而阻止不正确的并与之结合生成复合物，从而阻止不正确的非折叠途径，促进折叠向正确方向进行。在非折叠途径，促进折叠向正确方向进行。在正确折叠产物中，分子伴侣与之分离，不参正确折叠产物中，分子伴侣与之分离，不参与正确折叠产物的功能活动。与正确折叠产物的功能活动。5.分泌型目的蛋白表达系统的构建分泌型目的蛋白表达系统的构建包括大

37、肠杆菌在内的绝大多数革兰氏阴性菌包括大肠杆菌在内的绝大多数革兰氏阴性菌不能将蛋白质直接分泌到胞外，但有些革兰不能将蛋白质直接分泌到胞外，但有些革兰氏阴性菌能将细菌的抗菌蛋白（细菌素）分氏阴性菌能将细菌的抗菌蛋白（细菌素）分泌到培养基中，这一过程严格依赖于细菌素泌到培养基中，这一过程严格依赖于细菌素释放蛋白，它激活定位于内膜上的磷酸酯酶，释放蛋白，它激活定位于内膜上的磷酸酯酶，导致细菌内外膜的通透性增大。导致细菌内外膜的通透性增大。因此，只要将细菌素释放蛋白编码基因克隆在因此，只要将细菌素释放蛋白编码基因克隆在一个合适的质粒上即可构建完全分泌型的受体一个合适的质粒上即可构建完全分泌型的受体细胞。

38、此时，用另一种携带大肠杆菌信号肽编细胞。此时，用另一种携带大肠杆菌信号肽编码序列和目的基因的表达质粒转化上述完全分码序列和目的基因的表达质粒转化上述完全分泌型受体细胞，并使用相同性质的启动子介导泌型受体细胞，并使用相同性质的启动子介导目的基因的转录，则可实现目的蛋白从重组大目的基因的转录，则可实现目的蛋白从重组大肠杆菌中的完全分泌。肠杆菌中的完全分泌。三三融合型异源蛋白的表达融合型异源蛋白的表达除了直接表达异源蛋白外，还可将外源基因与受体除了直接表达异源蛋白外，还可将外源基因与受体菌自身的蛋白质编码基因拼接在一起，并作为一个菌自身的蛋白质编码基因拼接在一起，并作为一个开放型阅读框架进行表达。由

39、这种杂合基因表达出开放型阅读框架进行表达。由这种杂合基因表达出的蛋白质称为融合蛋白。在这种融合蛋白结构中，的蛋白质称为融合蛋白。在这种融合蛋白结构中，通常受体细菌的蛋白部分位于通常受体细菌的蛋白部分位于N N端，异源蛋白位于端，异源蛋白位于C C端。通过在端。通过在DNADNA水平上人工设计引入的蛋白酶切割水平上人工设计引入的蛋白酶切割位点或化学试剂特异性断裂位点，可以在体外从纯位点或化学试剂特异性断裂位点，可以在体外从纯化的融合蛋白分子中释放回收异源蛋白化的融合蛋白分子中释放回收异源蛋白1.以融合形式表达目的蛋白的优缺点以融合形式表达目的蛋白的优缺点目的蛋白稳定性高：尤其对分子量目的蛋白稳定

40、性高：尤其对分子量较小的多肽效果更佳。较小的多肽效果更佳。目的蛋白易于分离：利用受体蛋白目的蛋白易于分离：利用受体蛋白成熟的抗体、配体、底物进行亲和成熟的抗体、配体、底物进行亲和层析，可以快速获得纯度较高的融层析，可以快速获得纯度较高的融合蛋白。合蛋白。目的蛋白表达率高：与受体蛋白共目的蛋白表达率高：与受体蛋白共用一套完善的表达元件用一套完善的表达元件目的蛋白溶解性好：由于受体蛋白的存目的蛋白溶解性好：由于受体蛋白的存在，融合蛋白往往能在胞内形成良好的在，融合蛋白往往能在胞内形成良好的空间构象，且大多具有水溶性空间构象，且大多具有水溶性目的蛋白需要回收：融合蛋白需目的蛋白需要回收：融合蛋白需要

41、裂解和进一步分离，才能获目要裂解和进一步分离，才能获目的蛋白。在实际生产中，产品主的蛋白。在实际生产中，产品主要的成本往往就在该工段。要的成本往往就在该工段。2.融合型目的蛋白表达系统的构建融合型目的蛋白表达系统的构建融合蛋白表达质粒的构建原则：融合蛋白表达质粒的构建原则：A.受体细胞的结构基因能高效表达，受体细胞的结构基因能高效表达，且其表达产物可以通过亲和层析进且其表达产物可以通过亲和层析进行特异性简单纯化。行特异性简单纯化。B.外源基因应装在受体蛋白编码基因的外源基因应装在受体蛋白编码基因的下游，为融合蛋白提供终止密码子。在下游，为融合蛋白提供终止密码子。在某些情况下，并不需要完整的受体

42、结构某些情况下，并不需要完整的受体结构基因，目的是尽可能避免融合蛋白分子基因，目的是尽可能避免融合蛋白分子中两种组份的分子量过于接近，为目的中两种组份的分子量过于接近，为目的蛋白分离回收创造条件蛋白分离回收创造条件C.两个结构基因拼接位点处的序列设计两个结构基因拼接位点处的序列设计十分重要，它直接决定着融合蛋白的十分重要，它直接决定着融合蛋白的裂解工艺。裂解工艺。D.两个蛋白编码序列应保持一致的翻译两个蛋白编码序列应保持一致的翻译阅读框架阅读框架融合型目的蛋白表达系统的构建融合型目的蛋白表达系统的构建用于融合蛋白构建的受体蛋白：用于融合蛋白构建的受体蛋白：a.a.谷胱甘肽转移酶（谷胱甘肽转移酶

43、（GSTGST）：维持良好空间构象）：维持良好空间构象b.b.麦芽糖结合蛋白（麦芽糖结合蛋白（MBPMBP）：促进分泌）：促进分泌c.c.金黄色葡萄球菌蛋白金黄色葡萄球菌蛋白A A（SAPASAPA）：免疫亲和层析）：免疫亲和层析 d.d.硫氧化还原蛋白（硫氧化还原蛋白（TrxATrxA）：维持良好空间构象）：维持良好空间构象e.e.外膜蛋白（外膜蛋白（OmpFOmpF）：促进分泌）：促进分泌f.f.-半乳糖苷酶（半乳糖苷酶（LacZLacZ）：免疫亲和层析）：免疫亲和层析g.g.泛素蛋白（泛素蛋白（UbiUbi）：维持良好空间构象）：维持良好空间构象3.目的蛋白的回收目的蛋白的回收融合蛋白中

44、受体蛋白部分的存在可能会影响融合蛋白中受体蛋白部分的存在可能会影响目的蛋白的空间构象和生物活性，如果将之目的蛋白的空间构象和生物活性，如果将之注入人体还会导致免疫反应，因此在制备和注入人体还会导致免疫反应，因此在制备和生产药用目的蛋白时，将融合蛋白中的受体生产药用目的蛋白时，将融合蛋白中的受体蛋白部分完整除去是必不可少的工序。融合蛋白部分完整除去是必不可少的工序。融合蛋白的位点专一性断裂方法有两种：蛋白的位点专一性断裂方法有两种：化学断裂法化学断裂法酶促裂解法酶促裂解法 化学断裂法：化学断裂法：用于蛋白位点专一性化学断裂的最佳试剂为用于蛋白位点专一性化学断裂的最佳试剂为溴化氰（溴化氰（CNBr

45、CNBr）它与多肽链中的甲硫氨酸残）它与多肽链中的甲硫氨酸残基侧链的硫醚基反应，生成溴化亚氨内酯，基侧链的硫醚基反应，生成溴化亚氨内酯，后者不稳定，在水的作用下肽键断裂，形成后者不稳定，在水的作用下肽键断裂，形成两个多肽降解片段其中上游肽段的甲硫氨酸两个多肽降解片段其中上游肽段的甲硫氨酸残基转化为高丝氨酸残基，而下游肽段残基转化为高丝氨酸残基，而下游肽段N N端端的第一位氨基酸残基保持不变。的第一位氨基酸残基保持不变。这一方法的优点是回收率高（可达到这一方法的优点是回收率高（可达到85%85%以上），专一性强，而且所产生以上），专一性强，而且所产生的目的蛋白的的目的蛋白的N N端不含甲硫氨酸，

46、与端不含甲硫氨酸，与真核生物细胞中的成熟表达产物较为真核生物细胞中的成熟表达产物较为接近。然而，如果异源蛋白分子内部接近。然而，如果异源蛋白分子内部含有甲硫氨酸残基，则不能用此方法。含有甲硫氨酸残基，则不能用此方法。酶促裂解法：单残基位点酶促裂解法：单残基位点蛋白酶酶促裂解法的特点是断裂效率蛋白酶酶促裂解法的特点是断裂效率更高，同时每种蛋白酶均具有相应的更高，同时每种蛋白酶均具有相应的断裂位点决定簇，因此可供选择的专断裂位点决定簇，因此可供选择的专一性断裂位点范围较广。一性断裂位点范围较广。受体蛋白受体蛋白目的蛋白目的蛋白NArg CNC几种断裂位点专一性最强的商品化蛋白酶分别几种断裂位点专一

47、性最强的商品化蛋白酶分别在多肽链中的精氨酸、谷氨酸、赖氨酸残基处在多肽链中的精氨酸、谷氨酸、赖氨酸残基处切开酰胺键，形成不含上述残基的下游断裂肽切开酰胺键，形成不含上述残基的下游断裂肽段，与溴化氰化学断裂法相似。用上述蛋白酶段，与溴化氰化学断裂法相似。用上述蛋白酶裂解融合蛋白的前提条件是外源蛋白分子内部裂解融合蛋白的前提条件是外源蛋白分子内部不能含有精氨酸、谷氨酸或赖氨酸残基，如果不能含有精氨酸、谷氨酸或赖氨酸残基，如果外源基因表达产物为小分子多肽，这一限制条外源基因表达产物为小分子多肽，这一限制条件并不苛刻，但大分子量的异源蛋白来说，上件并不苛刻，但大分子量的异源蛋白来说，上述三种氨基酸残基

48、的出现频率是相当高的。述三种氨基酸残基的出现频率是相当高的。蛋白内切酶蛋白内切酶 切割位点切割位点梭菌蛋白酶梭菌蛋白酶 Arg-CArg-C葡萄球菌蛋白酶葡萄球菌蛋白酶 Glu-CGlu-C假单孢菌蛋白酶假单孢菌蛋白酶 Lys-CLys-C猪胰蛋白酶猪胰蛋白酶 Arg-C/Lys-CArg-C/Lys-C酶促裂解法：多残基位点酶促裂解法：多残基位点为了克服仅切单一氨基酸残基的蛋白酶所带来的应用局限为了克服仅切单一氨基酸残基的蛋白酶所带来的应用局限性，可在受体蛋白编码序列与不含起始密码子的外源基因性，可在受体蛋白编码序列与不含起始密码子的外源基因之间加装一段编码寡肽序列（之间加装一段编码寡肽序列

49、（Ile-Glu-Gly-ArgIle-Glu-Gly-Arg）的人工）的人工接头片段，该寡肽为具有蛋白酶活性的接头片段，该寡肽为具有蛋白酶活性的凝血因子凝血因子XaXa的识别的识别和作用序列，其断裂位点在和作用序列，其断裂位点在ArgArg的的C C末端。纯化后的融合蛋末端。纯化后的融合蛋白用白用XaXa处理，即可获得不含上述寡肽序列的目的蛋白。由处理，即可获得不含上述寡肽序列的目的蛋白。由于于XaXa的识别作用序列由四个氨基酸残基组成，大多数蛋白的识别作用序列由四个氨基酸残基组成，大多数蛋白质中出现这种寡肽序列的概率极少，因此这种方法可广泛质中出现这种寡肽序列的概率极少，因此这种方法可广泛

50、用于从融合蛋白中回收各种不同大小的目的蛋白产物。用于从融合蛋白中回收各种不同大小的目的蛋白产物。四四寡聚型异源蛋白的表达寡聚型异源蛋白的表达从理论上讲，外源基因的表达水平与受体细胞中可转录基因从理论上讲，外源基因的表达水平与受体细胞中可转录基因的拷贝数（即基因剂量）呈正相关。然而重组质粒除了含有的拷贝数（即基因剂量）呈正相关。然而重组质粒除了含有外源基因外，还携带其它的可转录基因，如作为筛选标记的外源基因外，还携带其它的可转录基因，如作为筛选标记的抗生素抗性基因等。随着重组质粒拷贝数的不断增加，受体抗生素抗性基因等。随着重组质粒拷贝数的不断增加，受体细胞内的大部分能量和原料被用于合成所有的重组